響應面法優(yōu)化金針菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

黃瑞 伍業(yè)旭 李嘯

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

響應面法優(yōu)化金針菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

黃瑞 伍業(yè)旭 李嘯

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

文章運用響應面法優(yōu)化了金針菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。用Plackett-Burman設計篩選出影響生物量的3個主要因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉。在此基礎上運用響應面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件。

金針菇 響應面法 酵母浸粉

食用菌液態(tài)菌種發(fā)酵技術是食用菌和工業(yè)發(fā)酵技術的交叉學科。液體菌種具有培養(yǎng)時間短、發(fā)菌快、菌齡整齊、接種方便等優(yōu)點,利于食用菌規(guī)模化、工廠化生產(chǎn),越來越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞。

安琪酵母浸粉是純培養(yǎng)的面包酵母經(jīng)自溶、分離、高溫噴霧干燥而成的有機氮源,富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素及生長因子等。在食用菌的液體制種階段能為菌體提供豐富的營養(yǎng),促進菌體迅速增殖,有效縮短菌體生長周期,降低成本。本文以金針菇為例。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

金針菇：安琪酵母股份有限公司提供；酵母浸粉由安琪酵母股份有限公司提供；XFLS-50MA型滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-1102型恒溫培養(yǎng)振蕩器；上海智城分析儀器制造有限公司SW-CT-1D型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；AR2140型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配置

1.2.1 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖2%、酵母浸粉0.2%、KH2PO4 0. 15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB150mg/L。

1.2.3 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉3%、葡萄糖2%、黃豆粉4%、酵母浸粉0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB1 0.005%。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化 在超凈臺上將菌種接種到已滅菌的斜面培養(yǎng)基上,從斜面取0.5cm2菌塊,在恒溫23℃條件下培養(yǎng)直到菌絲鋪滿整個斜面。挑選菌絲潔白、長勢好、粗壯、無污染的試管,作為下一步供試菌種。

1.3.2 種子制備 將l00mL液體菌種培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶, 121℃下滅菌30nin,待冷卻至室溫后在無菌環(huán)境下接入2塊約0.5cm2的上述供試菌塊,先靜置培養(yǎng)24h,然后在25℃,250r/min條件下培養(yǎng)7d。

1.4 實驗設計

圖1 玉米粉和葡萄糖的交互作用對生物量影響的響應面圖（酵母浸粉 0.25%）

圖2 玉米粉和酵母浸粉的交互作用對生物量影響的響應面圖（葡萄糖2.27%）

圖3 葡萄糖和酵母浸粉的交互作用對生物量影響的響應面圖（玉米粉4.76%）

表1 Box-Behnken設計各因素與水平

1.4.1 Plackett-Burman設計法篩選影響生物量的顯著性影響因素 PB法是一種近飽和的2水平實驗設計方法,可以從眾多影響因素中快速有效地篩選出最重要的幾個因素。本文選用N=7的Plackett-Burman設計表對進行研究,以3組零點值估計誤差。

1.4.2 最陡爬坡實驗

最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向,根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長,能快速逼近最佳值區(qū)域。根據(jù)實驗1.4. 1的結(jié)果,做最陡爬坡實驗。

1.4.3 Box-Behnken設計 以爬坡設計得出的實驗結(jié)果為依據(jù)進行Box-Behnken設計,用軟件Design expert 7.0對實驗進行回歸分析并求得最優(yōu)值,得出響應面分析結(jié)果,進而確定最佳培養(yǎng)條件,最后依據(jù)回歸方程繪制響應面立體分析圖。

1.4.4 驗證 用所得到的結(jié)果進行5次平行實驗,取平均值以驗證模型的可靠性。

表2 Plackett- Burman設計回歸分析

表3 最陡爬坡實驗結(jié)果

表4 Box-Behnken設計回歸分析

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗設計結(jié)果分析

此模型R2為0.9227,說明 92.27%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋。模型P值為0.0057＜0.05,即模型極顯著,可在0.01水平上擬合數(shù)據(jù)。失擬項P值為0.0673＞0.05,表明失擬項不顯著,模型沒有出現(xiàn)失擬的現(xiàn)象。從表中各影響因素的P值可以看出,對金針菇生物量影響最顯著的3個因素依次為：A＞B＞D,即玉米粉＞葡萄糖＞酵母浸粉。

2.2 最陡爬坡實驗

根據(jù)表2中A、B、D 3個因子估計系數(shù)的正負,依次增大或減小,玉米粉和酵母浸粉是正效應,應依次增大；葡萄糖是負效應,應依次減?。黄渌秋@著性因素根據(jù)表4中的估計系數(shù)的正負分別取Plackett-Burman設計中的最大值或最小值。爬坡實驗結(jié)果見表3。

結(jié)果表明,隨著三個組分的變化,生物量呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當玉米粉為4%,葡萄糖為2%,酵母浸粉為0.3%時,金針菇生物量最大。因此,后續(xù)響應面實驗以實驗號2各因素水平為中心值來進一步設計優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken設計結(jié)果與分析

模型相關性系數(shù)R2為0.9317,說明93.17%的變異能由該模型解釋；模型P值為 0.0191表明模型是極顯著的,失擬項P值為0.1775表明模型沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。A（玉米粉）,B（葡萄糖）對金針菇生物量的影響是極顯著的,D（酵母浸粉）其次；AB的交互影響是顯著的,AD, BD的交互影響不顯著。

通過二次模型回歸系數(shù)的計算,得到如下方程以表征3個因素對生物量的影響：

R=-914.19125+291.40167A+588.21083B+3247.81250D+91. 40500AB -299.82500AD-2.90000BD-44.47833A2-224.88333B2-3592.08333D2。

式中,R代表金針菇生物量（mg/100mL）,A、B、D分別代表玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉的實際質(zhì)量百分數(shù)。利用Design expert7.0解得得最優(yōu)值點為A=4.76,B=2.27,D=0.25,即質(zhì)量濃度分別為乳糖4.76%,玉米漿2.27%,酵母浸粉0.25%,預測最大生物量為858. 231mg/100mL。根據(jù)上述擬合回歸方程作響應面分析圖。

2.4 驗證實驗

用上述步驟得出的最佳培養(yǎng)基配方：玉米粉4.76%,葡萄糖2. 27%,酵母浸粉0.25%,黃豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB1 0.003%,做5組平行實驗,結(jié)果顯示實驗值（849.528± 4.390）U/mL與預測值接近,表明模型合理,數(shù)據(jù)可由此模型解釋。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化篩選出3個顯著性影響因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉,確定了最佳培養(yǎng)基組合：玉米粉4.76%,葡萄糖2.27%,酵母浸粉0.25%,黃豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB10.003%。在該最佳培養(yǎng)基組合下,金針菇實際生物量達到849. 528mg/100ml,與理論預測最大生物量接近,說明響應面法優(yōu)化金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基是合理的。生物量相比優(yōu)化前提高了17.43%。

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1674-2060（2016）03-0087-02