元胡止痛片中延胡索乙素血藥濃度的UPLC—MS/MS測定及藥動學(xué)研究

單文靜+徐新蕊+吳健

[摘要] 目的 建立大鼠血漿中延胡索乙素的UPLC-MS/MS測定方法，并探討大鼠灌胃元胡止痛片后其在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程。 方法 以流動相乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速0.35 mL/min；采用電噴霧離子源，正離子檢測模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測延胡索乙素血藥濃度，并用DAS 3.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。 結(jié)果 延胡索乙素在2.93～711 ng/mL線性關(guān)系良好，平均回收率均>87.6%，日內(nèi)、日間RSD均< 15%。大鼠灌胃元胡止痛片后，延胡索乙素AUC0-t為（11 359±3026）ng·min/mL；t1/2為（342±36）min。 結(jié)論 UPLC-MS/MS能夠快速、靈敏、專屬地分析大鼠血漿中延胡索乙素的血藥濃度，該方法適用于元胡止痛片在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)分析。

[關(guān)鍵詞] 超高壓液相色譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用法；元胡止痛片；延胡索乙素；藥物代謝動力學(xué)

[中圖分類號] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（a）-0036-04

UPLC-MS/MS determination and pharmacokinetic study of plasma concentration of Tetrahydropalmatine in Yuanhuzhitong Tablets

SHAN Wenjing1 XU Xinrui1 WU Jian2

1.Department of Pharmacy， the Fifth People's Hospital of Dalian City， Liaoning Province， Dalian 116021， China； 2.School of Science， Harbin University of Commerce， Heilongjiang Province， Harbin 150076， China

[Abstract] Objective To establish an UPLC-MS/MS determination method of Tetrahydropalmatine in rat plasma， explore pharmacokinetic process in rat after intragastric administration of Yuanhuzhitong Tablets. Methods The chromatography was eluted with mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% formic acid solution at the flow rate of 0.35 mL/min by gradient elution. Multiple-reaction monitoring scanning mode was employed for quantification with switching electrospray ion source polarity in positive mode. The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 3.0 software. Results The linear ranges of Tetrahydropalmatine was 2.93-711 ng/mL. RSDs of inta-day and inter-day were all lower than 15%， and the average recovery was more than 87.6%. After intragastric administration of Yuanhuzhitong Tablets， AUC0-t of Tetrahydropalmatine was （11 359±3026） ng·min/mL， t1/2 was （342±36）min. Conclusion UPLC-MS/MS is a rapid， sensitive and specific method for the determination of Tetrahydropalmatine in rat plasma. This method is suitable for pharmacokinetic analysis of Yuanhuzhitong Tablets in rats.

[Key words] UPLC-MS/MS； Yuanhuzhitong Tables； Tetrahydropalmatine； Pharmacokinetics

元胡止痛片是比較典型的處方組成相對簡單的中藥復(fù)方制劑，該方劑是由延胡索（醋制）和白芷兩味中藥組成，具有理氣、活血、止痛之功效，用于治療氣滯血瘀的胃痛、肋痛、頭痛和痛經(jīng)等。由于該方組方簡單、療效確切，被收載于1985年及以后各版《中國藥典》。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，生物堿和香豆素類化合物是延胡索和白芷中的主要活性成分[1-3]，且具有廣泛的藥理活性，如血管舒張、止痛、抗炎、抗焦慮及抗痙攣等[4-9]。其中延胡索乙素是延胡索中的異喹啉類生物堿，是元胡止痛片中的重要活性成分，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠等藥理作用，是元胡止痛片中的有效活性成分之一。處方中所用延胡索多經(jīng)過醋制，因?yàn)橛坞x的生物堿較難溶于水，經(jīng)醋制后生成醋酸鹽而易溶于水而發(fā)揮療效[10-12]。

延胡索乙素既是元胡止痛片的物質(zhì)基礎(chǔ)，又是質(zhì)量控制常用的指標(biāo)物[13]。已有研究建立了元胡止痛片中延胡索乙素[14]及香豆素類成分[15-20]的質(zhì)量控制方法，但未見藥動學(xué)研究報道。本研究首次采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），研究元胡止痛片中代表性的延胡索乙素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為，為該組方更深層次開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，為元胡止痛片的臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器、試藥與方法

1.1 儀器

UPLC-MS/MS分析系統(tǒng)（由Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6460質(zhì)譜檢測器組成）；LG16-B型高速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；Bandelin Sonorex RK 1208BH超聲波清洗器（德國）；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Milipore超純水機(jī)（美國Mililpore公司）；METTLER Toledo AB265-S電子天平（瑞士）。

1.2 藥品

甲醇、乙腈購于美國ACS恩科化學(xué)，乙酸、乙酸銨購于Sigma公司，均為色譜純。水為超純水，其余試劑均為分析純。元胡止痛片購于哈爾濱人民同泰藥房，生產(chǎn)廠家為河南宛西制藥有限公司，生產(chǎn)批號：160102。延胡索乙素、柚皮苷購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD大鼠，體重（270±30）g，月齡為4個月，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（黑）2013-001。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取對照品延胡索乙素適量，用甲醇溶解并定容，得延胡索乙素（1.31 mg/L）的對照品儲備液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品及質(zhì)控樣品的制備 精密吸取“1.4.1”項(xiàng)中延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋30 s，配制成延胡索乙素2.93～659 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。延胡索乙素質(zhì)控樣品為4.35、47.9、527 ng/mL。

1.4.3 色譜條件 采用Waters ACQULTY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行分析，以水（含0.1%甲酸溶液）為流動相A，乙腈為B，進(jìn)行梯度洗脫。0～2 min，流動相A（%）為95→80；2～3 min，流動相A（%）為80→70；3～4 min，流動相A（%）為70→50；4～5 min，流速為0.35 mL/min進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為30℃。

1.4.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI源），檢測方式：正離子檢測，掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），對照品的選擇檢測離子質(zhì)荷比為延胡索乙素：356.2→192.1干燥氣（N2）流速11.0 L/min，Nebulizer 0.10335 MPa，干燥氣溫度300℃，檢測器電壓4000 V。

1.4.5 血漿樣品處理方法 取大鼠血漿50 μL，加入200 μL內(nèi)標(biāo)柚皮苷溶液（20.0 ng/mL）渦旋1 min，于4℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液置離心管中，氮吹儀下氮?dú)獯蹈?，殘留物?0 μL甲醇-水（50︰50）溶解，于4℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液1 μL進(jìn)樣。

1.4.6 藥動學(xué) 實(shí)驗(yàn)大鼠6只，自由飲水，給藥前禁食12 h，灌胃給藥，給予元胡止痛片3.0 g/kg。分別于給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼底靜脈叢毛細(xì)管取血0.1 mL/只，肝素鈉抗凝，4500 r/min離心10 min，分離上層血漿，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用DAS 3.0藥動學(xué)軟件按非房室模型處理，計算藥動學(xué)參數(shù)，所得數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿+對照品、血漿樣品，按血樣處理方法處理，進(jìn)樣，結(jié)果見圖1～4，血漿的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各成分和內(nèi)標(biāo)的測定，表明液質(zhì)行為及專屬性良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取大鼠空白血漿，每份90 μL，加入延胡索乙素對照品系列溶液10 μL，制得被分析物的血藥濃度為延胡索乙素2.93、8.79、26.3、79.1、237、711 ng/mL；分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品50 μL，按“1.4.5”項(xiàng)的方法處理，在“1.4.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用加權(quán)（1/X2）最小二乘法，以待測成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對樣品質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行曲線擬合回歸，得工作方程，定量限以S/N≥10計，線性方程Y=0.0416X+0.361，R2為0.9959，線性范圍為2.93～711 ng/mL，延胡索乙素在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性良好。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 配制低、中、高3個質(zhì)量濃度的對照品血漿樣品，按“1.4.5”項(xiàng)下方法處理，每個質(zhì)量濃度取6份樣本，1 d內(nèi)分別測定6份樣品，并各取1份樣品連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度見表1。

2.1.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 分別制備低、中、高濃度的含藥QC樣品，按“1.4.5”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，每一濃度平行測定6份，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為A；另取空白血漿，按“1.4.5”項(xiàng)下方法操作處理后，加入對應(yīng)的低、中、高濃度的系列對照品溶液進(jìn)樣分析，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為B，每一濃度平行測定6份；A/B×100%即得提取回收率。另用流動相將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制成與上述理論濃度相同的低、中、高濃度溶液直接進(jìn)樣分析，每一濃度平行測定6份，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為C，基質(zhì)效應(yīng)的計算方法為B/C×100%。延胡索乙素低、中、高濃度的回收率和基質(zhì)效應(yīng)見表1。結(jié)果表明所建方法能夠滿足生物樣品的測定要求。

2.1.5 樣本穩(wěn)定性考察 考察各成分低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品室溫放置、自動進(jìn)樣器內(nèi)、-40℃長期冷凍、冷凍-解凍3個循環(huán)等不同存儲條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，血漿樣品室溫放置4 h、血漿樣品處理后在自動進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h、血漿樣品冷凍-解凍循環(huán)3次、血漿樣品長期冷凍于-40℃冰箱內(nèi)30 d，各成分的RSD均< 15%。見表2。

2.2 藥動學(xué)試驗(yàn)

取健康SD大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。按3.0 g/kg（按照元胡止痛片使用說明書每人每次用量為1.5 g，藥動學(xué)研究采用其給藥量20倍灌胃給藥，即每人每次30 g，參照人體-大鼠給藥量折算方法，得大鼠給藥量為3.0 g/kg）灌胃元胡止痛片，分別于給藥后5、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、360、480、720、1440 min經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采血約0.1 mL，置肝素化試管中，4500 r/min離心10 min，分取上清，血漿置于-40℃冰箱中保存待測。樣品按“1.4.5”項(xiàng)下方法處理，取上清進(jìn)行UPLC-MS/MS測定。延胡索乙素在大鼠體內(nèi)的血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 3.0軟件進(jìn)行計算，t1/2為（342±36）min，達(dá)峰濃度（Cmax）為（49.3±1.25）ng/mL，達(dá)峰時間（Tmax）為180 min和藥-時曲線下面積（AUC0-t）為（10 246±2735）ng·min/mL，平均駐留時間（MRT0-t）為（482±38）min。見圖5。

3 討論

中藥藥代動力學(xué)是借助于藥代動力學(xué)的基本理論研究中草藥活性成分、組分、中藥單方和復(fù)方體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的動態(tài)變化規(guī)律及其體內(nèi)時量-時效關(guān)系。中藥藥代動力學(xué)雖起步較晚，但新理論、新方法的涌現(xiàn)以及HPLC、LC-MS和LC-NMR等檢測手段的出現(xiàn)，為認(rèn)識中藥體內(nèi)過程中所產(chǎn)生的藥物信息提供了有力技術(shù)支撐。中藥藥代動力學(xué)為研究中藥各化學(xué)成分的體內(nèi)代謝過程和各組分間在體內(nèi)的相互作用提供了新途徑，但由于中藥復(fù)方中的化學(xué)成分相對復(fù)雜且微量，如何從整體上闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是目前所面臨的問題之一。延胡素作為君藥，是元胡止痛片中的重要組成部分，其化學(xué)成分是發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本文通過分析這種有效成分在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程，為闡明元胡止痛片的藥理作用提供參考。本文采用UPLC-MS/MS及內(nèi)標(biāo)法對延胡索乙素進(jìn)行定量測定，保證了血藥濃度結(jié)果的準(zhǔn)確性。UPLC-MS/MS檢測一個樣品所需時間短，且所需的血漿樣本量少，非常適合藥代動力學(xué)等研究中的大批量樣品研究。

在樣品處理過程中，分別考察了甲醇沉淀蛋白法、乙腈沉淀蛋白法、乙酸乙酯萃取法，對各自所得回收率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，甲醇沉淀蛋白法提取回收率最高且處理方法較為簡單。根據(jù)UPLC-MS/MS的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)元胡止痛片灌胃給藥后，延胡索乙素能迅速吸收入血發(fā)揮作用。

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