響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取泥鰍多糖工藝的研究

黨曉妍，王　茵，蘇永昌，劉淑集，吳成業(yè)，陳麗嬌

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建　福州　350002；2.福建省水產(chǎn)研究所/福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建　廈門　361013)

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響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取泥鰍多糖工藝的研究

黨曉妍1，王茵2*，蘇永昌2，劉淑集2，吳成業(yè)2，陳麗嬌1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.福建省水產(chǎn)研究所/福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361013)

為優(yōu)化泥鰍多糖的超聲波酶法提取工藝，樣品先在100 W的超聲波儀中超聲20 min，然后在酶法單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、酶解時(shí)間及中性蛋白酶添加量為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)的方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)多糖提取率的影響。利用響應(yīng)面分析方法，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定泥鰍多糖提取工藝的最佳條件：酶解作用溫度50℃、酶解作用時(shí)間 6 h、中性蛋白酶添加量 5%，在此條件下，多糖提取率為 5.37%。

泥鰍；多糖；超聲波酶法；響應(yīng)面

泥鰍，鰍科動(dòng)物，肉、體表黏液或全體均可入藥，具有較高的藥用價(jià)值，被喻為“水中人參”[1-2]。研究表明，泥鰍多糖具有保護(hù)肝損傷、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤、降血糖血脂、免疫調(diào)節(jié)、耐缺氧等多種藥理活性，具有重要的保健功效和藥用價(jià)值[3-4]。欽傳光等采用醇沉法和有機(jī)溶劑萃取法提取泥鰍體表黏液的多糖成分[5]；董陸陸等結(jié)合堿提法和蛋白酶法去除蛋白雜質(zhì)提取泥鰍黏多糖[6]；張宏偉通過(guò)堿液浸泡提取泥鰍黏液、表皮和全身中的水溶性多糖[7]。傳統(tǒng)的多糖提取方法為水提醇沉，操作簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定，但提取效率低、溶劑消耗量大[8]。近年來(lái)，生物酶技術(shù)、超聲技術(shù)在多糖的提取中得到廣泛的應(yīng)用，生物酶的降解作用和超聲波的空化作用有助于破除細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的有效成分充分溶出，在溫和的條件下，既保護(hù)多糖活性不被破壞，又提高提取效率[9-11]。本試驗(yàn)在超聲輔助的基礎(chǔ)上采用生物酶解法提取泥鰍多糖，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化泥鰍多糖的提取工藝，期望為泥鰍的高值化開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

1.1.1材料與試劑新鮮活泥鰍，由霞浦縣金泉泰生物科技有限公司提供；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶(8×105U·g-1)，動(dòng)物蛋白水解酶(1×105U·g-1)，中性蛋白酶(5×104U·g-1)，菠蘿酶(8×105U·g-1)，風(fēng)味酶(1.5×104U·g-1)均為南寧龐博生物工程有限公司。

1.1.2儀器BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV-3200掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；粉碎機(jī)，永康市諾邦富貿(mào)易有限公司；5804/5804 R 離心機(jī)，Eppendorf公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司：SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，國(guó)華電器有限公司；Infinite 200 Pro NanoQuant酶標(biāo)儀，上海安景科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1泥鰍多糖的提取工藝流程圖鮮活泥鰍經(jīng)清洗、切段、低溫干燥、粉碎、制成粉末狀，低溫保存?zhèn)溆?。?0 g凍干泥鰍粉末于250 mL錐形瓶中，加入200 mL蒸餾水，先置于功率100 W的超聲波儀中，超聲20 min。然后再加入適量的生物酶制劑，調(diào)節(jié)酶解溫度，酶解一定時(shí)間，最后高溫滅酶，7 000 r·min-1離心10 min取溶液，檢測(cè)多糖含量，同時(shí)，溶液進(jìn)行真空濃縮，加入乙醇醇沉，靜置過(guò)夜，再離心取沉淀，經(jīng)冷凍干燥獲得泥鰍粗多糖樣品。

超聲輔助蛋白酶法提取泥鰍多糖的工藝路線如下：

新鮮活泥鰍→清洗干凈→干燥→粉碎→水提→超聲處理→生物酶解→高溫滅酶→離心→濃縮→醇沉→靜置過(guò)夜→離心取沉淀→冷凍干燥→粗多糖。

1.2.2多糖含量的測(cè)定硫酸-苯酚法測(cè)多糖含量[12]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將葡萄糖置于105℃烘箱中烘至恒重，取100 mg于100 mL容量瓶中定容，再稀釋10倍，得0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。取0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,加蒸餾水至2 mL,分別加1 mL濃度5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸混勻，放置20 min，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多糖含量檢測(cè)：取1 mL提取液于50 mL容量瓶中定容，再取2 mL定容液,加1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸混勻后，放置20 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品中的多糖提取量。

多糖提取率計(jì)算公式[13]：多糖提取率=(多糖提取量/泥鰍干粉質(zhì)量)×100%。

1.2.3不同酶提取泥鰍多糖的試驗(yàn)分別選取木瓜蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶、中性蛋白酶、菠蘿酶和風(fēng)味酶，經(jīng)超聲工藝處理后，在各蛋白酶的最優(yōu)酶解工藝下進(jìn)行酶解(表1)，選取最優(yōu)的酶再進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1　蛋白酶酶解條件

1.2.4酶法提取泥鰍多糖工藝的單因素試驗(yàn)酶解時(shí)間：在加酶量為3%，溫度為50℃的條件下，設(shè)定酶解時(shí)間分別為：2、4、6、8、10 h；酶解溫度：加酶量為3%，酶解6 h，設(shè)定酶解溫度分別為30、40、50、60、70℃；加酶量：酶解溫度50℃，酶解6 h，設(shè)定加酶量分別為1%、3%、5%、7%、9%。

1.2.5酶法提取泥鰍多糖工藝的響應(yīng)面優(yōu)化采用Box-Behnken Design(BBD)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)酶法提取泥鰍多糖的工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，分別對(duì)酶解時(shí)間，酶解溫度，酶添加量3個(gè)因素，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，以多糖提取率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)曲面分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1不同生物酶的提取對(duì)泥鰍多糖提取率的影響

選用不同的酶提取泥鰍多糖，由圖1可以看出，中性蛋白酶的提取率最高，達(dá)到5.24%，其次為木瓜蛋白酶、菠蘿酶、風(fēng)味酶以及動(dòng)物蛋白水解酶。因此，選擇中性蛋白酶提取泥鰍多糖。

2.2酶法提取泥鰍多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1酶解時(shí)間對(duì)泥鰍多糖的影響泥鰍干粉溶液經(jīng)超聲波輔助浸提后，加入3%的中性蛋白酶，在酶解溫度為50℃的條件下，分別酶解2、4、6、8、10 h，泥鰍多糖提取率如圖2所示。

經(jīng)超聲波輔助浸提后的泥鰍多糖溶液，其多糖提取率為2.79%。再經(jīng)酶解處理，多糖提取率繼續(xù)增加，且隨著酶解時(shí)間的增加，提取率逐漸升高，6 h到達(dá)最大，為4.10%，之后隨著酶解時(shí)間的增加，多糖提取率反而下降。這可能由于在酶的作用下，酶和底物作用充分，多糖提取率增加，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)酶的活性逐漸減弱，所以多糖提取率有所減弱[14]。因此，酶解最適時(shí)間為6 h。

2.2.2酶解溫度對(duì)泥鰍多糖的影響加入3%的中性蛋白酶，在溫度為30、40、50、60、70℃的條件下，酶解6 h，多糖提取率結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著溫度的升高，多糖提取率先增高后下降，50℃時(shí)提取率達(dá)到最高，為4.62%。這是因?yàn)槊富盍εc溫度有著密切的關(guān)系，溫度過(guò)低，酶不能充分發(fā)揮其作用，溫度過(guò)高又會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶的活性受抑制[15-16]。因此，提取泥鰍多糖的最適酶解溫度為50℃。

2.2.3酶添加量對(duì)泥鰍多糖的影響加入1%、3%、5%、7%、9%等不同濃度梯度的中性蛋白酶，在酶解溫度50℃下酶解6 h，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，中性蛋白酶的添加量對(duì)多糖提取率有著顯著影響，當(dāng)中性蛋白酶用量低于5%時(shí)，隨著酶添加量的增加，多糖提取率快速增加，最大為5.34%，此后繼續(xù)加大酶添加量時(shí)，多糖提取率幾乎不變，甚至有所下降。這可能是由于隨著酶添加量的增加，部分多糖可能產(chǎn)生降解作用，從而導(dǎo)致多糖提取率略有降低[17]。因此，確定中性蛋白酶最適用量為5%。

2.3超聲波酶法提取泥鰍多糖的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶添加量(C)為因子，多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

使用Design Expert7.0軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果分析，得到表4回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到預(yù)測(cè)模型如下：y=5.30+5.000E-003A+0.075B+0.79C+0.022AB-7.500E-003AC+0.048BC-0.017A2-0.21B2-1.24C2?；貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，且該模型R2=0.9996,說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于泥鰍多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

由表4可以看出,B、C、B2、C2達(dá)到極顯著水平，BC為顯著水平，即酶解溫度和酶添加量達(dá)到極顯著水平，酶解溫度和酶添加量的交互作用達(dá)到顯著水平，在超聲波酶法提取泥鰍多糖的工藝參數(shù)中，影響多糖提取率的因素排列：C>B>A，即酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4　回歸方程方差分析

2.3.2各因素之間的交互作用酶法提取泥鰍多糖工藝中酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量3個(gè)因素之間交互作用對(duì)提取多糖提取率的影響如圖5所示。

圖5直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值影響，由圖可以看出，存在極值條件應(yīng)該在圓心處。根據(jù)軟件分析，得到泥鰍多糖提取最佳條件為酶解溫度52.31℃，酶解時(shí)間6.47 h，中性蛋白酶添加量為5.64%，在此條件下，多糖提取率的理論值為5.43%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行泥鰍多糖提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為酶解溫度50℃，酶解時(shí)間6 h，中性蛋白酶添加量 5%，3 次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際提取率為 5.37%，與最優(yōu)理論值相近。

3　結(jié)　論

經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，得到超聲波酶法提取泥鰍多糖的最優(yōu)工藝條件為：酶解溫度50℃，酶解時(shí)間6 h，中性蛋白酶添加量 5%，在此條件下，多糖提取率為5.37%。在之前的研究試驗(yàn)中，僅經(jīng)過(guò)超聲波浸提法獲得的泥鰍多糖提取率為2.79%。可見(jiàn)，酶法提取顯著地提高了泥鰍多糖的提取率。該研究方法具有高效、節(jié)能、省時(shí)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，期望研究結(jié)果對(duì)泥鰍多糖的高效開發(fā)利用具有一定的推動(dòng)作用。

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(責(zé)任編輯：柯文輝)

Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction Loach Polysaccharides

DANG Xiao-yan1, WANG Yin2*,SU Yong-chang2, LIU Shu-ji2, WU Cheng-ye2,CHEN Li-jiao1

(1.CollegeofFoodScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002，China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince,FisheriesResearchInstituteofFujian,Xiamen，F(xiàn)ujian361013,China)

In order to optimize the extraction process of polysaccharides loach ultrasonic enzyme samples in 100 W ultrasound first ultrasonic instrument 20 min, and then in the enzymatic test based on a single factor, select the hydrolysis temperature, reaction time and dosage neutral protease from variable polysaccharide extraction rate response, the central composite design, study their interactions on polysaccharide extraction rate. The response surface analysis methods, simulated prediction model quadratic polynomial regression equation and determine the best conditions of the Loach Polysaccharide Extraction Process: enzymatic hydrolysis temperature of 50℃, enzymatic hydrolysis time 6 h, neutral protease amount of 5% in under this condition, the polysaccharide was 5.37%.

loach; polysaccharides; ultrasonic enzymatic; response surface

2016-05-10初稿；2016-06-20修改稿

黨曉妍(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全專業(yè)(E-mail: 358672095@qq.com)

王茵(1983-)，女，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工及生物活性物質(zhì)(E-mail:12687622@qq.com)

福建省農(nóng)業(yè)“五新”工程建設(shè)項(xiàng)目(閩發(fā)改投資[2015]489號(hào))；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目(閩海洋高新[2015]18號(hào))；閩臺(tái)重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫(kù)與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(14PZY017NF17)

R 28

A

1008-0384(2016)07-752-06

黨曉妍，王茵，蘇永昌，等.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取泥鰍多糖工藝的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(7)：752-757.

DANG X-Y，WANG Y，SU Y-C，et al.Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction Loach Polysaccharides[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：752-757.