小麥β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆與酵母表達(dá)

夏凌峰，史 雪，楊昊虹，李春蓮，王中華，權(quán) 力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

?

小麥β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆與酵母表達(dá)

夏凌峰，史 雪，楊昊虹，李春蓮，王中華，權(quán) 力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

超長鏈脂肪酸是生物體內(nèi)眾多重要物質(zhì)的合成底物。KCS基因編碼β-酮脂酰CoA合成酶，該酶具有底物特異性，參與超長鏈脂肪酸延伸的縮合反應(yīng)，是超長鏈脂肪酸合成的限速步驟。為了探究小麥KCS基因在超長鏈脂肪酸合成中的功能，采用同源克隆的方法從小麥(TriticumaestivumL.) 中克隆出KCS基因后，利用生物信息學(xué)對(duì)其編碼序列進(jìn)行分析，并在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中對(duì)其進(jìn)行真核表達(dá)。結(jié)果表明，小麥 TaKCS6基因的開放閱讀框?yàn)? 287 bp，編碼428個(gè)氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III結(jié)構(gòu)域，屬于KCSs蛋白家族。序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，TaKCS6氨基酸序列與擬南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域上和活性位點(diǎn)保守。酵母表達(dá)結(jié)果顯示， TaKCS6基因編碼的蛋白參與C24以上超長鏈脂肪酸的延伸。

普通小麥；超長鏈脂肪酸；KCS基因；酵母表達(dá)

超長鏈脂肪酸(Very-long-chain fatty acids, VLCFAs)是指烴鏈長度超過18個(gè)碳原子的脂肪酸[1-3]，其在生物體內(nèi)具有多種生理功能，主要存在形式為：三酰甘油、甘油磷脂、鞘磷脂和蠟質(zhì)[4]。在植物體中，超長鏈脂肪酸主要以三酰甘油的形式作為儲(chǔ)藏能源存在于種子中[1, 5-6]。甘油磷脂和鞘磷脂是生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分，并且作為信號(hào)分子參與生物體內(nèi)的生命活動(dòng)[7]。此外，超長鏈脂肪酸是構(gòu)成植物表皮蠟質(zhì)的前體物質(zhì)[2]，蠟質(zhì)可以保護(hù)植物免受包括干旱、冷害、空氣污染、紫外光照射、病菌侵染等多種逆境脅迫的傷害[8]。

超長鏈脂肪酸的生物合成分為兩個(gè)階段，首先在質(zhì)體中經(jīng)過從頭合成的16碳與18碳脂肪酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的脂肪酸延伸酶復(fù)合體(Fatty acid elongase complex)，然后16碳與18碳脂肪酸經(jīng)過縮合、還原、脫水和再還原4個(gè)步驟后，形成增加了2個(gè)碳原子的超長鏈脂肪酸[2, 9]。其中，縮合反應(yīng)為限速步驟，參與該反應(yīng)的β-酮脂酰CoA合成酶由KCS基因編碼，具有底物特異性，決定了超長鏈脂肪酸的碳鏈長度[1, 10-11]。擬南芥KCS家族有21個(gè)基因，其中 AtFAE1/AtKCS18是第1個(gè)從擬南芥中克隆出來的KCS基因[10]，突變體表現(xiàn)出種子中超長鏈脂肪酸含量大大降低[12]。 AtKCS1與 AtFAE1/AtKCS18序列相似性很高，參與蠟質(zhì)的生物合成，當(dāng)其被沉默時(shí)，導(dǎo)致蠟質(zhì)中的C26和C30的醇和醛含量降低[13]。 AtKCS2/DAISY和 AtKCS20參與C20到C22超長鏈脂肪酸的延伸[14]，參與植物角質(zhì)層蠟質(zhì)和根木栓質(zhì)的合成[15]。 AtFDH/AtKCS10主要在花和幼嫩葉片中表達(dá)，參與表皮細(xì)胞中超長鏈脂肪酸的合成[16]。 AtKCS6/AtCer6/AtCUT1主要負(fù)責(zé)碳鏈長度在C24以上脂肪酸的合成，參與莖及花粉表皮蠟質(zhì)的合成[17-18]。此外，在番茄中 AtKCS6的同源基因 SlCer6的突變導(dǎo)致表皮蠟質(zhì)中C28以上的組分含量顯著減少，果實(shí)的失水速率增快[19]。在棉花中 AtCer6同源基因的突變引起C26以上的超長鏈脂肪酸含量的減少，致使棉纖維伸長受到抑制[20]。因此，對(duì)KCS基因的克隆與功能分析有助于闡明植物超長鏈脂肪酸的生物合成機(jī)理。

小麥?zhǔn)侵饕募Z食作物，其穩(wěn)產(chǎn)與高產(chǎn)具有重要意義。超長鏈脂肪酸作為生物體內(nèi)眾多物質(zhì)的共同合成底物，其合成與降解對(duì)生物體正常生長發(fā)育至關(guān)重要。小麥葉片的表皮蠟質(zhì)含量與保水性相關(guān)，含量越高，葉片保水性越好[21]。在水稻中研究表明，調(diào)節(jié)脂肪代謝的基因突變會(huì)影響花粉的正常生長，造成花粉不育[22]。Schneiter等[23]在酵母中的研究表明，C26的磷脂酰肌醇含量的減少，造成核孔的缺失。小麥KCS基因的功能研究還比較少，通過克隆和功能分析小麥KCS基因，能夠深入了解小麥脂質(zhì)代謝和蠟質(zhì)合成中超長鏈脂肪酸的合成。本研究擬通過同源克隆方法從小麥中克隆出KCS基因后，利用生物信息學(xué)對(duì)其編碼序列進(jìn)行分析，并將其轉(zhuǎn)化到酵母中進(jìn)行表達(dá)，以期為小麥超長鏈脂肪酸的生物合成提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材 料

試驗(yàn)材料為普通六倍體小麥中國春(Chinese Spring)，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室。

1.2方 法

1.2.1小麥總RNA的提取

于苗期四葉期取小麥葉片，使用植物RNA小量提取試劑盒(Magen，R4151)提取總RNA。

1.2.2cDNA第一鏈的合成

取1 ng總RNA，按照PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3小麥KCS基因的克隆

根據(jù)擬南芥中的KCS基因序列，分別在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl (http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast)的小麥數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn搜索，尋找相似性較高的片段。利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物F1/R1(F1：5′-GAAGGTCACATCATCATCATC-3′；R1：5′-TTCTGTTCCTATAGCCATTTA-3′)， 交由上海生工(Sangon)生物技術(shù)公司合成。以1.2.2中得到的cDNA為模板，利用引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(25 μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL、dNTPs(2 mmol·L-1)5 μL、KOD FX(1.0 U·μL-1)0.3 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，31個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在160 V、200 mA的條件下，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收并純化(TIANGEN，DP214)目的片段，加入rTaq酶和dATP，72 ℃溫浴30 min，完成末端加A。將目的片段連接于pMD18-T載體(TaKaRa)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，搖菌后吸取100 μL菌液寄往上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.2.4序列分析

利用DNAStar軟件包的EditSeq程序和ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找最大的開放閱讀框；在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對(duì)核苷酸序列進(jìn)行BLASTp分析；運(yùn)用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析；運(yùn)用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；運(yùn)用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；運(yùn)用DNAMAN 8.0軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)；使用MEGA 6.0構(gòu)建基因進(jìn)化樹。

1.2.5酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與酵母表達(dá)

根據(jù)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)載體pYES2和目的基因的DNA序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物F2/R2(F2：5′-CCC AAGCTTAAAAAAATGTCTATGGTCACCGT GCCCGT T-3′，下劃線處為Hind III酶切位點(diǎn)，引入ATG；R2：5′-CCGGAATTCCAGTTAATG CTTGAAAACATCAGT-3′，下劃線處為EcoR I酶切位點(diǎn))。以pMD18-T- TaKCS6為模板，利用引物F2/R2擴(kuò)增KCS基因完整的編碼區(qū)。將擴(kuò)增的片段經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切后，用T4 DNA連接酶連接到經(jīng)過相同雙酶切的pYES2載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過菌落PCR鑒定和測序鑒定，確定目標(biāo)基因的序列無突變后，將重組載體pYES2- TaKCS6和空載體pYES2質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSc1菌株中，利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura，北京泛基諾)篩選陽性菌株。酵母的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)參照Denic和Weissman[11]。

1.2.6脂肪酸的抽提及其色譜分析

將經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的酵母菌體進(jìn)行裂解，抽提脂肪酸，經(jīng)甲醇酯化反應(yīng)后，進(jìn)行氣相質(zhì)譜檢測。甲酯化反應(yīng)如下：20 mL誘導(dǎo)菌液中加入20 mL 0.9%的NaCl，混勻，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入2 mL 2.5%硫酸-甲醇溶液，80 ℃水浴1.5 h。冷卻后吸取上層抽提液，置于玻璃容器中，過濾后用氮?dú)獯蹈?，加入正己烷回溶混合物，轉(zhuǎn)移至色譜分析瓶中。利用GCMS-QP 2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)反應(yīng)后的脂肪酸進(jìn)行檢測。毛細(xì)管色譜柱為RTX-1 (60 m×0.32 mm, 0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為280 ℃。毛細(xì)管柱柱箱從50 ℃開始升溫，保持2 min；然后以8 ℃·min-1的速度升溫至320 ℃，保持10 min。載氣為高純氮?dú)?，試?yàn)使用的分流比是2∶1，檢測器溫度為320 ℃，氫氣流速為40 mL·min-1，空氣流速為400 mL·min-1，進(jìn)樣量為1 μL。通過目的峰的面積計(jì)算超長鏈脂肪酸的相對(duì)含量。

2　結(jié)果與分析

2.1 TaKCS6基因的克隆及其序列分析

利用特異性引物F1/R1對(duì)中國春cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后，得到1條大小約1 300 bp的特異性條帶(圖1)。對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，將回收到的目的片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，菌落PCR初步鑒定后，選取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，3個(gè)陽性克隆序列一致，目的片段推測的編碼區(qū)全長為1 287 bp，編碼428個(gè)氨基酸殘基，將該基因命名為 TaKCS6。

M：DNA Marker DL2000(TaKaRa)；1～3：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DNA Marker DL2000(TaKaRa)；1-3:PCR products.

圖1 TaKCS6基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR amplification of TaKCS6 gene

2.2TaKCS6蛋白的理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

ProtParam對(duì)TaKCS6蛋白基本理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白的相對(duì)分子量為47 280.90，理論等電點(diǎn)pI為8.96，半衰期為30 h，在280 nm處消光系數(shù)為0.83，不穩(wěn)定指數(shù)為38.50，親脂性為92.59。說明該蛋白為穩(wěn)定、親脂性蛋白。

結(jié)構(gòu)功能域分析表明，TaKCS6蛋白屬于β-酮脂酰輔酶A合成酶 (KCSs，IPR012392)家族成員，含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶(PF08392, 48～302 aa)和C末端3-?；鵄CP合酶III (PF08541, 318～399 aa)結(jié)構(gòu)域(圖2)，該結(jié)構(gòu)域?yàn)镵CS蛋白功能所必需?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明，TaKCS6蛋白具有明顯的跨膜區(qū)(圖3)，說明該蛋白可能定位于膜上。

FAE1_CUT1_RppA：III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶；ACP_syn_III_C：3-酰基ACP合酶III；橫線下方數(shù)字表示氨基酸位置。

FAE1_CUT1_RppA：FAE1/Type III polyketide synthase-like protein; ACP_syn_III_C:3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)] synthase III, C-terminal; Numbers under the line indicate the position of amino acids.

圖2TaKCS6蛋白的功能域預(yù)測

Fig.2Predicted function domains of TaKCS6 protein

圖3　TaKCS6蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測

2.3TaKCS6蛋白的進(jìn)化分析與序列比對(duì)分析

利用克隆到的 TaKCS6基因編碼的氨基酸序列與擬南芥及其他6個(gè)近緣物種KCS基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，這14條序列主要聚類成兩大類， KCS6同源基因聚為一類，其他的KCS基因聚為一類。在 KCS6同源基因分支中，來源于不同植物的 KCS6基因聚為兩類，一類為雙子葉植物擬南芥 AtKCS6/AtCer6/AtCUT1，另一類為單子葉植物。在單子葉植物分支中，小麥 TaKCS6與烏拉爾圖小麥 TuKCS6和節(jié)節(jié)麥 AeKCS6聚為一類。

利用DNAMAN 8軟件對(duì)來源于不同物種的 KCS6基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果(圖5)表明， TaKCS6基因編碼的氨基酸序列與其他物種的 KCS6基因編碼的氨基酸序列在III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶(PF08392，圖5 I)和C末端3-?；鵄CP合酶III (PF08541，圖5II)功能結(jié)構(gòu)域上具有一定的相似性。TaKCS6氨基酸序列與擬南芥AtKCS6氨基酸序列一致性為50.00%，與烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、高粱和水稻相似性分別為71.54%、72.73%、52.77%和52.96%。TaKCS6氨基酸序列與擬南芥AtKCS6氨基酸序列的第225位半胱氨酸殘基、第388位、第392位與第421位的組氨酸殘基和第425位的天冬酰胺殘基具有一致性，而這五個(gè)殘基與第304位的組氨酸殘基是擬南芥AtKCS6蛋白正常催化所必需的活性位點(diǎn)。

At:擬南芥；Ae:節(jié)節(jié)麥；Bn:甘藍(lán)型油菜；Hv:高粱；Os:水稻；Tu:烏拉爾圖小麥；Ta:普通小麥；Zm:玉米。下同。

At:Arabidopsisthaliana；Ae:AegilopstauschiiCoss.；Bn:BrassicanapusL.；Hv:HordeumvulgareL.；Os:Oryzasativa；Tu:Triticumurartu；Ta:TriticumaestivumL.；Zm:ZeamaysL..The same as below.

圖4不同植物中KCS基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

Fig.4Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences ofKCSgenes in different plants

I和II分別為AtKCS6蛋白的FAE1_CUT1_RppA(PF08392)與ACP_syn_III_C (PF08541)功能結(jié)構(gòu)域；1～6分別表示 AtKCS6蛋白的C225、H304、H388、H392、H421和N425活性位點(diǎn)。

I and II:Function domains FAE1_CUT1_RppA(PF08392) and ACP_syn_III_C (PF08541) of AtKCS6 protein;1-6:Activity sites C225, H304, H388, H392, H421 and N425 of AtKCS6 protein.

圖5TaKCS6氨基酸序列與其他植物的KCS6氨基酸序列的比對(duì)

Fig.5Multiple alignment of KCS6 amino-acid sequences inTriticumaestivumL. and other plants

2.4酵母表達(dá)載體pYES2- TaKCS6的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)

將帶酶切位點(diǎn)的 TaKCS6基因片段與環(huán)狀的pYES2載體分別進(jìn)行雙酶切后，利用T4連接酶連接，即目的片段插入到半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子pGAL1與終止子CYC1 TT間(圖6)。將構(gòu)建好的pYES2- TaKCS6載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)雙酶切(圖7)與測序確保閱讀框的正確性后，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVSc1菌株中，篩選得到單克隆陽性菌株。利用尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura)與半乳糖培養(yǎng)酵母并誘導(dǎo) TaKCS6基因的表達(dá)。

2.5氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析酵母超長鏈脂肪酸的組成

提取經(jīng)誘導(dǎo)的酵母中的脂肪酸后，使用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)甲酯化的脂肪酸進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖8、圖9)表明，與空載體相比， TaKCS6基因表達(dá)產(chǎn)物中，棕櫚酸(16∶0)相對(duì)含量由70.60%減少到了58.70%， 二十六酸(26∶0)相對(duì)含量由3.06%增加到了12.42%，并且檢測到了二十八酸(28∶0)的積累，相對(duì)含量為2.32%。證明該基因的編碼產(chǎn)物參與了超長鏈脂肪酸的延伸，使得C26以下的超長鏈脂肪酸向C26及以上的超長鏈脂肪酸延伸。鑒于二十六酸的相對(duì)含量顯著增加，推測TaKCS6蛋白的特異性反應(yīng)底物為C24的超長鏈脂肪酸。

圖6　 酵母表達(dá)載體pYES2- TaKCS6的構(gòu)建

M：DNA Marker DL5000(TaKaRa)；1～4：雙酶切產(chǎn)物。

M：DNA Marker DL5000(TaKaRa)；1-4：Products of double enzyme digestion.

圖7pYES2- TaKCS6的雙酶切鑒定

Fig.7Double enzyme digestion of pYES2- TaKCS6

16∶0：棕櫚酸；18∶0：硬脂酸；20∶0：花生酸；22∶0：山萮酸；24∶0：木蠟酸；26∶0：二十六酸；28∶0：二十八酸。下同。

16∶0：Palmitic acid； 18∶0:Stearic acid； 20∶0:Arachic acid； 22∶0：Behenic acid；24∶0：Lignoceric acid；26∶0：Hexacosanic acid；28∶0：Octacosanoic acid. The same as below.

圖8酵母超長鏈脂肪酸的相對(duì)含量

Fig.8Relative content of very-long-chain

fatty acids in yeast

圖9　GC-MS分析酵母超長鏈脂肪酸成分

3　討 論

KCS基因作為VLCFAs合成過程中的關(guān)鍵基因，對(duì)VLCFAs的碳鏈長度有著決定性的作用[10-11]，并參與植物體內(nèi)眾多重要物質(zhì)的合成[4]。目前，在擬南芥、棉花、番茄、水稻等植物中克隆得到了部分KCS基因[10, 14, 16-17, 19, 24-25]，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析。本研究通過同源克隆方法，克隆得到了含有完整編碼序列的小麥 TaKCS6基因，序列分析表明，開放閱讀框全長為1 287 bp，可編碼428個(gè)氨基酸殘基，具有親脂性。結(jié)構(gòu)域分析表明，TaKCS6蛋白屬于β-酮脂酰輔酶A合成酶 (KCSs，IPR012392)家族，分別在N端和C端含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和3-?；鵄CP合酶III結(jié)構(gòu)域，并且在N段存在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，這都與Hooker等[17]和Millar等[18]所克隆得到的 AtKCS6基因所編碼的蛋白序列相吻合，推測TaKCS6蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這有待進(jìn)一步的研究。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，不同物種中的 KCS6基因聚為一類，其中小麥的 KCS6基因與烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、水稻和高粱的 KCS6基因聚為了一類，證明這些物種之間該基因在進(jìn)化上保持一致。

蛋白序列的多重比對(duì)表明，KCS6在關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域處，序列較為保守，都存在KCS蛋白所必需的III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和3-?；鵄CP合酶III結(jié)構(gòu)域，TaKCS6蛋白序列和其他物種的KCS6蛋白與AtKCS6蛋白的5個(gè)及以上活性位點(diǎn)的氨基酸殘基相同，表明這些蛋白的功能存在一致性，證明這些蛋白序列都具有催化合成超長鏈脂肪酸的功能。這與Yu等[24]的研究結(jié)果相符，表明不同植物的KCS基因都存在著極端保守的序列，這是KCS基因發(fā)揮功能所必須的。 TaKCS6基因在酵母中的表達(dá)結(jié)果表明，TaKCS6蛋白能夠催化合成C24以上的超長鏈脂肪酸，這與Tresch等[26]在酵母中對(duì)AtKCS6表達(dá)產(chǎn)物的研究結(jié)果一致。

Xiao等[27]研究表明，赤霉素能夠使得部分棉花的KCS基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生更多的超長鏈脂肪酸，影響乙烯的合成最終影響纖維的生長。Qin等[20]研究表明，超長鏈脂肪酸能激活乙烯的合成途徑，影響棉花纖維和擬南芥莖稈的伸長。而在小麥中，Hu等[28]發(fā)現(xiàn)ABA與PEG誘導(dǎo)KCS基因的表達(dá)，表明小麥KCS基因的表達(dá)受到激素的誘導(dǎo)，參與植物的逆境響應(yīng)。在擬南芥21個(gè)KCS基因中，有6個(gè)KCS基因[10,13-18]參與蠟質(zhì)的合成，蠟質(zhì)對(duì)植物的保水抗旱性有著重要的影響[8]。小麥中葉片表皮蠟質(zhì)的主要成分為C28脂肪醇[29]，推測TaKCS6可能參與小麥表皮蠟質(zhì)的合成。

以上研究結(jié)果表明，雖然小麥 TaKCS6基因與擬南芥 AtKCS6基因的編碼蛋白序列一致性不是很高，但是，在兩個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)和活性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基一致性較好，表明TaKCS6蛋白能夠正常的發(fā)揮催化作用。在酵母表達(dá)中，也證明了該蛋白具有催化合成C24以上鏈長的超長鏈脂肪酸的功能。因此，TaKCS6的克隆與酵母表達(dá)對(duì)揭示小麥KCS基因的功能具有重要意義。本研究為進(jìn)一步研究小麥KCS的功能及其表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。

[1]MILLAR A A,KUNST L.Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme [J].PlantJournal,1997,12(1):121-131.

[2]KUNST L,SAMUELS A L.Biosynthesis and secretion of plant cuticular wax [J].ProgressinLipidResearch,2003,42(1):51-80.

[4]BACH L,FAURE J D.Role of very-long-chain fatty acids in plant development,when chain length does matter [J].ComptesRendusBiologies,2010,333(4):361-370.

[5]VANHERCKE T,WOOD C C,STYMNE S,etal.Metabolic engineering of plant oils and waxes for use as industrial feedstocks [J].PlantBiotechnologyJournal,2013,11(2):197-210.

[6]LEONARD A E,PEREIRA S L,SPRECHER H,etal.Elongation of long-chain fatty acids [J].ProgressinLipidResearch,2004,43(1):36-54.

[7]RAFFAELE S,LEGER A,ROBY D.Very long chain fatty acid and lipid signaling in the response of plants to pathogens [J].PlantSignaling&Behavior,2009,4(2):94-99.

[8]SEO P J,LEE S B,SUH M C,etal.The MYB96 transcription factor regulates cuticular wax biosynthesis under drought conditions inArabidopsis[J].PlantCell,2011,23(3):1138-1152.

[9]HASLAM T M,KUNST L.Extending the story of very-long-chain fatty acid elongation [J].PlantScience,2013,210:93-107.

[10]JAMES D W,LIM E,KELLER J,etal.Directed tagging of theArabidopsisFATTY ACID ELONGATION1 (FAE1) gene with the maize transposon activator [J].PlantCell,1995,7(3):309-319.

[11]DENIC V,WEISSMAN J S.A molecular caliper mechanism for determining very long-chain fatty acid length [J].Cell,2007,130(4):663-677.

[12]KUNST L,TAYLOR D C,Underhill E W.Fatty-acid elongation in developing seeds ofArabidopsisthaliana[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,1992,30(4):425-434.

[13]LEE S B,SUH M C.Recent advances in cuticular wax biosynthesis and its regulation inArabidopsis[J].MolecularPlant,2013,6(2):246-249.

[14]LEE S B,JUNG S J,GO Y S,etal.TwoArabidopsis3-ketoacyl CoA synthase genes, KCS20 and KCS2/DAISY,are functionally redundant in cuticular wax and root suberin biosynthesis,but differentially controlled by osmotic stress [J].ThePlantJournal,2009,60(3):462-475.

[15]FRANKE R,H?FER R,BRIESEN I,etal.TheDAISYgene fromArabidopsisencodes a fatty acid elongase condensing enzyme involved in the biosynthesis of aliphatic suberin in roots and the chalaza-micropyle region of seeds [J].ThePlantJournal,2009,57(1):80-95.

[16]PRUITT R E,VIELLE-CALZADA J P,PLOENSE S E,etal.FIDDLEHEAD,a gene required to suppress epidermal cell interactions inArabidopsis,encodes a putative lipid biosynthetic enzyme [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(3):1311-1316.

[17]HOOKER T S,MILLAR A A,KUNST L.Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2002,129(4):1568-1580.

[18]MILLAR A A,CLEMENS S,ZACHGO S,etal. CUT1,anArabidopsisgene required for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility,encodes a very-long-chain fatty acid condensing enzyme [J].PlantCell,1999,11(5):825-838.

[19]SMIRNOVA A,LEIDE J,RIEDERER M.Deficiency in a very-long-chain fatty acid beta-ketoacyl-coenzyme a synthase of tomato impairs microgametogenesis and causes floral organ fusion [J].PlantPhysiology,2013,161(1):196-209.

[20]QIN Y M,HU C Y,PANG Y,etal.Saturated very-long-chain fatty acids promote cotton fiber andArabidopsiscell elongation by activating ethylene biosynthesis [J].PlantCell,2007,19(11):3692-3704.

[21]黃 玲,張正斌,崔玉亭,等.小麥葉片蠟質(zhì)含量與水分利用效率和產(chǎn)量的關(guān)系[J].麥類作物學(xué)報(bào),2003,23(3):41-44.

HUANG L,ZHANG Z B,CUI Y T,etal.Relationship between wax content and water use efficiency of leaf and yield in wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2003,23(3):41-44.

[22]AYA K,UEGUCHI-TANAKA M,KONDO M,etal.Gibberellin modulates anther development in rice via the transcriptional regulation of GAMYB [J].PlantCell,2009,21(5):1453-1472.

[23]SCHNEITER R,BRUGGER B,AMANN C M,etal.Identification and biophysical characterization of a very-long-chain-fatty-acid-substituted phosphatidylinositol in yeast subcellular membranes [J].BiochemicalJournal,2004,381(3):941-949.

[24]YU D,RANATHUNGE K,HUANG H,etal.WaxCrystal-SparseLeaf1 encodes a β-ketoacyl CoA synthase involved in biosynthesis of cuticular waxes on rice leaf [J].Planta,2008,228(4):675-685.

[25]JUNG K H,HAN M J,LEE D,etal.Wax-deficientanther1 is involved in cuticle and wax production in rice anther walls and is required for pollen development [J].PlantCell,2006,18(11):3015-3032.

[26]TRESCH S,HEILMANN M,CHRISTIANSEN N,etal.Inhibition of saturated very-long-chain fatty acid biosynthesis by mefluidide and perfluidone,selective inhibitors of 3-ketoacyl-CoA synthases [J].Phytochemistry,2012,76:162-171.

[27]XIAO G H,WANG K,HUANG G,etal.Genome-scale analysis of the cottonKCSgene family revealed a binary mode of action for gibberellin A regulated fiber growth [J].JournalofIntegrativePlantBiology,2016,58(6):577-589.

[28]HU X,ZHANG Z,FU Z,etal.Significance of a β-ketoacyl-CoA synthase gene expression for wheat tolerance to adverse environments [J].BiologiaPlantarum,2010,54(3):575-578.

[29]張蕓蕓,李婷婷,孫瑜琳,等.小麥葉片表皮蠟質(zhì)成分及含量分析[J].麥類作物學(xué)報(bào),2014,34(7):963-968.

ZHANG Y Y,LI T T,SUN Y L,etal.Analysis on composition and content of leaf cuticular waxes of wheat(Triticumaestivum)detected by GC-MS [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(7):963-968.

Cloning and Yeast Expression of 3-ketoacyl-coenzyme Synthase (KCS) Gene in Wheat(TriticumaestivumL.)

XIA Lingfeng, SHI Xue, YANG Haohong, LI Chunlian, WANG Zhonghua, QUAN Li

(College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Very-long-chain fatty acids (VLCFAs) are the synthetic substrates for many important substances in the living body. TheKCSgene encodes β-ketoacyl CoA synthase, a rate-limiting enzyme in the synthesis of VLCFAs, catalyzing the condensation reaction of VLCFAs elongation process. In order to identify the function ofKCSgene in biosynthesis of VLCFAs, the homologous cloning strategy was used to cloneKCSgene from wheat(TriticumaestivumL.), the coding sequence was analysed by a series of bioinformatics software and expressed in yeast(Saccharomycescerevisiae).The result showed that the open reading frame of TaKCS6 gene is 1 287 bp, which encodes 428 amino acid residues. Functional domain analysis predicted that TaKCS6 protein belonging to KCSs protein family, contains FAE1_CUT1_RppA and ACP_syn_III_C domains. The amino acid sequences of TaKCS6, AtKCS6 and KCS6 from other plants are conservative in two functional domains and activity sites. Yeast expression of TaKCS6 showed that encoded protein is involved in the elongation of VLCFAs more than 24 carbons.

TriticumaestivumL.; Very-long-chain fatty acids;KCSgene;Yeast expression

2016-05-12

2016-08-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471568)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014KCT-25)；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種項(xiàng)目；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)一般項(xiàng)目(QN2013006)

E-mail：laughingxia@126.com

王中華(E-mail:zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn)；權(quán) 力(E-mail:lquan@nwafu.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)09-1121-09

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1648.002.html