應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化普通小球藻的絮凝工藝

馬志欣，胡小麗，成　婕，高　坤，鄧祥元

(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇　鎮(zhèn)江　212018)

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應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化普通小球藻的絮凝工藝

馬志欣，胡小麗，成婕，高坤，鄧祥元*

(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212018)

以聚合氯化鋁(Poly aluminium chloride, PAC)為絮凝劑，利用響應(yīng)面法對(duì)普通小球藻Chlorellavulgaris的絮凝工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明：影響C.vulgaris絮凝效率的主次因素順序?yàn)樾跄龝r(shí)間>C.vulgaris初始OD值>PAC濃度；C.vulgaris的最佳絮凝工藝為：PAC濃度為57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時(shí)間為18 min。在此絮凝條件下，C.vulgaris的絮凝效率為95.82%。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究C.vulgaris的絮凝采收工藝提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。

普通小球藻；聚合氯化鋁；絮凝工藝；響應(yīng)面法

普通小球藻Chlorellavulgaris，C.vulgaris是一種球形單細(xì)胞藻類，具有光合效率高，生長(zhǎng)速度快，種類繁多，分布廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富，適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-2]，在光合自養(yǎng)條件下，C.vulgaris還具有高效的CO2固定轉(zhuǎn)化能力，其對(duì)CO2的轉(zhuǎn)化效率是陸地高等植物的10～50倍[3-4]。目前，C.vulgaris因富含多糖、蛋白質(zhì)、色素、脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，并可人工條件下大規(guī)模培養(yǎng)，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和生物能源等領(lǐng)域[5-7]。雖然C.vulgaris具有良好的應(yīng)用前景，但是其產(chǎn)業(yè)化程度仍不高，其中最主要的原因之一就是其采收成本過高，據(jù)估算，其采收成本約占整個(gè)生產(chǎn)成本的20%～30%[8]。C.vulgaris之所以采收困難，是因?yàn)槠鋫€(gè)體微小，培養(yǎng)濃度低，可以形成穩(wěn)定的分散體系。因此，尋找一種高效率、低成本、應(yīng)用廣的采收方法是C.vulgaris產(chǎn)業(yè)化的必由之路。目前，用于微藻采收的方法主要有沉降法、離心法、過濾法和絮凝法。沉降法是依靠重力作用進(jìn)行采收的方法，因其采收效率較低，常與絮凝法結(jié)合使用；離心法是借助離心力作用進(jìn)行采收的方法，其效率較高，但能耗大、成本高[9]；過濾法是利用過濾介質(zhì)實(shí)現(xiàn)采收的方法，該法在實(shí)際生產(chǎn)過程中常出現(xiàn)濾膜堵塞和污染等問題；絮凝法是通過添加絮凝劑進(jìn)行采收的方法，其機(jī)理是通過電中和、架橋或/和網(wǎng)捕作用，使分散的帶電荷藻細(xì)胞聚集到一起，以達(dá)到采收的目的，具有采收效率高、成本低，且既可單獨(dú)使用，又可與沉降法、離心法和過濾法聯(lián)合使用等優(yōu)點(diǎn)，其中無機(jī)絮凝法是應(yīng)用最為廣泛的采收方法。丁進(jìn)鋒等[10]進(jìn)行了聚合氯化鋁(Poly aluminium chloride, PAC)絮凝小球藻的動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)PAC絮凝小球藻時(shí)不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，但可用二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，絮凝效率高達(dá)98.6%，表明PAC絮凝小球藻前景廣闊。本試驗(yàn)對(duì)PAC絮凝C.vulgaris的影響因素進(jìn)行了探究，并且利用響應(yīng)面法對(duì)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以探索最優(yōu)絮凝工藝，降低C.vulgaris采收成本，為利用PAC絮凝C.vulgaris的采收工藝提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，加速C.vulgaris的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

普通小球藻Chlorellavulgaris購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫(kù)(淡水藻種庫(kù))，在無菌條件下，將藻種轉(zhuǎn)接到BG-11培養(yǎng)基[11]中，并利用本試驗(yàn)研制的微藻通氣培養(yǎng)裝置進(jìn)行高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光強(qiáng)3 000 lx，光周期為12 h L∶12 h D；通氣速率為1 vvm (L air/Lculture/min)。

聚合氯化鋁(PAC)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，其他試劑，如NaOH、HCl等為上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

本試驗(yàn)所用儀器有UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，光照培養(yǎng)架，微藻通氣培養(yǎng)裝置(本實(shí)驗(yàn)室研制)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1小球藻生物量的測(cè)定測(cè)定小球藻藻液在680 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，用以間接表示小球藻生物量[12]。

1.2.2絮凝效率的測(cè)定在50 mLC.vulgaris培養(yǎng)液中加入一定濃度的PAC，一定時(shí)間后，在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值，根據(jù)所得OD值，計(jì)算C.vulgaris的絮凝效率。計(jì)算公式為絮凝效率=(OD0-ODt)/OD0×100%[13]，其中，OD0表示C.vulgaris初始OD值，ODt表示絮凝時(shí)間為t時(shí)C.vulgaris的OD值。

1.2.3單因素試驗(yàn)當(dāng)絮凝時(shí)間為15 min、初始OD680為0.95時(shí)，設(shè)定PAC質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70和80 mg·L-1；當(dāng)絮凝時(shí)間為15 min、PAC質(zhì)量濃度為60 mg·L-1時(shí)，設(shè)定C.vulgaris初始OD值為0.1、0.5、1、1.5、2、2.5和3；當(dāng)初始OD680為1.97、PAC質(zhì)量濃度為60 mg·L-1時(shí)，設(shè)定絮凝時(shí)間為0、5、10、15、20、25和30 min；通過單因素試驗(yàn)研究其對(duì)C.vulgaris絮凝效率的影響。

1.2.4響應(yīng)面分析試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響PAC絮凝C.vulgaris的3個(gè)工藝參數(shù)，即PAC濃度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝時(shí)間(X3)，并以-1、0、+1代表其水平(表1)。

采用Design Expert 8.0.5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得各因素一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，并對(duì)PAC絮凝C.vulgaris的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1PAC絮凝C.vulgaris工藝的Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

Table 1Factors and levels for Box-Behnken experimental design on PAC flocculation ofC.vulgaris

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

首先研究PAC質(zhì)量濃度、C.vulgaris初始OD值及絮凝時(shí)間對(duì)C.vulgaris絮凝效率的影響，結(jié)果如圖1、2、3所示。由圖1可知，隨著絮凝劑PAC濃度的增加，C.vulgaris的絮凝效率逐漸遞增，這是由于帶正電荷的PAC不斷中和微藻細(xì)胞表面所帶的負(fù)電荷，減少了細(xì)胞間的靜電排斥作用，使其絮凝[14]。此外，PAC的網(wǎng)捕沉淀作用和吸附架橋作用也進(jìn)一步促進(jìn)微藻的絮凝沉降[15]。當(dāng)PAC質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg·L-1以后，絮凝效率基本不變。因此，考慮到生產(chǎn)成本以及下游處理的簡(jiǎn)便性，在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)，選擇50、60和70 mg·L-1作為優(yōu)化PAC質(zhì)量濃度的3個(gè)水平。由圖2可知，隨著C.vulgaris初始OD值的增大，其絮凝效率不斷上升，但當(dāng)初始OD值大于1.5時(shí)，其絮凝效率基本穩(wěn)定。此外，研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)C.vulgaris的初始OD值處于低水平時(shí)，其絮凝效率極低，這可能是由于絮凝劑在藻細(xì)胞碰撞成團(tuán)的過程中作用減弱；也可能是由于藻細(xì)胞所帶電荷不足以中和絮凝劑所帶電荷，因而產(chǎn)生了排斥作用，這與曲孟等人[13]的觀點(diǎn)一致。因此在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)C.vulgaris初始OD值選擇1.5、2和2.5三個(gè)水平。由圖3可知，前15 min絮凝效率隨絮凝時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，可達(dá)到75%左右，15 min以后絮凝效率的增長(zhǎng)變得緩慢。理論上來說，隨著絮凝時(shí)間的增加，C.vulgaris細(xì)胞和PAC之間的接觸越來越充分，絮凝效率會(huì)更高，但過長(zhǎng)時(shí)間的絮凝可能會(huì)導(dǎo)致C.vulgaris細(xì)胞活性的改變，增加下游處理難度[13,16]。此外，考慮到采收周期成本，在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)，絮凝時(shí)間選擇10、15、20 min 3個(gè)水平。

2.2響應(yīng)面分析

2.2.1Box-Behnken中心組合優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用3因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化PAC絮凝C.vulgaris的工藝參數(shù)，結(jié)果見表2。此次Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，其余5個(gè)為中心試驗(yàn)。析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差[17]。

表2PAC絮凝普通小球藻(Chlorellavulgaris)工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Table 2Design and results of response surface experiment on PAC flocculation ofC.vulgaris

2.2.2回歸方程的建立與檢驗(yàn)利用Design Expert 8.0.5.0分析軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到C.vulgaris絮凝效率對(duì)PAC質(zhì)量濃度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝時(shí)間(X3)3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

表3PAC絮凝C.vulgaris工藝條件優(yōu)化的回歸方程的方差分析及其系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

Table 3Variance analysis and significance test on regression equation of response surface experiment for optimizing PAC flocculatingC.vulgaris

注: * 表示有顯著性差異(P<0. 05)；** 表示有極顯著性差異(P<0. 01)。

2.2.3C.vulgaris絮凝因素間的交互作用分析用Design Expert 8.0.5.0軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到響應(yīng)面圖4～6。圖4顯示當(dāng)PAC質(zhì)量濃度為60 mg·L-1時(shí)，絮凝時(shí)間與C.vulgaris初始OD值間的交互作用對(duì)C.vulgaris絮凝效率的影響，這2個(gè)因素的交互作用不顯著，隨著絮凝時(shí)間和C.vulgaris初始OD值的增加，絮凝效率先逐漸上升，然后略有下降，表明適當(dāng)?shù)脑黾有跄龝r(shí)間和C.vulgaris初始OD值可有效提高C.vulgaris的絮凝效率。圖5表明當(dāng)C.vulgaris初始OD值為2時(shí)，PAC質(zhì)量濃度和絮凝時(shí)間對(duì)C.vulgaris絮凝效率的交互作用不顯著，當(dāng)PAC質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨絮凝時(shí)間的增加，C.vulgaris絮凝效率緩慢上升；而當(dāng)絮凝時(shí)間一定時(shí)，隨PAC質(zhì)量濃度的增加絮凝效率先逐漸上升，然后緩慢下降。同時(shí)可以看出當(dāng)PAC質(zhì)量濃度為中水平，絮凝時(shí)間為高水平時(shí)，C.vulgaris的絮凝效率處于高水平。圖6顯示當(dāng)絮凝時(shí)間為15 min時(shí)，PAC質(zhì)量濃度和C.vulgaris初始OD值的交互作用極顯著，且在二者均處于中水平時(shí)，C.vulgaris絮凝效率最高。

2.2.4最佳工藝條件確定根據(jù)Box-Behnken分析模型得知，PAC絮凝C.vulgaris的最佳工藝條件為：PAC質(zhì)量濃度為56.91 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時(shí)間為18.76 min。在此工藝條件下，所得C.vulgaris絮凝效率的理論值為97.51%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得最優(yōu)工藝的可靠性，同時(shí)考慮實(shí)際操作情況，將PAC絮凝C.vulgaris的最佳工藝條件修正為PAC質(zhì)量濃度為57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時(shí)間為18 min，實(shí)際測(cè)得小球藻絮凝效率為95.82%，與理論預(yù)測(cè)值間誤差為1.73%(<5%)。

3　結(jié)　論

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(責(zé)任編輯：黃愛萍)

Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology

MA Zhi-xin, HU Xiao-li, CHENG Jie, GAO Kun, DENG Xiang-yuan*

(CollegeofBiotechnology,JiangsuUniversityofScienceandTechnology,Zhenjiang,Jiangsu212018,China)

Flocculation ofChlorellavulgarisusing Poly aluminum chloride (PAC) was optimized by theresponse surface methodology. The factors that affected the flocculation efficiency were in the order flocculation duration>initial OD value ofC.vulgaris>PAC concentration. The optimized flocculation conditions included a PAC concentration of 57 mg·L-1, an initial OD value ofC.vulgarisof 2.06, and flocculation for 18 min to achieve a maximized efficiency of 95.82%.

Chlorellavulgaris; Poly aluminum chloride; flocculation; response surface methodology

2016-03-20初稿；2016-05-09修改稿

馬志欣(1994-)，男，主要從事微藻生物制品研究(E-mail: 969080860@qq.com)

鄧祥元(1982-)，副教授，博士，主要從事微藻生物學(xué)研究(E-mail：dengxy2009@just.edu.cn)

國(guó)家自然科學(xué)基金(31200381)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011493)

S 216.2

A

1008-0384(2016)07-765-06

馬志欣，胡小麗，成婕，等.應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化普通小球藻的絮凝工藝[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(7)：765-769.

MA Z-X，HU X-L，CHENG J，et al.Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：765-769.