逆境脅迫下小麥脂肪氧化酶基因表達(dá)的qRT-PCR分析

張福彥，陳 鋒，張建偉，楊保安，范家霖，陳曉杰，陳云堂，崔 龍

(1.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450015；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

?

逆境脅迫下小麥脂肪氧化酶基因表達(dá)的qRT-PCR分析

張福彥1,2，陳 鋒2，張建偉1，楊保安1，范家霖1，陳曉杰1，陳云堂1，崔 龍1

(1.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450015；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

為探討小麥脂肪氧化酶基因在非生物脅迫過(guò)程中的生物學(xué)功能，采用qRT-PCR技術(shù)，首先分析了 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥幼葉、莖、根以及成熟籽粒中的表達(dá)情況，其次分析了這2個(gè)基因在高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫下葉片中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這2個(gè)基因在小麥根、莖、葉以及成熟籽粒中均有表達(dá)，但 TaLox-B2基因主要在葉和成熟籽粒中表達(dá)，而 TaLox-B3基因主要在根和葉中表達(dá)。在高鹽脅迫下，這2個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)大體一致，類(lèi)似于正態(tài)分布，在3 h時(shí)達(dá)到峰值。在低溫逆境下， TaLox-B2基因的表達(dá)模式無(wú)明顯規(guī)律，而 TaLox-B3基因在0～6 h范圍內(nèi)呈上調(diào)表達(dá)，之后開(kāi)始逐漸下降。在高溫逆境下，這2個(gè)基因在0～12 h范圍內(nèi)均呈下調(diào)表達(dá)，但二者下調(diào)的趨勢(shì)明顯不同。在模擬干旱脅迫下，這2個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均較低，表達(dá)趨勢(shì)存在明顯差別，但二者的表達(dá)模式則無(wú)明顯規(guī)律。推測(cè)認(rèn)為， TaLox-B2和 TaLox-B3基因主要受鹽脅迫誘導(dǎo)，且與PEG干旱脅迫之間沒(méi)有特定的關(guān)系，此外，溫度變化對(duì) TaLox-B2和 TaLox-B3基因表達(dá)量的影響較為明顯，但低溫和高溫的作用機(jī)制不同。

普通小麥；逆境脅迫；脂肪氧化酶基因；表達(dá)分析

面粉色澤是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對(duì)面粉或面制品的商品性具有重要影響[1]。面粉中八氫番茄紅素合成酶、多酚氧化酶、脂肪氧化酶等其他過(guò)氧化物酶通過(guò)對(duì)黃色素和類(lèi)胡蘿卜素等色素類(lèi)物質(zhì)的氧化降解，進(jìn)而對(duì)面粉或面制品色澤產(chǎn)生影響[2-4]。在小麥中，脂肪氧化酶(Lipoxygenase，Lox)含量雖然較低，但對(duì)面粉或面制品色澤等具有重要影響，現(xiàn)已成為小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。

小麥籽粒Lox活性可遺傳率較高，基因型是決定小麥Lox活性的最主要因素[5-6]。Hart和Langston[7]利用中國(guó)春缺體-四體代換系對(duì)硬粒小麥Lpx同工酶進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Lpx-A1、Lpx-B1和 Lpx-D1分別位于4AL、4BL和4DS染色體上，而 Lpx-A2、 Lpx-B2和 Lpx-D2分別位于5AL、5BL和5DL上，因而推測(cè)小麥Lox基因主要位于第4和第5同源群上。隨著大麥和硬粒小麥中Lox基因被克隆和定位[8-10]，普通小麥中Lox基因的克隆、定位及與之緊密連鎖的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)等也取得了一定的進(jìn)展。Feng等[11]采用同源克隆的方法從普通小麥品種小偃54中克隆了位于4DS染色體上的 TaLox1基因和位于5DL染色體上的 TaLox2n基因，并對(duì)二者在成熟籽粒中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) TaLox1比 TaLox2n基因表達(dá)量更高，說(shuō)明 TaLox1基因?qū)π←溩蚜ox活性作用更為明顯[11]。之后，又利用同樣的方法從普通小麥中克隆出一個(gè)新Lox基因，命名為 TaLox3，將其定位在4A染色體上[12]。Geng等[13]利用電子克隆方法克隆得到普通小麥4B染色體上的 TaLox-B1基因，且發(fā)現(xiàn)了其至少含有2種等位變異類(lèi)型，分別命名為 TaLox-B1a和 TaLox-B1b，二者gDNA序列間存在單核苷酸多態(tài)性，根據(jù)該多態(tài)性開(kāi)發(fā)1對(duì)共顯性互補(bǔ)功能性分子標(biāo)記Lox16和Lox18。Garbus等[14]先后在普通小麥中克隆發(fā)現(xiàn)了與硬粒小麥中類(lèi)似的 Lpx-A1-like、 Lpx-B1.2和 Lpx-D1基因，并將其分別定位在4A、4B和4D染色體上。之后，Zhang等[15]采用電子克隆技術(shù)從普通小麥4BS染色體上克隆得到2個(gè)與Lox活性關(guān)系密切的新基因，命名為 TaLox-B2和 TaLox-B3，且發(fā)現(xiàn) TaLox-B2基因存在2種等位變異類(lèi)型，將其命名為 TaLox-B2a和 TaLox-B2b，同時(shí)，根據(jù)三者基因的gDNA序列差異開(kāi)發(fā)了功能性分子標(biāo)記Lox-B23。盡管已有關(guān)于普通小麥籽粒Lox基因克隆、功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)和檢測(cè)以及Lox活性分析等的相關(guān)報(bào)道，但有關(guān)小麥Lox基因在非生物脅迫過(guò)程中的生物學(xué)功能的報(bào)道很少。

本研究以小麥 β-actin基因?yàn)閷?duì)照，利用qRT-PCR技術(shù)，先分析 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥幼葉、莖、根以及成熟籽粒中的表達(dá)情況，其次分析以上2個(gè)因基在高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫下葉片中的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步了解小麥籽粒脂肪氧化酶基因的生物學(xué)功能和分子遺傳基礎(chǔ)提供一定的幫助。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及其處理

供試材料包括2014年河南省最新審定的小麥品種豫農(nóng)211、1997年河北省審定的小麥品種石4185及目前全國(guó)推廣面積最大的小麥品種矮抗58，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種研究室提供。挑選籽粒飽滿(mǎn)的小麥種子，經(jīng)雙氧水消毒后播種于培養(yǎng)皿中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，于光/暗周期為12 h/12 h、溫度為22～25 ℃的條件下培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，分別取各小麥品種的幼葉、莖和根，同時(shí)將矮抗58幼苗分別在4 ℃低溫、42 ℃高溫、100 mmol·L-1NaCl以及20% PEG6000共4種逆境脅迫環(huán)境下分別處理0、1、3、6、12和24 h后取其葉片，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取

分別取適量1.1中保存于-80 ℃超低溫冰箱中的小麥幼葉、莖和根，加入液氮后迅速研磨至粉末狀，采用Trizol法提取總RNA，具體操作步驟參照南海波[16]的方法進(jìn)行。同時(shí)，參照胡群文等[17]提取小麥種子RNA的方法提取供試各小麥品種成熟種子RNA。

1.2.2cDNA第一鏈的合成

以提取的總RNA為模板，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Prime Script○RRT reagent Kit With gDNA Eraser， 寶生物工程(大連)有限公司]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。

1.2.3特異性引物的設(shè)計(jì)

利用DNAMAN Version 6.0進(jìn)行序列分析，采用Primier Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。根據(jù)Zhang等[15]新克隆的小麥籽粒 TaLox-B2和 TaLox-B3基因的gDNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物L(fēng)ox-P2和Lox-P3；以小麥中穩(wěn)定表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因 β-actin(GI：48927671)序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物WAC，作為內(nèi)參。引物合成均在生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行，具體引物序列信息見(jiàn)表1。

1.2.4表達(dá)分析

RT-PCR反應(yīng)在美國(guó)伯樂(lè)iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行。3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10 pmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix ExTaqII(2×)[寶生物工程(大連)有限公司]10 μL，ddH2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UV掃描成像后確認(rèn)是否與擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果吻合。最后，采用2-△△Ct法[18]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　RT-PCR特異性引物序列信息Table 1　Specific primer sequence for RT-PCR

2　結(jié)果與分析

2.1 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥不同器官中的表達(dá)

利用RT-PCR分析 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在矮抗58、石4185和豫農(nóng)211小麥品種的不同器官中的表達(dá)，結(jié)果(圖1)表明， TaLox-B2基因在石4185、矮抗58以及豫農(nóng)211的不同器官中均表達(dá)，且在葉中表達(dá)水平明顯高于根、莖和成熟籽粒，成熟籽粒中的表達(dá)水平略高于根、莖，而根中表達(dá)水平最低(圖1A)。 TaLox-B3基因在石4185和豫農(nóng)211的不同器官中均不表達(dá)，而在矮抗58的不同器官中均表達(dá)，且在根中表達(dá)水平明顯高于葉、莖和成熟籽粒，在葉中的表達(dá)水平略高于成熟籽粒和莖，而在莖中表達(dá)水平最低(圖1B)。由此可見(jiàn)，小麥 TaLox-B2基因的表達(dá)強(qiáng)度依次為葉>成熟籽粒>莖>根，而 TaLox-B3基因的表達(dá)強(qiáng)度依次為根>葉>成熟籽粒>莖。

2.2 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在脅迫處理下的特異性表達(dá)

利用RT-PCR分析經(jīng)高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫處理后的矮抗58葉片中 TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2～5所示。

在4 ℃低溫條件下， TaLox-B2基因在0～1 h

圖1　 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在普通小麥品種不同器官中的相對(duì)表達(dá)水平

迅速上調(diào)表達(dá)，在1 h時(shí)達(dá)到最大，約為起始表達(dá)量的1.5倍，此后表達(dá)量下降，在3 h時(shí)表達(dá)量接近起始水平，之后又開(kāi)始上升，在6 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)約為起始表達(dá)量的1.1倍，之后又開(kāi)始平緩下降，24 h時(shí) TaLox-B2的相對(duì)表達(dá)量較弱； TaLox-B3基因在0～6 h迅速上調(diào)表達(dá)，在6 h時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)約為起始表達(dá)量的2.6倍，之后表達(dá)量逐漸下降，24 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最低，此時(shí)與 TaLox-B2的相對(duì)表達(dá)水平非常接近(圖2)。

圖2　4 ℃低溫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

42 ℃高溫條件下， TaLox-B2基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在0～1 h平緩下降，之后開(kāi)始急劇下降，在12 h時(shí)達(dá)到最低，此時(shí)約為起始表達(dá)量的1/20，之后又開(kāi)始緩慢上升，24 h時(shí)約達(dá)到最低表達(dá)量時(shí)的4倍； TaLox-B3基因也呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在0～12 h平緩下降，在12 h時(shí)達(dá)到最低，此時(shí)約為起始表達(dá)量的1/10，之后又開(kāi)始緩慢上升，24 h時(shí)達(dá)到最低表達(dá)量時(shí)的2.2倍(圖3)。

圖3　42 ℃高溫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

在100 mmol·L-1NaCl處理?xiàng)l件下， TaLox-B2基因在0～3 h平緩上升，在3 h時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)約為起始表達(dá)量的2.4倍，之后開(kāi)始緩慢下降，但到12 h以后下降速度減慢，基本處于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)； TaLox-B3基因在0～3 h急劇上升，在3 h時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)約為起始表達(dá)量的5倍，之后開(kāi)始下降，在12 h時(shí)達(dá)到最低，此時(shí)相對(duì)表達(dá)量與起始表達(dá)量相當(dāng)，但略低于起始表達(dá)量，此后又開(kāi)始緩慢上升，在24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1.4倍(圖4)。

在20% PEG6000脅迫條件下， TaLox-B2基因在0～3 h平緩上升，在3 h時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，之后開(kāi)始下降，在12 h時(shí)達(dá)到另外一個(gè)峰值，之后開(kāi)始急劇下降，在24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1/3倍； TaLox-B3基因在0～1 h呈下調(diào)表達(dá)，之后開(kāi)始上升，且在3 h和12 h分別有一個(gè)峰值，在24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1/4倍(圖5)。

圖4　100 mmol·L-1 NaCl脅迫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

圖5　 干旱脅迫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

3　討 論

脂肪氧化酶廣泛存在于各種植物中，植物在受到外源傷害或病原菌侵染時(shí)Lox表達(dá)增強(qiáng)，而Lox的催化產(chǎn)物脂氫過(guò)氧化物及其次生產(chǎn)物可以降解為傳遞生物脅迫和非生物脅迫信息的信號(hào)因子，以增強(qiáng)對(duì)昆蟲(chóng)和真菌病害的敏感性，進(jìn)而對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用[19]。目前，脂肪氧化酶在擬南芥、馬鈴薯、大麥、水稻以及大豆等植物中關(guān)于生理基礎(chǔ)和分子生物學(xué)方面的研究較為深入。Hildebrand等[20]研究認(rèn)為，大豆葉片中的Lox與反應(yīng)底物是分開(kāi)的，但在其受到逆境脅迫，并產(chǎn)生組織損傷后，Lox能與底物進(jìn)行結(jié)合，脂肪氧化酶蛋白及其活性會(huì)急劇增加，并形成新的脂肪氧化酶同工酶。而Shukle等[21]發(fā)現(xiàn)從大豆中提取的脂肪氧化酶可以有效的阻止煙草天蛾幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，因此他們認(rèn)為脂肪氧化酶在大豆植物體內(nèi)能直接起到抵御有害生物危害的功能。Royo等[22]從馬鈴薯中克隆出與逆境脅迫相關(guān)的 Lox1、 Lox2和 Lox3基因，研究發(fā)現(xiàn) Lox1在塊莖和根中特異性表達(dá)， Lox3基因則在葉片和根中表達(dá)，而 Lox2只在葉片中表達(dá)，說(shuō)明Lox基因具有特定的組織表達(dá)特異性；對(duì)馬鈴薯葉片進(jìn)行傷害處理后，研究發(fā)現(xiàn) Lox3基因的表達(dá)量在0.5 h后迅速增強(qiáng)，而 Lox2基因的表達(dá)量在24 h內(nèi)呈遞增趨勢(shì)，從而說(shuō)明了植物體內(nèi)不同的Lox基因在應(yīng)對(duì)逆境生物脅迫時(shí)扮演著不同的角色。脂肪氧化酶在普通小麥抗逆境方面的研究也取得一定的研究進(jìn)展。Ocampo等[23]通過(guò)研究小麥Lox活性與小麥植株抗病性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)小麥植株受到病原體侵染時(shí)，植物組織中Lox活性迅速提高，并刺激產(chǎn)生相應(yīng)的創(chuàng)傷素、植物二烯酸以及脫落酸等來(lái)阻止病原體進(jìn)一步入侵。張榮平等[24]在模擬干旱和高溫條件下研究冬小麥不同品種胚根脂氧合酶(Lox)活性變化，發(fā)現(xiàn)抗旱-抗熱性強(qiáng)的小麥品種胚根中Lox活性只有較小幅度的上升，而抗旱-抗熱性弱的品種Lox活性則有較大幅度的上升。說(shuō)明植物體內(nèi)Lox活性含量的變化情況與植物所在外界環(huán)境密切相關(guān)。本研究對(duì)控制小麥籽粒Lox活性主效基因 TaLox-B2和 TaLox-B3的表達(dá)模式以及對(duì)各種脅迫的響應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫和NaCl脅迫時(shí) TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)迅速上升，以增強(qiáng)植物對(duì)外界環(huán)境的敏感性，進(jìn)而對(duì)小麥植株起到保護(hù)作用，這與Ocampo等[23]和張榮平等[24]的研究結(jié)果基本一致；而在高溫脅迫時(shí)， TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，這與低溫和NaCl脅迫時(shí)的Lox基因的作用機(jī)制明顯不同，需進(jìn)一步深入研究；干旱脅迫時(shí)， TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量均較低，且沒(méi)有明顯規(guī)律，表明二者的表達(dá)可以與滲透脅迫無(wú)關(guān)，主要是離子脅迫誘導(dǎo)其表達(dá)。

[1]HE Z H,YANG J,ZHANG Y,etal.Pan bread and dry white Chinese noodle quality in Chinese winter wheats [J].Euphytica,2004,139(3):257-267.

[2]CRAWFORD A C,STEFANOVA K,LAMBE W,etal.Functional relationships of phytoene synthase 1 alleles on chromosome 7A controlling flour colour variation in selected Australian wheat genotypes [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2011,123(1):95-108.

[3]CHANG C,ZHANG H P,XU J,etal.Variation in two PPO genes associated with polyphenol oxidase activity in seeds of common wheat [J].Euphytica,2007,154(1-2):181-193.

[4]鄭文寅,汪 帆,司紅起,等.普通小麥籽粒LOX、PPO活性和類(lèi)胡蘿卜素含量變異及對(duì)全麥粉色澤的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(6):1087-1094.

ZHENG W Y,WANG F,SI H Q,etal.Variation of LOX and PPO activities and carotenoid content as well as their influence on whole flour color in common wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(6):1087-1094.

[5]BORRELLI G M,TROEEOLI A,FONZO N D,etal.Durum wheat lipoxygenase activity and other quality parameters that affect pasta color [J].CerealChemistry,1999,76(3):335-340.

[6]王 慧,鄭文寅,樊 宏,等.不同小麥品種籽粒中LOX活性及基因型和環(huán)境互作分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(1):11-14,19.

WANG H,ZHENG W Y,FAN H,etal.Lipoxygenase activity and its genotype and environment interactions for different wheat varieties [J].JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociation,2011,26(1):11-14,19.

[7]HART G E,LANGSTON P J.Chromosome location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat [J].Heredity,1977,39:263-277.

[8]VAN MECHELEN J R,SMITS M,DOUMA A C,etal.Primary structure of a lipoxygenase from barley grain as deduced from its cDNA sequence [J].BiochimicaetBiophysicaActa,1995,1254(2):221-225.

[9]CARRERA A,ECHENIQUE V,ZHANG W,etal.A deletion at the Lpx-B1 locus is associated with low lipoxygenase activity and improves pasta color in durum wheat(Triticumturgidumspp.durum) [J].JournalofCerealScience,2007,45(1):67-77.

[10]VERLOTTA A,SIMONE V D,MASTRANGELO A M,etal.Insight into durum wheat Lpx-B1:a small gene family coding for the lipoxygenase responsible for carotenoid bleaching in mature grains [J].BMCPlantBiology,2010,10:263.

[11]FENG B,DONG Z Y,XU Z B,etal.Molecular analysis of lipoxygenase (LOX) genes in common wheat and phylogenetic investigation of LOX proteins from model and crop plants [J].JournalofCerealScience,2010,52(3):387-394.

[12]FENG B,DONG Z Y,XU Z B,etal.Molecular characterization of a novel type of lipoxygenase(LOX) gene from common wheat(TriticumaestivumL.) [J].MolecularBreeding,2012,30(1):113-124.

[13]GENG H W,XIA X C,ZHANG L P,etal.Development of functional markers for a lipoxygenase gene TaLox-B1 on chromosome 4BS in common wheat [J].CropScience,2012,52(2):568-576.

[14]GARBUS I,SORESI D,ROMERO J,etal.Identification,mapping and evolutionary course of wheat lipoxygenase-1 genes located on the A genome [J].JournalofCerealScience,2013,58(2):298-304.

[15]ZHANG F Y,CHEN F,WU P P,etal.Molecular characterization of lipoxygenase genes on the short arm of chromosome 4B in Chinese bread wheat(TriticumaestivumL.) [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2015,128(8):1467-1479.

[16]南海波.小麥總RNA的提取[J].渤海大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,27(1):18-20.

NAN H B.Total RNA extraction from wheat [J].JournalofBohaiUniversity:NaturalScienceEdition,2006,27(1):18-20.

[17]胡群文,陳曉玲,張志娥,等.干種子高質(zhì)量總RNA的快速提取方法 [J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(3):360-363.

HU Q W,CHEN X L,ZHANG Z E,etal.A rapid extraction method of high quality total RNA from dry seeds [J].JournalofPlantGeneticResources,2010,11(3):360-363.

[18]LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod [J].Methods,2001, 25(4):402-408.

[19]FEUSSNER I,WASTERNACK C.The lipoxygenase pathway [J].AnnualReviewofPlantBiology,2002,53:275-297.

[20]HILDEBRAND D F,RODRIGUEZ J G,BROWN G C,etal.Peroxidative responses of leaves in two soybean genotypes injured by two spotted spider mites (Acari:Tetranychidae) [J].JournalofEconomicEntomology,1986,79(6):1459-1465.

[21]SHUKLE R H,MURDOCK L L.Lipoxygenase trypsin inhibitor,and lectin from soybeans:effects on larval growth of manducasexta (Lepidoptera:Sphingidae) [J].EnvironmentalEntomology,1983,12(3):787-791.

[22]ROYO J,VANCANNEYT G,PéREZ A G,etal.Characterization of three potato lipoxygenases with distinct enzymatic activities and different organ-specific and wound-regulated expression patterns [J].TheJournalofBiologicalChemistry,1996,271:21012-21019.

[23]OCAMPO C A,MOERSBACHER B,GRAMBOW H J.Increased lipoxygenase activity is involved in the hypersensitive response of wheat leaf cells infected with a rulent rust fungi or treated with fungal elicitor [J].ZeitschriftfürNaturforschungC,1986,41(5-6):559-563.

[24]張榮平,王振鎰,高俊風(fēng),等.小麥胚根脂氧合酶(LOX)活性變化與抗熱-抗旱性的關(guān)系[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,1992,10(4):81-85.

ZHANG R P,WANG Z Y,GAO J F,etal.Relation of LOX activity in wheat radicle with drought-heat resistance [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,1992,10(4):81-85.

Expression Analysis of Wheat Lipoxygenase Genes at Different Stress Conditions by Quantitative Real-Time PCR

ZHANG Fuyan1,2,CHEN Feng2,ZHANG Jianwei1,YANG Baoan1,FAN Jialin1,CHEN Xiaojie1,CHEN Yuntang1,CUI Long1

(1.Isotope Institute Co.,Ltd,Henan Academy of Sciences/Henan Key Laboratory of Nuclear Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450015,China; 2.Agronomy College,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Food Crops in Henan Province,Zhengzhou,Henan 450002,China)

To explore the biology function of wheat lipoxygenase genes under abiotic stress,we used the quantitative real-time PCR to deduce the expression profiling of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes in roots,stems,leaves and mature seeds of wheat and the expression analysis of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes in leaves under salt-stress treatment (100 mmol·L-1NaCl),low temperature-stress treatment (4 ℃),high temperature-stress treatment(42 ℃) and drought-stress treatment(20% PEG6000). The results showed that TaLox-B2 and TaLox-B3 genes could express in various tissues of wheat,including roots,stems,leaves and mature seeds. The expression of TaLox-B2 was mainly in the leaves and mature seeds,while TaLox-B3 was expressed primarily in the roots and leaves. The expression trends of TaLox-B2 and TaLox-B3 were similar to normal distribution and reached a peak at 3 h under high salinity. TaLox-B2 gene did not show a significant trendline under low temperature-stress treatment. The expression of TaLox-B3 gene was up-regulated at low temperature from 0 h to 6 h,and began to gradually decline afterwards. The expression of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes were down-regulated at high temperature-stress treatment from 0 h to 12 h.However,the TaLox-B2 and TaLox-B3 genes showed obviously different trendlines. TaLox-B2 and TaLox-B3 genes showed obviously different expression profiles,respectively,and their expression levels were very low,while there were no clear expression tendency were observed under the treatment of PEG6000. To summarize, TaLox-B2 and TaLox-B3 were mainly induced by salt-stress,but no specific relationship with PEG drought stress was found. In addition,the expression of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes have more obvious influence on the temperature changes,but the mechanism of the effect of the low temperature and high temperature are different.

TriticumaestivumL.; Stress; Lipoxygenase genes; Expression analysis

2016-03-09

2016-05-06

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(162300410169；152300410141)；河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(Z2010-01-04)；鄭州市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(121PZDGG071)

E-mail:zhangfuyan704@163.com

張建偉(E-mail:zjw10308@163.com)；楊保安(E-mail:yangcorn@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)09-1153-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1649.010.html