茶樹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白NRT1.1基因的克隆及表達(dá)分析

楊亦揚，胡雲(yún)飛，萬青，李榮林，王楓，阮建云

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茶樹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白NRT1.1基因的克隆及表達(dá)分析

楊亦揚1,2，胡雲(yún)飛1，萬青1，李榮林1，王楓3，阮建云2*

1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江杭州 310008；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京 210095

以茶樹（(L.)）品種龍井43為試材，采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因（）的cDNA全長序列，基因序列全長1?880?bp，其中開放閱讀框（ORF）1?788?bp，編碼595個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99，命名為。序列分析表明，與葡萄氨基酸序列的相似性最高。通過生物信息學(xué)分析，對的氨基酸理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜區(qū)域及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測。實時定量PCR表達(dá)分析表明，茶樹根和葉片中在1?mol·L-1NO3-處理5?min內(nèi)均受到抑制，葉部表達(dá)量0.5?h后即達(dá)到最大值，24?h內(nèi)各個時間點均高于根部，根中表達(dá)量始終低于對照。本研究結(jié)果為研究茶樹對NO3-的吸收、轉(zhuǎn)運和調(diào)控機理提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

茶樹；硝態(tài)氮；基因；實時定量PCR

茶樹（(L.)）是原產(chǎn)中國的多年生木本植物，它以葉片為收獲目標(biāo)，對氮素需求量較大。氮肥施用量與茶葉品質(zhì)成分氨基酸、茶多酚含量密切相關(guān)，所以，氮肥是茶園中主要的肥料，通常占施肥總量的一半以上[1]。茶樹對不同氮源具有偏性吸收特性，對銨態(tài)氮的吸收量高于硝態(tài)氮的10倍以上，研究表明，造成這種差異的原因，主要在于吸收運載系統(tǒng)的差異[2-3]。故研究茶樹NO3-吸收、轉(zhuǎn)運和累積的機制，對于提高其NO3-的利用效率，從而提高茶樹氮素利用率，提高茶葉品質(zhì)，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白（Nitrate transporters, NRTs）負(fù)責(zé)植物根系對NO3-的吸收和轉(zhuǎn)運，一直是植物營養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點之一。植物具有3個NO3-轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以適應(yīng)外界不同的NO3-濃度。兩個高親和運載系統(tǒng)（High-affinity transport system, HATS），在低濃度NO3-的環(huán)境下發(fā)揮作用，而當(dāng)外界NO3-的濃度較高時，植物通過低親和運載系統(tǒng)（Low-affinity transport system, LATS）進(jìn)行NO3-的吸收[4-5]。目前，已證實擬南芥基因組有53個NRT1亞家族成員，7個NRT2亞家族成員[6-7]，水稻中NRT1亞家族成員有100多個，NRT2亞家族成員有6個[8]。

茶樹吸收利用氮素的生理特性已有研究，但對于氮吸收轉(zhuǎn)運蛋白特性的研究仍較為缺乏，對茶樹NRT2家族基因研究已有報道[9-10]，而茶樹NRT1家族分子水平研究還顯空白。本文對茶樹基因進(jìn)行分離克隆，并對其表達(dá)特性進(jìn)行研究，將為進(jìn)一步研究茶樹NRTs在茶樹氮吸收轉(zhuǎn)運中的作用及是否與茶樹偏銨特性有關(guān)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樹品種為龍井43。采用兩年生龍井43扦插苗，挑選整齊一致的茶苗移栽至營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。無氮營養(yǎng)液基本組成為大量元素（mmol·L-1）：KH2PO4(0.03)，MgSO4(0.13)，CaCl2+Ca(NO3)2(0.27)，K2SO4(0.33)；微量元素（μmol·L-1）：H3BO3(3.33)，MnSO4(0.5)，ZnSO4(0.33)，CuSO4(0.07)，(NH4)6Mo7O24(0.17)，F(xiàn)eEDTA (2.10)。茶苗在上述營養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后，移至光照培養(yǎng)箱（光照16?h/黑暗8?h、光照強度2?000?lx、溫度25℃、濕度80%），NO3-濃度為1?mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液中進(jìn)行NO3-吸收試驗，取未處理及處理5?min、0.5?h、1?h、2?h、4?h、8?h、12?h和24?h后的茶苗根和葉片作為提取總RNA的試驗材料。

1.2 RNA提取及cDNA合成

分別取0.1?g茶樹根和葉片，利用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen，北京）提取茶樹總RNA，用1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，置于－80℃保存?zhèn)溆?。用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa，大連）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 CsNRT1.1基因的克隆

根據(jù)GenBank中擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1.1（At1g12110）基因序列，將它與茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲取它在茶樹中的同源序列，并以此序列為參考，利用Primer 5.0設(shè)計RACE特異引物（表1），通過RACE技術(shù)，對茶樹的3′和5′端進(jìn)行擴增，拼接出茶樹全長序列。最后，再設(shè)計特異引物，擴增出茶樹基因全長序列。以cDNA第1鏈為模板進(jìn)行擴增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5?min，94℃ 30?s，54℃ 30?s，72℃ 60?s，30個循環(huán)；72℃ 10?min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行測序。

表1 茶樹CsNRT1.1 cDNA克隆相關(guān)引物

1.4 序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI進(jìn)行開放閱讀框的查詢，通過BLAST進(jìn)行同源性分析，用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；基因編碼蛋白的理化性質(zhì)采用Protparam程序預(yù)測，疏水性/親水性預(yù)測分析通過ProtScale程序預(yù)測，跨膜結(jié)構(gòu)域通過TMHMM服務(wù)器分析，亞細(xì)胞定位通過wolfpsort軟件進(jìn)行預(yù)測。

1.5 表達(dá)模式分析

分別以茶苗的根、葉mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，采用定量PCR技術(shù)對不同處理時間茶樹基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。以茶樹β-actin為內(nèi)標(biāo)基因，反應(yīng)體系按照Power 2×SYBR Real-time PCR premixture使用說明書配制。25?μL體系：2.0?μL cDNA，12.5?μL 2×Premix，0.5?μL上、下游引物，0.5?μL ROX和9?μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃ 60?s，95℃ 10?s，60℃ 10?s，72℃ 30?s，40個循環(huán)。根據(jù)CT值分別計算出目標(biāo)基因的相對表達(dá)量2–ΔΔT。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsNRT1.1 cDNA全長序列的克隆及分析

以茶樹總cDNA為模板，以引物GSP3′RACER1、GSP3′RACER2進(jìn)行3′-RACE，擴增出1條大小421?bp的片段（圖1-A）。以引物GSP5′RACER1、GSP5′RACER1，5′末端cDNA擴增方式擴增出大小350?bp序列（圖1-C）。利用引物NRT1.1F、NRT1.1R進(jìn)行RT-PCR擴增，獲得了2?000?bp左右的片段（圖1-B）。測序分析表明，茶樹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因，序列全長為1?880?bp，含1?788?bp的開放閱讀框（ORF），編碼595個氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99（圖2）。

注：M：DL2000；1：擴增產(chǎn)物；A：3′端產(chǎn)物；B：全長擴增產(chǎn)物；C：5′端產(chǎn)物。

注：方框內(nèi)表示起始密碼子和終止密碼子，陰影部分為保守的蛋白激酶C的識別位點（S/T-X-R/K）。

將茶樹與GenBank中登錄的其他物種基因的氨基酸序列進(jìn)行比對，利用Mega 6軟件，采用鄰位相近法分析繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，茶樹與葡萄具有相對較高的同源性，氨基酸一致性分別為：芝麻80%、番茄77%、葡萄81%、野草莓80%、楊樹79%、橙80%、可可80%、桉樹80%、黃瓜76%、大豆74%。

注：XP_011081220：芝麻；XP_004245746：番茄；XP_002266951：葡萄；XP_004298652：野草莓；XP_002303512：楊樹；XP_006477230：橙；XP_007039888：可可；XP_010053448：桉樹；XP_001275529：黃瓜；XP_003517427：大豆。

2.2 茶樹CsNRT1.1編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1茶樹CsNRT1.1氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

利用在線分析軟件Protparam對CsNRT1.1所對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，茶樹CsNRT1.1所對應(yīng)的氨基酸數(shù)目為595個，分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99，氨基酸組成如圖4所示。負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為（Asp+Glu）40個，正電荷氨基酸殘基數(shù)為（Arg+Lys）49個。不穩(wěn)定系數(shù)為32.96，為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為101.92?？偲骄H水性為0.315。

2.2.2 茶樹CsNRT1.1疏水性/親水性預(yù)測分析

通過ProtScale程序繪制茶樹CsNRT1.1的親/疏水性序列譜，結(jié)果如圖5，甘氨酸（235位）分值最高，為3.511，谷氨酸（293位）分值最低，為－3.333，根據(jù)正值越大，疏水性越高；負(fù)值越小，親水性越高的規(guī)律判斷，茶樹CsNRT1.1的疏水性氨基酸較多，為疏水性蛋白。

注：橫向為氨基酸順序，由左向右；疏水和親水位點分別在零水平線的上方和下方。

2.2.3 茶樹CsNRT1.1跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用TMHMM分析表明，該蛋白序列跨膜螺旋（TMhelix）區(qū)預(yù)測位置分別在41~63、78~100、107~129、149~171、192~214、218~240、340~362、380~402、423~442、462~484、505~527、547~569。從輸出的圖形文件中也可以明顯看到這12個跨膜螺旋區(qū)（圖6），其中，第6個和第7個跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在一個大的親水環(huán)。茶樹CsNRT1.1蛋白氨基酸N端和C端均處于細(xì)胞膜內(nèi)部。

圖6 茶樹CsNTR1.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模式圖

2.2.4 茶樹CsNRT1.1亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用軟件wolf psort對茶樹CsNRT1.1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，茶樹CsNRT1.1蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜的得分最高，為10.0，液泡和細(xì)胞外得分均為2.0，推測其定位在細(xì)胞質(zhì)膜上行使氮轉(zhuǎn)運的功能，為膜蛋白。

2.3茶樹CsNRT1.1基因表達(dá)模式分析

分別提取茶樹根和葉片中的mRNA進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果如圖7所示。與對照相比，茶樹受NO3-處理5?min后根和葉的表達(dá)量均下降，尤其是根部，下降顯著。根部表達(dá)量始終低于對照，葉部表達(dá)量24?h內(nèi)各個時間點均高于根部，半小時后即達(dá)到最大值。

3 討論

NRT1.1（CHL1）是植物中鑒定的第一個硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白[11]，無論外界環(huán)境中NO3-濃度高低均可以發(fā)揮作用[12]，故成為研究的焦點，目前模式植物上仍在進(jìn)行新的研究[13]。茶樹氮吸收轉(zhuǎn)運蛋白研究尚處于起步階段，NRT1.1的功能是否與其他作物中的一樣尚不明確。本文從龍井43茶樹中成功克隆了一個硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因。Blast比對結(jié)果表明，基因核苷酸和氨基酸序列與其他植物的NRT1.1有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，它與葡萄等植物有較高的同源性，與黃瓜、大豆等作物關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

NRT1轉(zhuǎn)運蛋白一般含有450~600個氨基酸，并含有12個跨膜區(qū)，在第6和第7跨膜區(qū)之間有一個大的親水環(huán)[14]，本研究中，茶樹NRT1.1含有12個跨膜螺旋區(qū)，其中，第6個和第7個跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在一個大的親水環(huán)。且該蛋白為疏水性蛋白，可能定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，為膜蛋白，這與茶樹NRT1.2和NRT1.5的結(jié)果一致[9]，說明二者行使氮轉(zhuǎn)運功能的位置一致。

根據(jù)基因的表達(dá)是否受NO3-誘導(dǎo)可以將NRT基因分為誘導(dǎo)型和組成型兩大類[6]，實時定量結(jié)果表明，在茶樹根系和葉部開始吸收NO3-5?min內(nèi)表達(dá)均受到抑制，說明茶樹為誘導(dǎo)型基因，且根部受抑制作用影響較大，葉片中影響較小。植物中很多基因可以在短時間內(nèi)響應(yīng)NO3-的處理[15-17]，并表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律特征[18-19]。本研究吸收試驗處理從上午9：00開始，吸收12?h后，即到晚上9：00，黑暗情況下，根系和葉片中均降到了最低點，說明茶樹受光照影響。24?h動態(tài)追蹤結(jié)果表明，茶樹葉片中在0.5?h達(dá)到較高水平，而根部一直低于對照，沒有顯著增加。說明在不同組織部位中，吸收同化NO3-的機理可能存在差異，葉片對NO3-的處理響應(yīng)更明顯。另外，不僅只作為硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，更可能是感受硝酸鹽的信號受體，它對茶樹其他硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白、茶樹生長和發(fā)育的作用還需進(jìn)一步研究和鑒定。

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Cloning and Expression Analysis of Nitrate Transporter NRT1.1 Gene in Tea Plant ((L.))

YANG Yiyang1,2, HU Yunfei1, WAN Qing1, LI Ronglin1, WANG Feng3, RUAN Jianyun2*

1. Institute of Horticulture, Jiangsu Academy of Agricultural Science, Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China; 2. Tea Research of Institute, Chinese of Academy of Agricultural Science, Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 3. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China

A full length cDNA sequence of Nitrate transport gene () was obtained from tea plant ((L.)) cultivar ‘Longjing 43’ by polymerase chain reaction (PCR) and rapid amplification of cDNA ends PCR (RACE-PCR). The length of nucleotide sequence of this gene was 1?880?bp, containing a complete open reading frame (1?788?bp) to encode 595 amino acids. The putative protein had an isoelectric point of 8.99 and a calculated molecular weight of 65.9?kD.was highly homologous to the geneby sequence alignment. Several parameters of these sequences, including sequences composition, physicochemical property, topological structure of transmembrane regions, hydrophobicity or hydrophilicity, subcellular localization were predicted by bioinformatics tools. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression ofin roots and leaves were inhibited after incubation in 1 mol·L-1NO3-for 5?min. The expressions oferealways lower than thatof CKwithin 24?h.Its expressions in leaves were higher than those in roots with its peak at 0.5?h.Our results provides favorably help to reveal NO3-uptake and utilization in tea plants.

, nitrate,,RT-PCR

S571.1；Q51

A

1000-369X（2016）05-505-08

2016-04-25

2016-05-27

國家自然科學(xué)基金（31400587）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160590）、茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室開放基金（SKLTOF20150114）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(16)1003）。

楊亦揚，女，博士，副研究員，主要從事茶樹生理與營養(yǎng)研究。

jruan@mail.tricaas.com