金針菇JA/SA信號通路基因鑒定及其對外源JA/SA應答

李　肖，汪健芳 ，嚴俊杰，陳炳智，謝　斌，陳仁良，溫志強，江玉姬，謝寶貴*

(1.福建農(nóng)林大學生命科學學院菌物研究中心，福建　福州　350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建　福州　350002)

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金針菇JA/SA信號通路基因鑒定及其對外源JA/SA應答

李肖1，汪健芳1，嚴俊杰1，陳炳智2，謝斌1，陳仁良1，溫志強1，江玉姬2，謝寶貴1*

(1.福建農(nóng)林大學生命科學學院菌物研究中心，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002)

本研究鑒定了金針菇茉莉酸(JA)信號通路的4個關(guān)鍵基因：COI1、PDF1.2、MYC2-1、MYC2-2與水楊酸(SA)信號通路的4個關(guān)鍵基因：PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2。NBT染色法和熒光定量結(jié)果表明，金針菇JA/SA信號通路可應答外源JA/SA，50 μmol · L-1外源JA 和500 μmol · L-1外源SA處理金針菇菌絲12 h可顯著提高JA/SA信號通路基因的轉(zhuǎn)錄水平，基因PDF1.2響應JA誘導最明顯，可作為JA信號通路標記基因；JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑間存在協(xié)同或拮抗作用：SA信號轉(zhuǎn)導通路中NPR1蛋白對JA信號轉(zhuǎn)導通路中PDF1.2基因表達有抑制作用，外源JA/SA的相對濃度決定其作用的強弱。

金針菇; 茉莉酸; 水楊酸; NBT; 基因表達

茉莉酸(jasmonic acid，JA)和水楊酸(salicylic acid，SA)在植物中研究較為廣泛，兩者在植物防御信號傳導中起重要作用[1]。但JA和SA在真菌中研究較少，主要在球二孢屬Botryodiplodia和赤霉菌屬Gibberella中有見報道[2-7]。真菌中有關(guān) JA 信號轉(zhuǎn)導途徑研究報道較多的是關(guān)于致病真菌和腐生真菌以及與植物共生的外生菌根真菌，其會通過產(chǎn)生某種特異性蛋白抑制植物 JA 及 SA 的合成，從而降低植物的防御體系以達到侵染致病或共生的目的[7]。但關(guān)于大型真菌中JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑卻鮮有報道。

金針菇Flammulinavelutipes(Curtis)Singer具有較高食藥用價值，是目前被廣泛人工栽培的食用菌之一。金針菇異核菌絲經(jīng)一個階段生長發(fā)育后，受到外界環(huán)境的脅迫：溫度、水分和濕度、空氣、光線等，菌絲扭結(jié)形成原基，進而發(fā)育形成子實體[8]。金針菇是否存在JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑，金針菇是否會響應外源JA和SA的脅迫，外源添加JA和SA對金針菇子實體的發(fā)育是否會產(chǎn)生影響，目前未知。

本研究以金針菇為試驗材料，在金針菇L11基因組和H1123轉(zhuǎn)錄組序列測定以及基因注釋基礎上[9]，獲取金針菇JA/SA信號轉(zhuǎn)導通路中關(guān)鍵基因，初步探究這些基因在外源添加JA/SA誘導下的表達模式，并構(gòu)建JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑，為進一步探究金針菇中JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑對外源信號的響應以及通路間的相互作用關(guān)系提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試雙核體菌株H1123由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。金針菇菌株L11參考基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別下載自：DDBJ/EMBL/GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫，登錄號為APIA00000000 (BioProject: 191865) 和SRP072148。

1.2JA/SA信號通路途徑構(gòu)建及基因分析

以金針菇L11基因組數(shù)據(jù)為基礎，利用本地BLASTP程序(E-value ≤ 5e-10)將擬南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄(Grapevine)的JA和SA信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)蛋白氨基酸序列，與金針菇L11基因組預測的蛋白序列進行同源比對，尋找金針菇基因組中的JA和SA信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)基因。參照劉朋虎等[10]的方法，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)map到參考序列，確定基因的轉(zhuǎn)錄起始及終止位點，并采用ZOOM lite(1.5.4)軟件通過雙末端方法和錯配匹配(錯配為40)，對基因的內(nèi)含子和外顯子位置及數(shù)目進行分析。

采用NCBI數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information)中的Protain Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp和PAGE_TYPE=BlastSearch和LINK_LOC=blasthome)對信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)基因編碼的蛋白氨基酸序列進行同源比對再次驗證。

1.3JA和SA處理

JA和SA分別處理：將PDA平板上新鮮的H1123菌種打孔，等量接種至新的150 mL PDA液體培養(yǎng)基，然后置于25℃、190 r·min-1搖床恒溫培養(yǎng) 7 d后，分別添加不同體積的10 mmol·L-1JA和SA使其終濃度分別為JA(10、50、100、250 和500 μmol·L-1)和SA(10、100、250、500 和1 000 μmol·L-1)[11]，在25℃條件下處理菌絲6 h后，選取等大的菌絲球用5 g·L-1的氮藍四唑(nitro blue tetrazolium，NBT)染色：每個處理添加10 mL染液，25℃處理40 min后拍照。另取同批次同處理的液體培養(yǎng)基收集菌絲，將菌絲置于液氮中凍存待用(下同)。JA和SA溶液含0.01%吐溫20和9 ‰無水乙醇，NBT染液濃度為5 g·L-1，所用溶劑為 pH 6.0 的PBS緩沖溶液(下同)。用Tween 20、乙醇和水混合液處理作為對照。

篩選最佳處理濃度CJA、CSA后，用最佳濃度CJA和CSA分別處理金針菇菌絲0.5、1、3、6、12和24 h后，進行NBT染色觀察，另取同批次、同處理的液體培養(yǎng)基收集菌絲，將菌絲置于液氮中凍存待用，篩選最佳處理時間TJA和TSA。

SA和JA交叉處理：用最佳濃度為CSA的SA處理金針菇菌絲最佳時間TSA后，添加終濃度為0、10、50、100、250和500 μmol · L-1JA處理金針菇菌絲TJA；用最佳濃度為CJA的JA處理金針菇菌絲最佳時間TJA后，添加終濃度為0、10、250、500 和1 000 μmol · L-1SA處理金針菇菌絲TSA。收集各處理的菌絲置于液氮中凍存待用。

1.4熒光定量PCR檢測基因的相對表達量

總RNA的提取和cDNA合成：收集菌絲后，采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit(R6827-01)試劑盒(Omega Bio-Tek, 美國)分別提取以上材料總RNA，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Sythesis SuperMix for qPCR試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)合成cDNA。采用Primer Premier 5.0 設計RT-qPCR引物，以GAPDH基因(F: CCT CTG CTC ACT TGA AGG GT；R: GCG TTG GAG ATG ACT TTG AA)作為內(nèi)參基因檢測相對表達量[12]。引物(表1)由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-qPCR 反應體系使用TransStart TOP Green qPCR試劑(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)，程序按照試劑盒的使用說明書操作(兩步法)，退火溫度設置為60℃，循環(huán)數(shù)設置為40，每個反應進行3個平行試驗。相對表達量計算采用2-△△Ct法處理。

2　結(jié)果與分析

2.1金針菇JA/SA信號途徑構(gòu)建及基因分析

以金針菇菌株L11的基因組數(shù)據(jù)為基礎，根據(jù)本地BLASTP比對結(jié)果可知，在金針菇L11基因組中存在4個JA信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)蛋白，分別是1個COI1，2個MYC2，1 PDF1.2；4個SA信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)蛋白分別是2個PR1、2個NPR1，將上述各基因的蛋白氨基酸序列采用NCBI網(wǎng)站在線BLASTP進行同源比對再次驗證，比對結(jié)果顯示：E值介于1.00E-77～4.00E-45，相似性介于34～56，比對分值介于24～438，由于個別蛋白與植物相應蛋白親緣關(guān)系較遠，分值較低。但信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)基因的蛋白都含有其標志性功能結(jié)構(gòu)域，這表明金針菇JA/SA信號途徑中相關(guān)蛋白與植物中相應蛋白可能具有相似的功能特點(表1)。上述基因已提交至GenBank(表1)。

表1　金針菇JA/SA信號通路關(guān)鍵基因分析

2.2不同濃度JA/SA誘導下基因的表達模式

JA/SA均可誘導真菌產(chǎn)生一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括： O2-、H2O2及HO2-、-OH 等[13-14]，可利用染色法鑒定ROS的生成量[15-17]。JA/SA處理后，對金針菇菌絲進行NBT染色。結(jié)果顯示，菌絲球會被染色為淺紫色，且在JA濃度為50 μmol·L-1、SA濃度為500 μmol·L-1紫色最深，即此時菌絲中產(chǎn)生的氧負離子的量最多，受到JA/SA的脅迫最明顯。

不同濃度JA/SA處理后，各基因相對表達量均呈上調(diào)表達趨勢(圖2-A、B)。 JA濃度為50 μmol·L-1時，COI1、PDF1.2和MYC2-1、MYC2-2相對表達量達到最高水平，并且MYC2-1和MYC2-2表達量模式完全一致，此4個基因都響應低濃度外源JA的誘導。PDF1.2在最低濃度JA處理時，就受到明顯脅迫，且相對表達量變化趨勢較大，此外高濃度JA有可能對JA信號通路產(chǎn)生抑制作用(圖2-A)。SA濃度為500 μmol·L-1時，PR1-1、PR1-2、NPR1-1和NPR1-2的表達量達到最高，且基因表達模式基本一致，說明此4個基因皆響應外源SA的脅迫(圖2-B)。以上定量結(jié)果與NBT染色結(jié)果一致(圖1-A)。

2.3不同時間JA/SA誘導下基因的表達模式

金針菇菌絲分別經(jīng)JA(50 μmol·L-1)和SA(500 μmol·L-1)處理后，不同時間點的NBT檢測結(jié)果顯示，JA和SA處理金針菇菌絲12 h，菌絲球染至紫色最深(圖1-B)，即此時菌絲中產(chǎn)生氧負離子的量最多，說明JA/SA對菌絲處理12 h的效果最好，對JA、SA信號轉(zhuǎn)導通路脅迫最明顯。

50 μmol·L-1JA處理金針菇菌絲后，隨處理時間延長，COI1、PDF1.2和MYC2-1、MYC2-2相對表達水平呈先降低后增加再降低的表達模式，在12 h各基因相對表達量達到最高水平，之后逐漸降低(圖2C)。且在500 μmol·L-1SA處理后，隨時間的增加，PR1-1、PR1-2、NPR1-1和NPR1-2在12 h相對表達量最高，之后降低，與JA的最佳處理時間一致(圖2D)。以上定量結(jié)果與NBT染色結(jié)果一致(圖1-B)。

2.4JA/SA處理對信號轉(zhuǎn)導途徑的交互影響

在JA處理后，隨添加SA濃度的升高，PDF1.2表達出現(xiàn)低濃度促進，高濃度抑制，且在SA 濃度為500 μmol·L-1時，SA對PDF1.2抑制作用最明顯，高達10倍，而此時NPR1-1和NPR1-2受到的抑制作用最小，且有上調(diào)的趨勢(圖3-A)。添加SA后再添加不同濃度JA，PDF1.2表達出現(xiàn)了相同的變化趨勢，但其影響小于前一種處理(圖3-B)。說明金針菇中JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑中也存在擬南芥類似的協(xié)同或拮抗作用，并且體現(xiàn)在SA信號轉(zhuǎn)導通路中NPR1蛋白對JA信號轉(zhuǎn)導通路中PDF1.2基因表達的抑制，且這種作用關(guān)系會受到兩者相對濃度變化的影響。說明在金針菇的防衛(wèi)體系中，激素濃度對于其最終的調(diào)控結(jié)果是很關(guān)鍵的。

3　討　論

用擬南芥中JA/SA信號通路基因?qū)疳樄交蚪M進行同源比對，共鑒定到JA/SA信號通路各4個基因且都響應外源JA/SA的誘導，說明金針菇也存在植物中常見的抗病防衛(wèi)體系，包括JA和SA信號傳導途徑。有研究顯示，當植物受到外界脅迫時，MYC2等轉(zhuǎn)錄因子被大量釋放，MYC2以COI1依賴的方式正向調(diào)節(jié)受傷或JA激活的基因PDF1.2的表達，從而啟動相應JA抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[11,18-19]。本研究以金針菇為試驗材料，外源施加JA，JA信號傳導途徑中相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導因子會受到激活作用，COI1、PDF1.2、MYC2-1和MYC2-2的基因一直超量表達，且COI1、MYC2-1和MYC2-2表達量變化趨勢較小，PDF1.2則有較大的變化，由此可以推測，金針菇中存在JA信號轉(zhuǎn)導途徑，在外源添加JA可模擬菌絲響應外界脅迫，COI1、MYC2-1和MYC2-2調(diào)控了下游PDF1.2基因的表達，但MYC2、COI1以及PDF1.2之間具體的分子作用機理仍需進一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)，NPR1作用于SA的下游，可與TGA類轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這類轉(zhuǎn)錄因子可與PR類防御蛋白編碼基因啟動子中的SA應答原件結(jié)合，從而調(diào)控PR類防御蛋白編碼基因的表達，而病程相關(guān)的蛋白PR基因的變動能夠特異的誘導植物產(chǎn)生SAR，從而啟動植物的廣譜抗病[20]。外源添加SA，可不同程度誘導金針菇PR1-1、PR1-2、NPR1-1和NPR1-2上調(diào)表達，且NPR1-1和NPR1-2微小的變化及會引起PR1-1、PR1-2較大幅度的改變，由此可以進一步說明，基因NPR1-1和NPR1-2會響應外源SA的激活作用，啟動SA信號轉(zhuǎn)導途徑，進一步誘導PR1-1、PR1-2表達量的提高。以上的結(jié)果表明外源JA、SA可能分別啟動了金針菇JA、SA信號轉(zhuǎn)導途徑中的應答基因，并進行大量轉(zhuǎn)錄，且基因的轉(zhuǎn)錄水平均會受到JA/SA處理濃度和處理時間的影響，這與王文艷等的研究結(jié)果一致[11]。

研究結(jié)果顯示：金針菇JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑中也存在與擬南芥類似的拮抗或協(xié)同作用，它們之間的相對濃度決定著這種相互關(guān)系的強弱，其拮抗作用的響應基因為PDF1.2。根據(jù)本研究的試驗結(jié)果，參照擬南芥等植物的JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑[21-23]，筆者初步構(gòu)建了金針菇JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑(圖3)，金針菇受到外源JA誘導時，會激活下游COI1和MYC2基因的表達，從而激活下游植物防御蛋白基因PDF1.2的表達，響應外界的JA脅迫；金針菇受到SA誘導時，會激活下游基因NPR1的表達，從而進一步誘導病程相關(guān)蛋白PR1的表達，以應對外界的SA脅迫。而金針菇JA/SA信號轉(zhuǎn)導途徑以及SA對JA信號通路的拮抗或協(xié)同作用的分子機制則需要進一步的研究。

金針菇目前已被菇農(nóng)及工廠廣泛栽培，搔菌是栽培技術(shù)要點之一。該過程的實質(zhì)是對金針菇的表面菌絲進行傷害，促進金針菇響應外界傷害，從而激活下游的信號分子，促使金針菇原基形成、子實體生長整齊[24-27]。在擬南芥中JA是傷害反應(機械損傷)的信號分子，可響應機械脅迫；我們進一步試驗還表明JA處理金針菇栽培料生長菌絲后，能促進原基的形成，且子實體生長較整齊(數(shù)據(jù)未公布)，說明JA對金針菇的脅迫作用類似搔菌(機械損傷)的作用。后期我們將繼續(xù)深入研究JA對金針菇出菇的影響，以期進一步探究金針菇出菇的分子機理。

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(責任編輯：柯文輝)

Identification of Genes in JA/SA Signaling Pathways inFlammulinavelutipesand Their Response to Exogenous JA/SA

LI Xiao1，WANG Jian-Fang1，YAN Jun-Jie1，CHEN Bing-Zhi2，XIE Bin1，CHEN Ren-Liang1，WEN Zhi-Qiang1，JIANG Yu-Ji1，XIE Bao-Gui1*

(1.MycologicalResearchCenter,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China；2.CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

In this study, we identified 4 key genes of JA signaling pathway (COI1、PDF1.2、MYC2-1、MYC2-2) and SA signaling pathway (PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2) inFlammulinavelutipes, respectively. The results of NBT staining and RT-qPCR demonstrated that JA/SA signaling pathways ofF.velutipesresponsed to exogenous JA/SA. In addition, the expression levels of these genes of JA/SA signaling pathway significantly increased under the treatment of exogenous 50 μmol · L-1JA and 500 μmol · L-1SA for 12 h， respectively. It was worth noting thatPDF1.2 could be considered as the marker gene of JA signaling pathways for its response to exogenous JA obviously. The antagonistic effect between JA and SA signaling pathways may also exist inF.velutipesand the protein NPR1 of SA signaling pathways had inhibitory effect on the genePDF1.2 expression level of JA signaling pathways which could be affected by the relative concentration of exogenous JA/SA.

Flammulinavelutipes; jasmonic acid; salicylic acid; NBT; gene expression

2016-05-20初稿；2016-07-03修改稿

李肖(1990- )，女，在讀碩士研究生，主要從事食用菌分子生物學研究(E-mail:2916025601@qq.com)

謝寶貴(1962-)，男，教授，主要從事食用菌遺傳育種研究(E-mail:mrcfafu@163.com)

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973 項目) (2014CB138302)

Q 785

A

1008-0384(2016)07-677-06

李肖，汪健芳，嚴俊杰，等.金針菇JA/SA信號通路基因鑒定及其對外源JA/SA應答[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31(7)：677-682.

LI X，WANG J-F，YAN J-J，et al.Identification of Genes in JA/SA Signaling Pathways inFlammulinavelutipesand Their Response to Exogenous JA/SA[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：677-682.