• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性研究*

    2016-10-27 09:58:18朱思穎陳丹琦梁家銘李海新柯德森
    廣州化工 2016年18期
    關(guān)鍵詞:龍須菜寡糖淡水

    朱思穎,陳丹琦,梁家銘,李海新,李 蓉,柯德森

    (廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510006)

    ?

    腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性研究*

    朱思穎,陳丹琦,梁家銘,李海新,李蓉,柯德森

    (廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510006)

    在不同溫度、供氧量、鹽度及處理時間條件下,對腐爛龍須菜的還原糖含量、瓊膠酶活力及分子量進(jìn)行分析,以探究龍須菜腐爛過程中自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性,并分析影響其水解程度因素。實驗表明,腐爛龍須菜中有一種活性物質(zhì)能降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖。35 ℃、淡水半?yún)捬酢⒏癄€處理96 h時的龍須菜產(chǎn)瓊膠寡糖含量為“完好”樣品近6倍,酶活力是0 h酶活力的約8.2倍。該條件下處理48 h的腐爛龍須菜的小分子瓊膠寡糖的相對含量達(dá)98.71%。

    龍須菜;腐爛;瓊膠酶;瓊膠寡糖;分子量

    瓊膠在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛,卻不能人工合成,只能從產(chǎn)瓊膠紅藻中提取。而龍須菜是江蘺屬海藻中提取瓊膠質(zhì)量最好的種類之一,其瓊膠含量達(dá)20%~25%,瓊膠凝膠強(qiáng)度可達(dá)1000 g·cm-2以上。

    瓊膠在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、日用化工、輕工業(yè)等方面有廣泛的應(yīng)用[1]。但由于瓊膠凝動性強(qiáng),不容易被吸收,因此在應(yīng)用方面受到很大限制。而瓊膠經(jīng)酸水解后主要形成由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成的寡糖,即瓊膠寡糖,水溶性好,有利于人體吸收,是一種新型的海洋功能性低聚糖[2],因此瓊膠寡糖的研究成為新的熱點。

    目前瓊膠寡糖雖然在食品、醫(yī)藥、生物等許多方面有廣闊應(yīng)用前景,但瓊膠寡糖至今還沒有進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)[3-4]。而到目前為止,實現(xiàn)降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖的瓊膠酶工業(yè)化生產(chǎn)的菌株只有大西洋假單胞菌,其產(chǎn)品來自于Sigma公司,價格昂貴,而我國尚沒有瓊膠酶的產(chǎn)品[5-8]。

    本實驗充分利用低成本的腐爛龍須菜,用單因素法探究腐爛龍須菜的天然瓊膠酶降解瓊膠產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性及將腐爛龍須菜不同溫度、供氧量、海水與淡水、時間等條件腐爛處理下對瓊膠寡糖含量進(jìn)行對比研究,目的是探究較高產(chǎn)量的應(yīng)用價值高的瓊膠寡糖生產(chǎn)的最適條件,因此經(jīng)濟(jì)利用價值十分高。

    1 實 驗

    1.1實驗材料和試劑

    新鮮龍須菜:2016年1月購于廣東省南澳島,用清水沖洗干凈后用海水浸泡、氧氣泵供氧備用。海水[9]:每100 mL水含3.5 g海鹽配制。3,5-二硝基水楊酸[10-11]:精確稱取3,5-二硝基水楊酸40 g,溶于800 mL濃度為2 mol·L-1的NaOH溶液中,加入2000 mL蒸餾水,再加入1200 g的酒石酸鉀鈉,待溶解后用蒸餾水定容至4000 mL。Tris-HCl緩沖液。0.2%瓊膠溶液:瓊脂粉,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,Tris-HCl緩沖液溶解。

    1.2培養(yǎng)環(huán)境因素對腐爛龍須菜的處理

    1.2.1溫度處理

    稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗,用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次),平均分成3份均勻置于3個大小一致干凈燒杯中,分別標(biāo)志為:“損傷25 ℃”、“損傷35 ℃”、“損傷45 ℃”。隔24 h測一次還原糖含量,共測3次。(對照為海水浸泡、氧氣泵供氧的備用龍須菜,測量時標(biāo)志為“完好”,以下簡寫為“完好”龍須菜。)

    1.2.2供氧量、海水與淡水處理

    在溫度處理的結(jié)果的基礎(chǔ)上,選出合適的溫度進(jìn)行如下操作:稱取240 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗,用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(200次),平均分成6份后均勻置于6個大小一致的干凈燒杯中,其中3個燒杯中加入600 mL淡水,另外3個加入配制好的600 mL海水,從海水和淡水處理的燒杯中各取3個燒杯分別用保鮮膜密封、敞開、用氧氣泵供氧,用于提供利于海水厭氧、淡水厭氧、海水半?yún)捬酢⒌雲(yún)捬?、海水好氧、淡水好氧的微生物生長環(huán)境。測定腐爛培養(yǎng)24 h和48 h的還原糖含量以確定最適條件。(對照 “完好”龍須菜)

    1.2.3最適培養(yǎng)時間實驗

    以上兩實驗得出的最適條件為基礎(chǔ),重新稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗,用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次)后適宜條件培養(yǎng),在腐爛培養(yǎng)時間為15 h、24 h、40 h、49 h、64 h、73 h、87 h、96 h時測定腐爛龍須菜樣品和“完好”龍須菜還原糖含量。(對照為 “完好”龍須菜)

    1.3腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力測量[12]

    稱取約100 g新鮮龍須菜材料用蒸餾水沖洗,用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜,置于干凈的燒杯中,加淡水浸泡龍須菜至剛好覆蓋,分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、64 h、96 h、108 h、120 h、132 h取提取液與瓊膠溶液混合(提取液:0.2%瓊膠溶液=8:2)后,馬上取0.5 mL提取液與瓊膠溶液的混合液于3支有刻度的試管中,測定還原糖OD值。剩下的混合液置于培養(yǎng)箱中酶解24 h后測定酶解后的還原糖OD值。以酶解前后還原糖OD值的變化量衡量酶活力的大小。

    還原糖OD值測定方法如下:取0.5 mL溶液,加入0.5 mL蒸餾水后加入2 mL DNS,煮沸10 min,冷卻,定容到7.5 mL,在520 nm下測吸光度,依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算粗酶活。以反應(yīng)體系中1 min產(chǎn)生0.001 μg還原糖所加入的酶量為一個活力單位。

    1.4龍須菜還原糖含量的測定[10-11]

    將龍須菜分別稱取10 g于燒杯中,用75%酒精消毒過的剪刀剪碎至各份龍須菜的剪碎程度接近,用研缽研磨充分形成漿,分別加入100 mL蒸餾水。置于100 ℃水浴鍋水浴30 min,攪拌,真空抽濾,保留濾液。每一份濾液取分別取1 mL至3支有刻度的試管中,并加入2 mL DNS溶液,100 ℃水浴煮沸10 min以后,定容到7.5 mL,用分光光度計在520 nm波長下比色測定光密度。

    1.5還原糖的分子量鑒定[13-18]

    取樣品5 mL,加入50 mL蒸餾水稀釋,加熱并攪拌使其充分溶解,冷卻至室溫后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。利用凝膠過濾GPC-HPLC (島津LC20A,日本島津公司)進(jìn)行分子量范圍測定,GPC色譜柱RBL2054;流動相為純凈水,使用前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,流速1 mL·min-1;柱溫30 ℃,示差折光檢測器溫度30 ℃;進(jìn)樣量:9 μL。

    1.6實驗數(shù)據(jù)處理

    以上實驗重復(fù)次數(shù)均為3,取平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE),實驗結(jié)果表示為:平均值 ±SE。

    2 結(jié)果與討論

    2.1培養(yǎng)溫度對龍須菜還原糖產(chǎn)量的影響

    圖1可知,任一時刻下25 ℃、35 ℃、45 ℃下腐爛龍須菜的還原糖含量均比無損傷腐爛處理的龍須菜的還原糖含量高,且35 ℃與45 ℃下培養(yǎng)下的還原糖含量更高,這與梅建鳳等[3]的研究結(jié)果接近,其中45 ℃培養(yǎng)的腐爛龍須菜24~72 h時還原糖含量上升較快,72 h時還原糖含量為24 h時的2.8倍,25 ℃、35 ℃下培養(yǎng)的腐爛龍須菜在48~72 h之間還原糖含量呈明顯上升趨勢;猜測與產(chǎn)瓊膠酶的微生物生長繁殖的最適溫度以及酶活性發(fā)揮的最適溫度有關(guān)??紤]到生產(chǎn)成本的因素,故選取35 ℃溫度下,進(jìn)行不同氧氣和水條件處理龍須菜的還原糖含量的環(huán)境條件探究。

    圖1 腐爛龍須菜在不同溫度下還原糖含量隨時間的變化曲線Fig.1 Change of reducing sugar content in rotten asparagus at different temperaturesvaried with time 注:圖中數(shù)據(jù)為三組平行實驗的平均值, 其中垂直短線表示實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差

    2.2溶氧量和水的鹽度對還原糖含量的影響

    圖2 不同氧氣和水條件處理還原糖含量隨時間的變化Fig.2 Change of reducing sugar content in different oxygen and water conditions

    由圖2可知,損傷腐爛處理的龍須菜培養(yǎng)48 h的還原糖含量均比24 h高,且條件為淡水、半?yún)捬鯒l件處理的腐爛龍須菜的還原糖含量最高,而淡水厭氧條件處理的腐爛龍須菜還原糖含量次之,可初步確定產(chǎn)瓊膠酶的微生物適于生長在淡水、半?yún)捬鯒l件,為半?yún)捬跷⑸?。因此選取淡水、半?yún)捬鯒l件為最適條件。

    2.3培養(yǎng)時間對龍須菜還原糖含量的影響

    圖3結(jié)果可知,35 ℃、淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)的腐爛龍須菜上還原糖含量明顯比對照的“完好”樣品的還原糖含量高;在15~40 h時,還原糖含量呈指數(shù)上升,64 h后趨于平穩(wěn)上升,在實驗時間內(nèi),培養(yǎng)時間為96 h的腐爛龍須菜上還原糖含量是對照樣品近6倍。因此35 ℃、淡水半?yún)捬醯臈l件更利于腐爛龍須菜上還原糖的積累。

    圖3 35 ℃、淡水、半?yún)捬跆幚砀癄€龍須菜還原糖含量隨時間的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content at 35 ℃ in fresh water and half rotten asparagus anaerobic treatment with time

    2.4腐爛龍須菜天然瓊膠酶活力驗證

    根據(jù)圖4結(jié)果可見,腐爛龍須菜的瓊膠酶活力在龍須菜腐爛0~96 h呈上升趨勢,96 h時酶活力達(dá)到最大后開始下降,其上升趨勢與圖3所示結(jié)果相吻合。培養(yǎng)時間為96 h提取液酶活力是0 h時約8.2倍。對0 h、48 h和96 h的酶活力進(jìn)行單因素方差分析,計算結(jié)果顯示,說明龍須菜腐爛處理0 h、48 h、96 h之間酶活力差異達(dá)極顯著水平, 96 h時的酶活力極顯著大于0 h和48 h,結(jié)果證明腐爛龍須菜的提取液中存在具瓊膠酶活性物質(zhì),促進(jìn)瓊膠水解產(chǎn)生瓊膠寡糖。

    圖4 腐爛龍須菜酶活力隨時間變化圖Fig.4 Gracilaria decay of enzyme activity over time

    2.5還原糖分子量測定結(jié)果

    將GPC高效液相色譜法所測還原糖的保留時間劃分為3部分:其中保留時間為3~6 min為大分子量,保留時間為7~10 min為中分子量,保留時間11~14 min部分為小分子量。其中,小分子量的還原糖可初步認(rèn)為是瓊膠寡糖。以各部分峰面積占總波峰面積的百分比(%)近似表示該部分分子量的可溶性糖的相對含量,結(jié)果如表1所示。對“完好”、海水半?yún)捬?、淡水半?yún)捬醯男》肿恿肯鄬窟M(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果為P=4×10-15<<0.01,說明不同條件處理腐爛龍須菜所得小分子量的相對含量的差異達(dá)極顯著水平,其中淡水半?yún)捬跆幚項l件下小分子量達(dá)到98.71%,為未經(jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍,證明淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)的瓊膠寡糖最多,與上述實驗結(jié)果均吻合。

    表1 液相色譜法測定不同條件處理腐爛龍須菜 所得分子量分布表Table 1 Liquid Chromatography different processing conditions rotting asparagus dish molecular weight distribution of the resulting table

    3 結(jié) 論

    本實驗探究了腐爛龍須菜是否能通過自水解生產(chǎn)應(yīng)用價值高的瓊膠寡糖,實驗證實了在適宜條件下,腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì),這種活性物質(zhì)使腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)海洋功能性低聚糖——瓊膠寡糖。

    本實驗通過改變溫度、溶氧量、水鹽度、培養(yǎng)時間等條件,測定腐爛龍須菜上還原糖的含量(通過測定還原糖OD值并繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=2.1802x,R2=0.9927)初步確定損傷腐爛處理能增大瓊膠寡糖的產(chǎn)量,進(jìn)一步通過腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力驗證,證實了腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì),這種活性物質(zhì)可能是一種瓊膠酶,能促進(jìn)水解瓊膠生產(chǎn)還原糖,而這種還原糖最終通過還原糖的分子量測定初步鑒定為瓊膠寡糖。本實驗探索并得到腐爛龍須菜生產(chǎn)瓊膠寡糖的相對合適條件,推測該條件適合產(chǎn)瓊膠酶的微生物的生長并使其產(chǎn)生的瓊膠酶活性更高。實驗結(jié)果表明:在35 ℃左右、淡水、半?yún)捬鯒l件下,瓊膠寡糖在腐爛龍須菜培養(yǎng)時間小于96 h時產(chǎn)量呈上升趨勢,15~40 h時呈指數(shù)增長,64~96 h平穩(wěn)上升且96 h時產(chǎn)量達(dá)到最高,為對照的“完好”樣品的近6倍;龍須菜腐爛處理時間為96 h提取液的酶活力是0 h提取液酶活力約8.2倍,而被小分子量瓊膠寡糖相對含量在淡水半?yún)捬跆幚硐聻槲唇?jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍。此結(jié)果對將來進(jìn)一步放大生產(chǎn)瓊膠寡糖具有重要的參考價值。

    [1]柯德森,劉春媚,周子琳,等.海水提取龍須菜瓊膠的堿處理條件優(yōu)化[J].廣州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2012,11(5):35-39.

    [2]劉美英,梅建鳳,易喻.瓊膠寡糖生物活性的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2008(6):493-496.

    [3]梅建鳳,應(yīng)國清,劉美英,等.酶解瓊膠制備活性寡糖的工藝條件研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,39(2): 119-122.

    [4]李能章,邱榮蓉,彭遠(yuǎn)義.瓊膠酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2006,10(2):62-66.

    [5]朱磊,薛永常.瓊膠酶酶學(xué)研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2016,36(2):193-197.[6]王曉燕,桑衛(wèi)國,章宗銘.腐爛紫菜中瓊膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定[J].食品科技,2009,34(7):2-5.

    [7]繆伏榮,李忠榮.瓊膠的降解及其產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(2):125-128.

    [8]林伯坤,陸國永,宋燕,等.海洋細(xì)菌Agarivoranssp.HZ105的瓊膠降解酶系[J].生物技術(shù)通報,2015,31(1): 160-166.

    [9]趙玉芬,李洪仁.人工海水的配制及經(jīng)濟(jì)可行性評估[J].沈陽教育學(xué)院學(xué)報,2001,2(3):117-118.

    [10]彥繁鶴,周金梅,吳如春.DNS法測定甘蔗渣中還原糖含量[J].食品研究與開發(fā),2015,36(2):126-128.

    [11]王麗娜,陳水鈁,張兵,等.3,5-二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2009,30(4): 232-234.

    [12]林立昊,惠宏杉,齊軍倉,等.紫外分光光度法測定啤酒大麥籽粒脂氧合酶活力的研究[J].核農(nóng)學(xué)報,2016,30(5):926-933.

    [13]袁夢,馬玉晨.高效液相色譜-示差折光法測定蜂蜜中三種還原糖含量[J].食品與發(fā)酵科技,2015,51(1):87-90.

    [14]孫文,巢志茂,王淳,等.瓜蔞飲片中總糖及還原糖的含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(1):96-99.

    [15]逯平杰,代容春,葉冰瑩,等.高效液相色譜法測定甘蔗節(jié)間果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J].食品科學(xué),2011,32(2):198-200.

    [16]馬志剛,曹秋娥,丁中濤.高效液相色譜法測定丹參及其復(fù)方制劑中的3個丹參酮[J].云南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,22(6):391-393.

    [17]Inger Krong-Mikkelsen, Ole Hels, Inge Tetens, et al. The effects of L-arabinose on intestinal sucrose activity: dose-response studies in vitro and in humans[J].AmJClinNutr,2011,94(2):472-478.

    [18]BERNARDEZMM,MIGUELEZJD,QUEUEIROBJG.HPL Cdeter mination of sugarsinvarieties of chestnutfruits from galicia[J].Journal of Food Composition and Analysis,2004,17(1):63-67.

    [19]丁洪流,李燦,金萍,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定食品中的單糖、雙糖、低聚果糖和糖醇[J].色譜,2013,31(8):804-808.

    Feasibility Study of Agar Oligosaccharide Production by Self Hydrolysis during Decay Process inGracilariaLemaneiformis*

    ZHUSi-ying,CHENDan-qi,LIANGJia-ming,LIHai-xin,LIRong,KEDe-sen

    (School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

    Under the conditions of different temperature, the amount of oxygen, salinity and treatment time, the content and the molecular weight of reducing sugar were measured, as well as the agarase activity inGracilarialemaneiformiswas analyzed during decay process. The feasibility study of agar oligosaccharide production by self hydrolysis during decay process inGracilarialemaneiformiswas studied and the related factors affecting the degree of hydrolysis were analyzed. The results showed that the agar could be degraded to produce agaro oligosaccharides during decay process inGracilarialemaneiformis. The agar oligosaccharide content in 96 h was 6 times as much as that of the natural species. The enzyme activity in 96 h was 8.2 times as much as that in 0 h. The small molecule agarose content could reached 98.71% when Gracilaria rotted in fresh water at 35 ℃ for 48 h.

    Gracilarialemaneiformis; rot; agarase; agar oligosaccharide; molecular weight

    廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030313531);廣州市科技計劃項目(201510010108);廣東省專業(yè)綜合改革試點項目(生物工程, 粵教高函[2013]113號);2016廣東省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(教務(wù)〔2016〕58號);第十五屆全國“挑戰(zhàn)杯”競賽立項(2016:瓊膠寡糖)。

    朱思穎(1993-),本科生。

    柯德森(1966-),博士,教授。

    S985.4+9

    B

    1001-9677(2016)018-0052-04

    猜你喜歡
    龍須菜寡糖淡水
    不簡單!一口普通的淡水蝦塘,他們竟能做到畝產(chǎn)2000多斤,獲利3萬多/畝
    海洋科學(xué)(2022年12期)2022-03-01 00:48:32
    鯨豚趣多多之它們愛淡水
    跳到海里喝淡水
    殼寡糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
    5%氨基寡糖素AS在番茄上的應(yīng)用效果初探
    當(dāng)冷鹽水遇見溫淡水
    龍須菜寡糖分離純化和抗食物過敏功效的研究
    殼寡糖的制備方法,生理功能以及應(yīng)用趨勢
    河南科技(2014年7期)2014-02-27 14:11:10
    殼寡糖的制備方法、生理功能以及應(yīng)用與趨勢
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:31
    欧美三级亚洲精品| 麻豆一二三区av精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 人人妻人人澡欧美一区二区| 丁香欧美五月| 久久久久久久久久黄片| 久久精品成人免费网站| 老司机福利观看| 久久久久久久久中文| 日本成人三级电影网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩三级视频一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 久久热在线av| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲九九香蕉| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜福利在线在线| АⅤ资源中文在线天堂| 最近在线观看免费完整版| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美性长视频在线观看| av国产免费在线观看| 久久久国产精品麻豆| 两性夫妻黄色片| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品亚洲美女久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜免费观看网址| 亚洲国产欧美一区二区综合| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲五月天丁香| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 午夜精品久久久久久毛片777| 无人区码免费观看不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 香蕉丝袜av| 91大片在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产高清有码在线观看视频 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| cao死你这个sao货| 99riav亚洲国产免费| 国产真实乱freesex| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美3d第一页| 99热这里只有精品一区 | 午夜激情福利司机影院| 亚洲中文日韩欧美视频| 97碰自拍视频| 久久久久久国产a免费观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品国产高清国产av| 美女午夜性视频免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 黄色丝袜av网址大全| 熟女电影av网| 九色成人免费人妻av| av福利片在线| 特级一级黄色大片| 色噜噜av男人的天堂激情| 18禁美女被吸乳视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 特级一级黄色大片| 一a级毛片在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜激情av网站| 丰满的人妻完整版| 又大又爽又粗| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲专区中文字幕在线| av在线天堂中文字幕| 亚洲第一电影网av| 亚洲av五月六月丁香网| 一进一出好大好爽视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 少妇被粗大的猛进出69影院| 香蕉国产在线看| 久久人妻av系列| 欧美成人午夜精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 人成视频在线观看免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 两性夫妻黄色片| 看免费av毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费人成视频x8x8入口观看| 老司机福利观看| 国产精品国产高清国产av| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产欧美一区二区综合| 制服人妻中文乱码| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人av在线播放网站| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲自拍偷在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一本综合久久免费| 成人三级黄色视频| 一级片免费观看大全| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一二三四社区在线视频社区8| 国产欧美日韩一区二区精品| 人人妻人人看人人澡| 国产三级中文精品| 在线免费观看的www视频| 国产激情欧美一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆成人av在线观看| 午夜a级毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 中国美女看黄片| 又爽又黄无遮挡网站| 又爽又黄无遮挡网站| 久久久久久久久免费视频了| 香蕉久久夜色| 欧美日韩黄片免| 村上凉子中文字幕在线| 免费电影在线观看免费观看| 成人午夜高清在线视频| 麻豆国产av国片精品| 高清在线国产一区| 中文资源天堂在线| 不卡一级毛片| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产97色在线日韩免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 十八禁网站免费在线| 免费在线观看亚洲国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久久久久久黄片| 久久这里只有精品19| 91九色精品人成在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 久久精品91无色码中文字幕| 看免费av毛片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜亚洲福利在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男人舔奶头视频| 一夜夜www| 黄色丝袜av网址大全| 少妇粗大呻吟视频| 国产成人精品无人区| 欧美大码av| 麻豆久久精品国产亚洲av| a级毛片a级免费在线| 免费在线观看成人毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费高清视频大片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 黄色成人免费大全| 露出奶头的视频| 又爽又黄无遮挡网站| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品久久久人人做人人爽| 99在线视频只有这里精品首页| 丁香六月欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一进一出好大好爽视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产免费男女视频| 宅男免费午夜| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人国产综合亚洲| 麻豆国产97在线/欧美 | 婷婷亚洲欧美| av有码第一页| svipshipincom国产片| 老司机靠b影院| 淫秽高清视频在线观看| www.熟女人妻精品国产| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久国内视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲男人天堂网一区| 午夜老司机福利片| 天天一区二区日本电影三级| 日韩三级视频一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 两个人的视频大全免费| av视频在线观看入口| 成人18禁在线播放| 国产精品影院久久| www.www免费av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 免费在线观看完整版高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| www日本在线高清视频| 免费av毛片视频| 可以在线观看的亚洲视频| 天天一区二区日本电影三级| 99精品欧美一区二区三区四区| xxxwww97欧美| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久成人av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 手机成人av网站| 香蕉av资源在线| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品在线美女| 亚洲一码二码三码区别大吗| 看免费av毛片| 一a级毛片在线观看| 午夜精品在线福利| 特级一级黄色大片| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线观看午夜福利视频| 一本综合久久免费| 九色成人免费人妻av| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄色 视频免费看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲第一电影网av| 亚洲精品一区av在线观看| 一本久久中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲,欧美精品.| 国产精品久久视频播放| 一级毛片高清免费大全| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产单亲对白刺激| 男人舔女人的私密视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 免费看日本二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 性色av乱码一区二区三区2| 怎么达到女性高潮| 一进一出好大好爽视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 黄片大片在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品影院久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 韩国av一区二区三区四区| 18禁国产床啪视频网站| 精品欧美一区二区三区在线| 91字幕亚洲| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一区二区三区国产精品乱码| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩免费av在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 99精品在免费线老司机午夜| 黄片小视频在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 日韩av在线大香蕉| 国产熟女xx| 亚洲av美国av| 欧美成人免费av一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费搜索国产男女视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩欧美三级三区| 国产高清videossex| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久中文字幕一级| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 此物有八面人人有两片| 在线观看日韩欧美| 欧美三级亚洲精品| 高清毛片免费观看视频网站| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级毛片高清免费大全| 亚洲,欧美精品.| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产看品久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 午夜福利高清视频| cao死你这个sao货| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| √禁漫天堂资源中文www| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 岛国在线免费视频观看| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 看免费av毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产成人系列免费观看| 久久这里只有精品19| 欧美三级亚洲精品| 高清毛片免费观看视频网站| 国语自产精品视频在线第100页| 91av网站免费观看| 中文资源天堂在线| 听说在线观看完整版免费高清| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲乱码一区二区免费版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜亚洲福利在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 黄频高清免费视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 丁香六月欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久久久久久黄片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av国产免费在线观看| 国产区一区二久久| 亚洲自拍偷在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成人av在线播放网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 黄片大片在线免费观看| 日本黄大片高清| 午夜精品在线福利| 老汉色∧v一级毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 妹子高潮喷水视频| 国产av又大| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 18禁观看日本| 国产成人aa在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产av又大| 不卡一级毛片| 欧美日韩福利视频一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国内精品久久久久久久电影| 久久人人精品亚洲av| x7x7x7水蜜桃| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 五月伊人婷婷丁香| 老司机福利观看| 午夜影院日韩av| 在线看三级毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜福利在线在线| 国产成人欧美在线观看| 成人三级黄色视频| 校园春色视频在线观看| 在线永久观看黄色视频| 日本一本二区三区精品| 天堂动漫精品| 成人欧美大片| 视频区欧美日本亚洲| 麻豆一二三区av精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 看片在线看免费视频| 久久久久久大精品| 又黄又粗又硬又大视频| av视频在线观看入口| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 999精品在线视频| 最近在线观看免费完整版| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 精品国内亚洲2022精品成人| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久久久久午夜电影| 无限看片的www在线观看| 我要搜黄色片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 大型av网站在线播放| 手机成人av网站| 免费看十八禁软件| 我的老师免费观看完整版| 女警被强在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 在线观看免费午夜福利视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产主播在线观看一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美性猛交黑人性爽| 香蕉久久夜色| 一级片免费观看大全| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜福利18| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美大码av| 哪里可以看免费的av片| 在线国产一区二区在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲中文字幕日韩| 可以在线观看的亚洲视频| 男女午夜视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产精品av视频在线免费观看| 九色国产91popny在线| 国产黄a三级三级三级人| 91在线观看av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲人与动物交配视频| 村上凉子中文字幕在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美日本视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜福利18| 久久伊人香网站| 国产成年人精品一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 麻豆成人av在线观看| 一级作爱视频免费观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品,欧美在线| 国产1区2区3区精品| 丝袜美腿诱惑在线| 小说图片视频综合网站| 国产麻豆成人av免费视频| 丁香欧美五月| 男女那种视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲五月婷婷丁香| av中文乱码字幕在线| www.精华液| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 91在线观看av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一区二区三区高清视频在线| 中出人妻视频一区二区| 深夜精品福利| 一本综合久久免费| 俺也久久电影网| www.自偷自拍.com| 99热这里只有精品一区 | 欧美日韩乱码在线| 日本成人三级电影网站| 美女 人体艺术 gogo| 国产在线观看jvid| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美精品亚洲一区二区| 久99久视频精品免费| 日韩欧美精品v在线| 中文字幕最新亚洲高清| or卡值多少钱| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久99久视频精品免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 伦理电影免费视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美性长视频在线观看| 制服诱惑二区| 美女免费视频网站| 国内精品久久久久精免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 在线看三级毛片| 在线永久观看黄色视频| 亚洲av片天天在线观看| 精品久久久久久久末码| 男人舔女人的私密视频| 国产久久久一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日本一二三区视频观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲欧美在线一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av福利片在线| avwww免费| 成人欧美大片| 久久亚洲真实| 97碰自拍视频| 国产高清videossex| or卡值多少钱| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费在线观看成人毛片| 亚洲激情在线av| 亚洲午夜理论影院| 丝袜人妻中文字幕| 午夜影院日韩av| 国产精品一区二区免费欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 色哟哟哟哟哟哟| 国产成人欧美在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产伦人伦偷精品视频| 我的老师免费观看完整版| 色综合欧美亚洲国产小说| 床上黄色一级片| 成年版毛片免费区| 久久这里只有精品19| 免费av毛片视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品影院久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品久久蜜臀av无| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲色图av天堂| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜免费观看网址| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 香蕉国产在线看| 国产一区二区在线观看日韩 | 很黄的视频免费| 免费av毛片视频| 国产亚洲精品一区二区www| 两性夫妻黄色片| 99re在线观看精品视频| 波多野结衣巨乳人妻| av超薄肉色丝袜交足视频| 日本五十路高清| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 又紧又爽又黄一区二区| 欧美3d第一页| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| 天堂动漫精品| 国产乱人伦免费视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成年人精品一区二区| 色老头精品视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 香蕉av资源在线| 不卡av一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 老司机深夜福利视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 五月玫瑰六月丁香| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产成人av教育| 精品国产美女av久久久久小说| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 国产精华一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲片人在线观看| 看免费av毛片| 91成年电影在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产精华一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产成人精品无人区| 亚洲真实伦在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片|