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    C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響

    2016-10-27 03:47:13朱智劉勇何延政
    生物技術(shù)世界 2016年2期
    關(guān)鍵詞:祖細胞培養(yǎng)液內(nèi)皮

    朱智 劉勇 何延政

    (瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科 四川瀘州 646000)

    C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響

    朱智 劉勇 何延政

    (瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科 四川瀘州 646000)

    目的:析CRP對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響,同時剖析其在動脈粥樣硬化病中的作用機制。方法:密度梯度離心法制作好的大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞,標記、凝聚雙染后在共聚焦顯微鏡下觀察分析。將細胞與不同濃度C反應(yīng)蛋白一起培養(yǎng),建立體外血管形成模型,觀察C反應(yīng)蛋白對內(nèi)皮祖細胞活性和形成能力的影響,并檢測其他相關(guān)指標。結(jié)果:四組比較,當C反應(yīng)蛋白濃度升高時,10mg/L組的OD490增值數(shù)、管腔數(shù)以及滲入細胞數(shù),明顯低于其他三組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論:CRP在一定程度上可起到減弱內(nèi)祖皮細胞活性與形成能力的雙重作用,并導(dǎo)致動脈粥樣硬化類疾病在短時間內(nèi)實現(xiàn)進一步發(fā)展。

    C反應(yīng)蛋白 大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞 影響 密度梯度離心法

    1 一般資料與方法

    1.1 一般材料

    實驗對象 SD大鼠,其體質(zhì)量在100至120克的范圍之內(nèi),平均(109.4±3.7)克,提供機構(gòu)為:瀘州醫(yī)學院醫(yī)學動物實驗室。

    實驗試劑 (1)Cascade Biologics有限責任公司提供:大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞;M200培養(yǎng)液;LSGS。(2)Molecular Probes 有限公司提供:乙?;兔芏戎鞍住#?)天津灝洋生物制品集團提供:大鼠淋巴細胞分離液。(4)Sigma公司提供:噻唑藍;CRP;DAPI染色液;DMSO;胰蛋白酶。(5)天津生物化學制品廠提供:胎牛血清。(6)Santa Cruz集團提供:Bax;VEGF兔抗大鼠多克隆抗體;Bcal-2;整合素β 2。(7)Gibco集團提供:DMEM培養(yǎng)基。

    1.2 方法

    1.2.1 分離并培養(yǎng)內(nèi)皮組細胞[1]

    借助乙醚,對實驗大鼠進行麻醉,然后于無菌環(huán)境下,取其脛骨以及股骨。把脛骨以及股骨兩端規(guī)范化的剪開,以將髓腔充分暴露出來。選取無菌注射器,同時抽取PBS藥液,20ku/L,對骨髓腔實施沖洗操作。取骨髓細胞懸液,并實施過濾。此后,以1000轉(zhuǎn)/分的速率,對過濾液進行離心。濾去上清液,同時應(yīng)用PBS,制作全新的骨髓細胞懸液。按照2:1的原則,將懸液滴入大鼠淋巴細胞分離液中,然后再以2000轉(zhuǎn)/分的速率,離心25分鐘。于管壁周緣,吸取適量白膜層細胞,并將其置入離心管內(nèi);向管中加入一定量的PBS,以充分洗滌細胞。取M200培養(yǎng)液,并將其制作成實驗所需的細胞懸液。按照106/ cm2的規(guī)格,向培養(yǎng)瓶中實施接種操作。接種完畢后,將培養(yǎng)瓶放于孵育箱中(溫度:37攝氏度;CO2濃度:5%)。1日后,取出,并將其轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中。連續(xù)培養(yǎng)3日,以除去成熟的血小板以及內(nèi)皮細胞。此后,換液,并繼續(xù)培養(yǎng)3日。將經(jīng)過7日培養(yǎng)的細胞當作最終的鑒定目標。

    1.2.2 鑒定[2]

    取乙?;兔芏戎鞍?,2.4毫克/升,并于37攝氏度的恒溫條件下,對鑒定細胞進行為期2小時的孵育。借助多聚甲醛,對細胞進行固定,維持10分鐘。此后,利用PBS,對細胞實施洗滌操作。洗滌完成后,加入一定量的植物凝集素,并將其置于室溫下,進行為期1小時的孵育。待雙重熒光染色成功之后,利用顯微鏡,對其進行全面的觀察。

    1.3 分組

    實驗開始前,取適量DMEM培養(yǎng)液,對細胞進行連續(xù)2小時的培養(yǎng)。本次研究的分組標準為:(1)CRP組。按照濃度的不同,將其分為3組:1mg/L組;5mg/L組;10mg/L組。(2)對照組。不含DMEM培養(yǎng)液。

    1.4 體外模型構(gòu)建[3]

    借助DAPI染色液,對經(jīng)過CRP處理的EPC進行標記;取適量胰蛋白酶,對大鼠骨髓CMEC以及EPC進行消化處理,并按照兩者4:1的原則,制作混合細胞懸液。將已經(jīng)制作好的懸液接種于24孔板內(nèi)。利用顯微鏡對培養(yǎng)細胞進行觀察。統(tǒng)計C M E C管腔中含有的EPC數(shù)量。

    1.5 活性檢測[4]

    按照上述步驟,消化并采集貼壁細胞。取DMEM培養(yǎng)液,并將其制作成細胞懸液,然后再將懸液進行接種。貼壁完成后,更換培養(yǎng)液(未加入胎牛血清),并向其中加入適量不同濃度的CRP。維持1日。CRP組,均設(shè)置3個平行孔。

    實施檢測前,加入MTT,5克/升,并置于37攝氏度環(huán)境下孵育4小時。吸除培養(yǎng)液,同時加入DMSO,150微升。充分混合后,利用免疫檢測儀,對其實施OD490檢測。

    1.6 內(nèi)祖皮細胞形成能力檢測

    采集貼壁細胞,將其接種于24孔板內(nèi),并加入適量不同濃度的CRP。培養(yǎng)1日后,借助顯微鏡,對其實施管腔計數(shù)。

    1.7 統(tǒng)計學分析

    本次調(diào)查的所有數(shù)據(jù)均以SPSS 20.0 軟件,對其進行分析與研究,比較以t作為檢驗標準;計數(shù)資料的比較經(jīng)x2檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    表1 四組檢測結(jié)果的對比分析表 [n,(%)]

    2 結(jié)果

    2.1 鑒定結(jié)果分析

    連續(xù)培養(yǎng)7日后,于顯微鏡下能看到多個貼壁細胞集落,其中心細胞呈圓形,且沿“中心-四周”路徑,細胞主要以梭形狀存在,這一情況和胚胎時期所形成的血島具有一定的相似性。經(jīng)過雙重熒光染色后,在顯微鏡下能觀測到:細胞不僅可以對ac-LDL進行吞噬,同時也能與UEA-l相結(jié)合。此時,細胞可被判定為:正處于分化過程中的EP C。

    2.2 活性檢測結(jié)果分析

    CRP組與對照組相比:10mg/L組內(nèi)皮祖細胞的活性最弱,對照組活性最強,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示:CRP濃度越高,其減弱大鼠骨髓EPC活性的能力越強。檢測結(jié)果,詳見表1。

    2.3 形成能力檢測結(jié)果分析

    四組管腔形成數(shù)比較,10mg/L組最少,對照組最多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示:CRP濃度越高,其阻滯大鼠骨髓EPC形成管腔數(shù)的能力越強。

    3 討論

    現(xiàn)階段,“As炎癥學說[5]”在臨床醫(yī)學界已經(jīng)確立,而C反應(yīng)蛋白也成為了心血管類疾病預(yù)后效果的判定以及預(yù)測因子,其除了具備較強的敏感性與獨立性之外,還能通過對相關(guān)細胞(主要為:平滑肌細胞;內(nèi)皮細胞)進行刺激的方式,來達到促使病變進一步發(fā)展的目的。有資料,顯示:當人體組織中的C反應(yīng)蛋白濃度在1至3毫克/升的范圍之內(nèi)時,可將其判定為:中度危險因素;當C反應(yīng)蛋白濃度超過3毫克/升時,可將其判定為:重度危險因素。

    近年來,隨著醫(yī)學專家對CRP的進一步的研究,我們對其有了更多的認識,具體表現(xiàn)為:CRP[6]除了具備加快內(nèi)皮細胞凋亡速度的作用之外,還同時兼具如下幾個特點:1)利于核因子在人體組織中的表達;2)利于血管平滑肌細胞合成ROS;3)可阻滯血管新生;4)能通過刺激反應(yīng),使平滑肌實現(xiàn)大量增值以及遷移的效果;5)可加快血管新內(nèi)膜形成的速度。

    因心血管類疾病的發(fā)生,使得機體組織受損,并打破了內(nèi)皮損傷與修復(fù)這兩者之間的平衡,使得患者病情難以得到較好的控制。對此,諸多醫(yī)學專家作出了這樣的一個推測,即:可否利用C反應(yīng)蛋白,實現(xiàn)降低EPC功能活性的效果,以通過抑制血管再生修復(fù)能力的方式,達到加快缺血性疾病發(fā)展速度的這一目的。有研究,表明:C反應(yīng)蛋白在EPC(前提條件:已經(jīng)通過VEGF誘導(dǎo))中可表現(xiàn)出較強的抑制能力。由此可見,C反應(yīng)蛋白的合理應(yīng)用,可起到抑制EPC遷移的作用。此外,C反應(yīng)蛋白也可通過另外一種機制(即:下調(diào)eNOS表達),來達到降低EPC形成與存活能力的目的。

    本次研究的結(jié)果,充分表明:C反應(yīng)蛋白濃度越高,CRP組的內(nèi)祖皮活性以及形成能力越弱。組間差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。

    綜上所述,C反應(yīng)蛋白[7]在人體功能組織中發(fā)揮著較強的作用,具體表現(xiàn)在兩方面上:1)可使血管內(nèi)皮細胞功能出現(xiàn)紊亂癥狀;2)能大大降低EPC功能活性,讓血管再生修復(fù)機制受阻,利于缺血性疾病的進一步發(fā)展。故,我們可利用C反應(yīng)蛋白,對動脈粥樣硬化類疾病進行有效的防治。

    [1]趙薇,楊向紅.C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響[J].中國動脈硬化雜志,2011,19(2):105-109.

    [2]肖暖.血管內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)分化及其高血壓病的相關(guān)性研究[D].河北醫(yī)科大學,2014.

    [3]陳愛華,何非,程婧等.C反應(yīng)蛋白對人外周血來源內(nèi)皮祖細胞Notch信號通路表達影響的實驗研究[J].南方醫(yī)科大學學報,2012,32(2):239-242.

    [4]程何祥,許旭東,張榮慶等.恒磁場對C-反應(yīng)蛋白作用下大鼠內(nèi)皮祖細胞增殖、凋亡及一氧化氮分泌的影響[J].中華物理醫(yī)學與康復(fù)雜志,2009,31(2):88-90.

    [5]何晉,陳曉彬,鄭昭芬等.C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)外周血內(nèi)皮祖細胞衰老及非諾貝特的保護作用[J].中國動脈硬化雜志,2012,20(1):42-46.

    [6]何晉,陳曉彬,鄭昭芬等.非諾貝特對C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的外周血內(nèi)皮祖細胞損傷的保護作用[J].醫(yī)學臨床研究,2011,28(5):853-856.

    [7]哈小琴,他維瑋,彭俊華等.外周血內(nèi)皮祖細胞預(yù)測重癥急性胰腺炎意義的研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,33(20):2446-2449.

    R-3

    A

    1674-2060(2016)02-0119-02

    何延政

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