常用外周血DNA提取方法的比較

張書廣 李秀昌

（山東省聊城市人民醫(yī)院,山東 聊城 252000）

常用外周血DNA提取方法的比較

張書廣 李秀昌

（山東省聊城市人民醫(yī)院,山東 聊城 252000）

目的比較目前常用的外周血DNA提取的三種方法。方法用三種方法提取全血DNA，通過吸光度檢測、PCR擴增分析各自優(yōu)缺點。結(jié)果三種方法提取的DNA純度和作為模板PCR擴增無顯著差別，只是操作時間和成本不同。結(jié)論天根離心柱型試劑盒應(yīng)用比較廣泛，Promega試劑盒操作時間最短，Chelex-100方法最經(jīng)濟，適合微量提取。

全血；基因組DNA；提取方法

基因組DNA作為遺傳物質(zhì)的載體,在人類疾病微觀研究領(lǐng)域方面是常用的研究工具。有些疾病可以通過對DNA的分析進行診斷,其中廣泛使用的就是實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù),其定量性能主要取決于樣本核酸的提取效率、引物的序列以及擴增反應(yīng)的條件[1],為了獲得高質(zhì)量的熒光定量PCR結(jié)果需要高質(zhì)量的DNA模板。然而不同DNA提取方法的提取效能和操作有較大差異,且因?qū)嶒災(zāi)康暮蜅l件的不同,選擇的方法也不盡相同。本次研究選擇了廣泛使用的三種外周血DNA提取方法,包括:promega公司的DNA提取試劑盒、天根公司的離心柱型DNA提取試劑盒以及chelex-100提取方法。實驗選取管家基因GAPDH了進行SYBRGreen熒光PCR分析,比較三種提取方法操作時間、提取效率、擴增Ct值等因素,為片段擴增所選用的試劑盒提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗儀器:熒光定量PCR儀型號eppendorf realplex4,Thermo Nan-odrop 2000c 超微量紫外分光光度計。②實驗試劑:PCR試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司,chelex-100 購自Bio-Rad公司,按5%濃度配制。promega公司的DNA 提取試劑盒、天根公司的離心柱型DNA提取試劑盒購自代理公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。③樣品:外周血由志愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 promega公司試劑盒法與天根離心柱型試劑盒:參照試劑盒內(nèi)提供的說明書嚴(yán)格進行提取。

1.2.2 chelex-100提取方法:取10 μL人外周血加入1.5 mL離心管中,加1 mL滅菌蒸餾水,混勻,冰上放置15 min,破紅細胞13000 rpm離心3 min,去上清,收集白細胞沉淀,移取200 μL 5% Chelex-100溶液（5% Chelex-100為懸濁液,用前充分振搖）加至含白細胞沉淀的離心管中,充分振蕩,56 ℃水浴30 min,取出振蕩,置100 ℃水浴8 min,取出振蕩,冰上放置3 min,13000 rpm離心3 min,上清作模板用于PCR擴增。

1.2.3 DNA含量和純度檢測:各取1 μL三種方法提取的基因組DNA樣品,以無菌水為空白對照,紫外分光光度計測定基因組DNA的含量（ng/L）及波長為260 nm和280 nm的吸光度值（A260、A280）。根據(jù)A260/A280的比值來判斷DNA的純度:A260/A280＜1.8說明樣品中存在蛋白質(zhì)污染,A260/A280介于1.8～1.9之間說明樣品較純,A260/ A280＞1.9說明樣品中存在RNA污染。

1.2.4 體外PCR擴增:根據(jù)GenBank中人三磷酸甘油醛基因（GAPDH,基因登錄號:NM_002046）第8外顯子的核苷酸序列,用 Primer5.0軟件設(shè)計引物序列進行該基因片段的擴增[4]。上游引物:5' GGC AAG GTC ATC CCT GAG 3',下游引物:5' GCCTGC TTC ACC ACC TTC 3'。PCR擴增體系:DNA含量50 ng,上游和下游引物各2 μL,Taq PCR SYBRGreenMix 12.5 μL,補加ddH2O至總體系25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min預(yù)變性,94 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s、循環(huán)35次,72 ℃采集熒光,讀取CT值。

2 結(jié) 果

2.1 三種方法提取的基因組DNA結(jié)果。見表1。

表1 三種方法提取的基因組 DNA各項指標(biāo)比較

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,三種方法兩兩比較,DNA純度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因為每種方法的用樣量不同,最終的溶解體積也不同,濃度沒有做統(tǒng)計學(xué)比較。

2.2 PCR擴增結(jié)果

三種方法擴增GAPDH基因結(jié)果良好。CT值見表2。

表2 三種方法提取的基因組DNA熒光PCR擴增CT值

3 討 論

全血是基因組DNA提取的常用試驗材料。目前基因組DNA提取的方法有很多種,如酚氯仿法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、鹽析法和碘化物法等[3-5]。作為基因研究的關(guān)鍵步驟,基因組DNA的提取和純化一直都是一個耗時耗力并且自動化程度不高的過程,因而如何快速、經(jīng)濟的獲得高品質(zhì)的基因組DNA就具有十分重要的意義。這些方法中有的操作繁雜,有的加入了對人體和環(huán)境有害的物質(zhì)。所以要根據(jù)實驗要求系統(tǒng)地考察方法的提取效率、操作時間、使用成本等因素。

本次選擇的三種提取方法是目前最常用的方法類型。結(jié)果顯示三種方法提取的純度無顯著差別,都取得了較好的效果。Promega試劑盒操作時間最短,與Chelex-100方法相差半小時,對時間要求嚴(yán)格的可以選擇。天根離心柱型試劑盒價格比較便宜,適合多種后續(xù)實驗,應(yīng)用很廣泛。如大標(biāo)本量只考慮成本,Chelex-100方法是很好的選擇,它在提取微量樣本中很有優(yōu)勢,只需要幾微升全血,就能得到質(zhì)量很高的DNA,目前在法醫(yī)鑒定中廣泛應(yīng)用。

隨著核酸檢測需要的日益增加,市場上可供使用的提取試劑盒也逐漸增多,使用者應(yīng)根據(jù)樣本的實際情況和使用目的綜合考慮。本研究結(jié)果以期對選擇合適的提取試劑盒起到一定的參考作用。

[1] 陳碧艷,覃茜,李金花.改良外周血DNA提取方法的效果分析[J].廣西醫(yī)學(xué),2011,33(10):1364-1366.

[2] 李曉曉,趙煥英,楊云廷,等.三種人全血基因組DNA 提取方法的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,27(13):5221-5225.

[3] 張帥,徐銳,張強,等.改良鹽析法提取全血基因組DNA的影響因素研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(35):42-46.

[4] 楊澤民,羅少洪,陳耕夫.三種全血基因組DNA提取方法的比較[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(12):13-14.

[5] 賈二娟,朱偉鋒,余樂涵.蛋白酶K對鹽析法提取全血DNA的影響[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(3):263-264.

R446.9

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1671-8194（2014）25-0088-02