明亮發(fā)光桿菌連續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

蔣媛媛， 孟 芹， 蘇嘉緣， 李 佩， 郭美錦， 馮耀宇（華東理工大學 .資源與環(huán)境工程學院，國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室；.生物工程學院，上海 0037）

明亮發(fā)光桿菌連續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

蔣媛媛1， 孟 芹1， 蘇嘉緣1， 李 佩1， 郭美錦2， 馮耀宇1
（華東理工大學 1.資源與環(huán)境工程學院，國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室；2.生物工程學院，上海 200237）

為克服市售凍干粉批次間活性差異較大、檢測前需復蘇等缺點，對明亮發(fā)光桿菌從搖瓶到發(fā)酵罐進行逐級放大培養(yǎng)，探索其在發(fā)酵罐上的最適連續(xù)培養(yǎng)條件，獲得連續(xù)穩(wěn)定的發(fā)光細菌檢測液。在搖瓶條件下得到的最適培養(yǎng)條件為：溫度18℃，初始p H=7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量2%。在此條件下，菌體最大比發(fā)光度可達2 500 m V。在5 L發(fā)酵罐中的最適培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量0.5 vvm，稀釋率0.10 h－1。在此條件下，對明亮發(fā)光桿菌進行多批連續(xù)培養(yǎng)，菌體比發(fā)光度可穩(wěn)定在500～1 000 m V，可連續(xù)培養(yǎng)10 d左右。

發(fā)光桿菌；搖瓶培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)；最適條件

面對水環(huán)境中種類繁多、結構復雜、毒理和環(huán)境健康閾值均不明確的污染物，傳統(tǒng)的水質(zhì)理化指標檢測已難以滿足水環(huán)境安全管理的需要。另一方面，生物毒性檢測法因其能夠直觀反映水體中所有污染物的綜合毒性效應及其對人體和其他生物體系的危害程度，已成為水質(zhì)安全評價的重要補充。

生物毒性檢測實驗主要有魚類急、慢性［1］、蚤類毒性［2］、藻類毒性［3］及微生物毒性實驗［4］（如發(fā)光細菌對污染物毒性的發(fā)光抑制）等。這些方法在有毒物質(zhì)對水環(huán)境的危害和風險評估方面有較大優(yōu)勢，不少學者對這些快速、靈敏的生物檢測方法進行過研究。Farre等［5］利用有機毒物對魚類、鼠類、水蚤類的生長抑制作用檢測其生物毒性大小。研究發(fā)現(xiàn)，雖然魚類、水蚤類實驗的靈敏度較高，但所需實驗周期長，花費大［6］。相比以上毒性檢測法，基于發(fā)光菌為指示物的生物毒性檢測法［7］利用有毒物質(zhì)抑制發(fā)光菌的正常發(fā)光且被抑制程度與有毒物質(zhì)濃度線性相關的原理，直接、有效地反映水質(zhì)綜合毒性［8］。該方法以其快速、簡便、靈敏度高、成本低、可實時檢測等優(yōu)點受到檢測人員的青睞，得到廣泛應用。

近年來，將發(fā)光菌毒性檢測技術和現(xiàn)代光電檢測技術有機結合，在細胞固定化技術、生物傳感技術的基礎上，連續(xù)地進行在線水質(zhì)毒性檢測是目前研究的熱點之一［9-11］。然而市售發(fā)光菌凍干粉價格較高，且測量之前需進行凍干粉的復蘇及復蘇效果不穩(wěn)定等問題限制了其在現(xiàn)場連續(xù)原位自動化監(jiān)測方面的應用。為了探索發(fā)光菌在水質(zhì)連續(xù)監(jiān)測應用上的可行性，少數(shù)學者對發(fā)光菌進行連續(xù)培養(yǎng)，并取得一定成果。Sedky等［12］在250 m L搖瓶，初始p H為7.0，溫度為20℃的條件下對明亮發(fā)光桿菌進行連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌體在發(fā)光穩(wěn)定的狀態(tài)下可維持120 h以上；Pooley等［13］在20 m L微型裝置中對明亮發(fā)光桿菌進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌體發(fā)光度在5%的誤差范圍內(nèi)可保持穩(wěn)定1周以上。

本文首次對明亮發(fā)光桿菌從搖瓶到發(fā)酵罐進行逐級放大培養(yǎng)來探索其最適培養(yǎng)條件，以期提供穩(wěn)定、連續(xù)的測量菌液，從而克服傳統(tǒng)檢測多為批式反應、結果容易浮動等缺點，為連續(xù)原位監(jiān)測提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

明亮發(fā)光桿菌T3小種凍干粉（中科院南京土壤研究所）；胰蛋白胨；酵母粉；Na2HPO4、KH2PO4、NaCl及甘油均為分析純。

1.2培養(yǎng)基

胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，Na2HPO45.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 30.0 g，甘油3.0 g，去離子水溶解定容至1 000 m L，調(diào)節(jié)p H至7.0［14］。發(fā)光細菌所需營養(yǎng)物質(zhì)與常見的異養(yǎng)微生物相似，由于明亮發(fā)光桿菌為海洋菌，故需提供質(zhì)量分數(shù)為3% 的NaCl溶液，此配方能使明亮發(fā)光桿菌發(fā)光最佳，故采取此培養(yǎng)基配方。搖瓶培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)以及補料均采用此培養(yǎng)基配方。

1.3實驗方法

1.3.1明亮發(fā)光桿菌搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）培養(yǎng)基。根據(jù)明亮發(fā)光桿菌培養(yǎng)基配方，在碳源和鹽分的基礎上逐步添加營養(yǎng)成分，于最佳接種量、溫度、轉(zhuǎn)速和p H下培養(yǎng)，測量發(fā)光強度和OD600，確定最佳培養(yǎng)基配方。

（2）接種量。分別接種0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 m L的新鮮菌液于50 m L培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，測定發(fā)光強度及OD600值，確定最佳接種量。

（3）搖床轉(zhuǎn)速。采用最佳接種量，將菌液分別在100、150、200 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)光強度及OD600值，以確定最佳轉(zhuǎn)速。

（4）溫度。采用最佳接種量和轉(zhuǎn)速，將菌液分別在12、15、18、22、25℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h，測定發(fā)光強度及OD600值，確定最佳溫度。

（5）p H。在最佳接種量、溫度、轉(zhuǎn)速下，用0.1 mol/L的HCl和NaOH緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基p H至5.5、6.5、7、7.5、8，搖床培養(yǎng)24 h，測定發(fā)光強度及OD600值，確定最佳p H。

1.3.2明亮發(fā)光桿菌發(fā)酵罐上的批式培養(yǎng)

（1）在溫度18℃，初始p H 7.0，接種量2%下，在100、200、300、400 r/min轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)24 h，測定發(fā)光強度和OD600值，確定最佳攪拌轉(zhuǎn)速。

（2）在最佳轉(zhuǎn)速下，通過調(diào)節(jié)通氣量為0.2、0.4 和0.5 vvm，探索通氣量對發(fā)光菌生長和發(fā)光的影響，確定最佳通氣量。

1.3.3明亮發(fā)光桿菌發(fā)酵罐上的連續(xù)培養(yǎng) 將明亮發(fā)光桿菌在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)到16～18 h，在稀釋率0.05～0.4 h－1范圍內(nèi)，以攪拌速率200 r/min、通氣量0.5 vvm、18℃對發(fā)光菌進行連續(xù)培養(yǎng)，確定最佳稀釋率；接通過程質(zhì)譜儀MAX300-LG，同步監(jiān)測各發(fā)酵參數(shù)。對明亮發(fā)光桿菌進行3個批次連續(xù)培養(yǎng)，測定發(fā)光強度和OD600值，考察不同批次穩(wěn)定性情況。

1.3.4檢測方法 明亮發(fā)光桿菌發(fā)光強度的檢測參照DXY-3生物毒性檢測儀說明書；菌體濃度的檢測采用OD600分光光度計法。

2　結果與討論

2.1明亮發(fā)光桿菌在搖瓶中的培養(yǎng)

2.1.1培養(yǎng)基的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中有一種或幾種必需的營養(yǎng)物，微生物可始終處在對這些營養(yǎng)物所需的最低質(zhì)量濃度狀態(tài)下生長。根據(jù)明亮發(fā)光桿菌培養(yǎng)基配方，在滿足其生長所需的碳源和鹽分的基礎上逐步添加營養(yǎng)成分，每隔6 h倒出部分料液，同時補加相應的新鮮料液，觀察其生長發(fā)光變化。表1示出了4種培養(yǎng)基配方（“＋”表示含有此成分，“－”表示不含此成分）。實驗結果見表2。由表2可知，第4種培養(yǎng)基的效果最佳，菌體比發(fā)光度（發(fā)光度/菌體濃度）高于其他3種情況?？梢姡髁涟l(fā)光桿菌的生長除了需要碳源和鹽分之外，氮源、無機鹽離子對發(fā)光菌的生長和發(fā)光也是必須的，所以在后期的補料過程中亦選擇補全料。

表1　不同批次的培養(yǎng)基Table 1 Different fed-batch mediums

表2　不同批次培養(yǎng)基下的比發(fā)光度Table 2 Specific luminosity of different fed-batch mediums

2.1.2接種量的影響 以時間為橫坐標，菌體比發(fā)光度為縱坐標作圖，考察不同接種量對發(fā)光菌發(fā)光以及生長的影響，結果如圖1所示?？梢悦黠@看出，在2%～10%接種范圍內(nèi)，菌體比發(fā)光度隨著接種量的增大而減小。在2%的接種量時，菌體比發(fā)光度可達到1 000 m V。1%接種量的整體比發(fā)光度水平略低于2%的接種量。以上結果表明，接種量過大、過小均不利于菌體的發(fā)光，2%的接種量對發(fā)光菌的搖瓶培養(yǎng)最適宜。增大接種量會縮短菌體生長過程中的延滯期，也會帶入過多的代謝物質(zhì)。在生長初期，過多菌的生長、分裂會導致底物提前大量消耗，同時，由于菌體過多會導致發(fā)酵黏液的增多及氧的缺乏，最終影響發(fā)光菌的生長和發(fā)光。

2.1.3轉(zhuǎn)速的影響 攪拌可以增加氣液接觸面積，提高氣液界面?zhèn)髻|(zhì)速率。從圖2可見，菌體在200 r/min下生長速度最快，整體比發(fā)光度值最大，最高可達2 300 m V。100、150 r/min低轉(zhuǎn)速下，搖瓶供氧不足，生長速率較慢；250 r/min高轉(zhuǎn)速下，菌體提前進入衰亡期，不利于發(fā)光菌的生長發(fā)光。所以就搖瓶培養(yǎng)而言，轉(zhuǎn)速200 r/min對菌體的生長和發(fā)光比較適宜。

圖1　接種量對菌體比發(fā)光度的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on specific luminosity

圖2　轉(zhuǎn)速對菌體比發(fā)光度影響Fig.2 Effect of rotation speed on specific luminosity

2.1.4溫度的影響 溫度是微生物生長的關鍵因素之一，本實驗所采用的明亮發(fā)光桿菌源自海洋中，分布在水深250～1 000 m的較冷的中層區(qū)，屬于低溫性微生物，故本實驗選擇在12～25℃范圍內(nèi)確定發(fā)光桿菌的最適生長和發(fā)光溫度。由圖3可看出，18℃時的發(fā)光桿菌整體比發(fā)光度水平最高，最高值可達2 400 m V。22℃時的菌體生長發(fā)光水平略低于18℃，其次是15℃和25℃，12℃最弱，最高只達800 m V。低溫下，菌體代謝緩慢，高溫會影響酶的活性，因此明亮發(fā)光桿菌的最適生長溫度為18℃左右，這與Sedky［12］在250 m L錐形瓶中對發(fā)光菌連續(xù)培養(yǎng)得出的最適培養(yǎng)溫度20℃相接近。

2.1.5p H的影響 p H會影響菌體細胞膜的電荷狀況及細胞膜的穩(wěn)定性，進而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力和代謝產(chǎn)物的分泌，最終影響菌體的生長和繁殖。它是評價發(fā)酵體系狀態(tài)變化和實施生產(chǎn)工藝控制的重要依據(jù)。將培養(yǎng)基的初始p H分別調(diào)至5.5、6.5、7.0、7.5、8.0，培養(yǎng)24 h，考察不同p H對菌體生長和發(fā)光的影響，如圖4所示。由圖4可知，p H在7.0時，菌體比發(fā)光度最高，可達2 500 m V，其次是p H 7.5、p H 6.5、p H 8.0；p H在5.5時的菌體比發(fā)光度水平最低。實驗結果表明，p H 7.0對菌體的生長和發(fā)光最有利。

圖3　溫度對菌體比發(fā)光度的影響Fig.3 Effect of temperature on specific luminosity

圖4　p H對菌體比發(fā)光度影響Fig.4 Effect of p H on specific luminosity

2.2發(fā)光桿菌在發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)

2.2.1轉(zhuǎn)速的影響 機械攪拌可打碎空氣氣泡，增加氣液接觸面積，能提高氣液界面的傳質(zhì)速率，同時使發(fā)酵液充分混合。另一方面，攪拌影響罐內(nèi)供氧狀況，轉(zhuǎn)速越大，供氧越充分。在溫度18℃，通氣量0.5 vvm，接種量2%的條件下，分別在轉(zhuǎn)速為100、200、300、400 r/min下對發(fā)光桿菌進行培養(yǎng)（圖5）。由圖5可知，在200 r/min的轉(zhuǎn)速下，菌體比發(fā)光度值可達最大，活力持續(xù)時間最長，最適合發(fā)光桿菌的生長和發(fā)光所需。高轉(zhuǎn)速（300、400 r/ min）下，菌體會較快進入對數(shù)生長期，同時也提前進入衰亡期。低轉(zhuǎn)速（100 r/min）下，菌體生長較緩慢，比發(fā)光度水平低。究其原因，低轉(zhuǎn)速會導致罐內(nèi)溶氧不足，不能滿足菌體的生長和發(fā)光。轉(zhuǎn)速過高，罐內(nèi)體系的剪切應力增大，對菌體會造成一定傷害，且高溶氧下，細胞生長過快會導致過早自溶、后期活性衰弱、菌體活力維持時間短的現(xiàn)象［15］。此外，過高的溶氧不一定能激發(fā)菌體內(nèi)熒光酶的最佳狀態(tài)，甚至會限制熒光酶的活性?？梢?，轉(zhuǎn)速的選擇應以發(fā)光菌的實際生長發(fā)光狀況來確定，不是越高越好。由實驗結果可確定，在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)發(fā)光菌的最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min，此結果與Stefanie等［16］在500 m L小型發(fā)酵罐中對費氏弧菌進行培養(yǎng)得出的最佳攪拌轉(zhuǎn)速有所差異，這可能與裝置的大小以及菌種的差異有關。

圖5　不同轉(zhuǎn)速對菌體比發(fā)光度的影響Fig.5 Effect of different agitation rates on specific luminosity

2.2.2通氣量的影響 在18℃，攪拌速度為200 r/min時，分別以通氣量0.5、0.4、0.2 vvm對發(fā)光桿菌進行培養(yǎng)（即空氣流量分別為1、800、400 mL/min），考察通氣量對菌體生長和發(fā)光的影響，結果如圖6。當通氣量為0.5 vvm時，菌體比發(fā)光度水平最高，最高可達2 200 mV；通氣量為0.4、0.2 vvm時的菌體發(fā)光度皆低于0.5 vvm時的水平。由實驗結果可見，通氣量0.5 vvm最適合菌體的生長發(fā)光。

2.3明亮發(fā)光桿菌在發(fā)酵罐中的連續(xù)培養(yǎng)

在明亮發(fā)光桿菌連續(xù)培養(yǎng)的過程中探索最適稀釋率（D），補料在菌體培養(yǎng)到18 h開始加入。圖7顯示了不同稀釋率下，菌體比發(fā)光度的情況。由圖7可知，當D為0.27 h－1時，菌體比發(fā)光度水平較低，達到穩(wěn)定培養(yǎng)時比發(fā)光度不到80 m V；當D= 0.10 h－1時，菌體生長發(fā)光狀況最好，穩(wěn)定時比發(fā)光度可達到500 m V；當D=0.18 h－1時，菌體比發(fā)光度為380 m V；當D=0.36、0.40 h－1時，比發(fā)光度分別為180、100 m V左右。

圖7　不同稀釋率對菌體比發(fā)光度的影響Fig.7 Effect of dilution rate on specific luminosity

以上結果表明，比較適宜的稀釋率在D=0.10 h－1左右，此時菌體在穩(wěn)定狀態(tài)時活性較好。若稀釋率過低，則殘留基質(zhì)濃度不斷減小，基質(zhì)低到無法維持菌的生長代謝，而殘留的發(fā)酵代謝廢液也不能及時流出，菌體會逐漸老化失活；稀釋率也不宜過高，因為稀釋率越大越容易出現(xiàn)菌體被“沖洗”的現(xiàn)象，菌體濃度減小，其發(fā)光效果也將受到影響。由實驗可得，稀釋率為0.10 h－1為最佳稀釋率，這與Stefanie等［16］得出的費氏弧菌連續(xù)培養(yǎng)的最佳稀釋率為0.08～0.09 h－1的結果相近。

圖8所示為連續(xù)培養(yǎng)過程中參數(shù)動態(tài)響應圖，CER、OUR分別為發(fā)酵過程中的攝氧率和CO2釋放率。一般情況下，若OUR、CER增大，表明細胞代謝速率增強；若OUR、CER下降，表明菌體代謝受到影響。

圖8　連續(xù)培養(yǎng)中參數(shù)動態(tài)響應圖Fig.8 Dynamic response of different parameters during chemostae cultivation

由圖8可知，在發(fā)酵過程中，前10 h內(nèi)，隨著菌體的不斷生長，OUR、CER不斷上升，溶氧迅速下降；當溶氧處于較低水平時，菌體生長得到控制，OUR、CER增長減緩。約20 h后，菌體達到穩(wěn)定期，CER、OUR、尾碳達到最高值，之后迅速下降，此時，罐內(nèi)溶氧成為菌體生長的限制性因素，這時可通過微調(diào)轉(zhuǎn)速來提高溶氧水平，保證罐內(nèi)供氧能夠滿足代謝需要，此后，CER、OUR及尾碳、尾氧也處于穩(wěn)定狀態(tài)，變化幅度很小。在發(fā)酵穩(wěn)定期間，需要進行補料，補料在短時間之內(nèi)會導致OUR、CER的急劇變化，但補料之后，OUR、CER又趨于穩(wěn)定，菌體代謝恢復正常。由圖可見，連續(xù)培養(yǎng)過程中，主要參數(shù)變化相對穩(wěn)定，明亮發(fā)光桿菌生長狀態(tài)良好。

在前期優(yōu)化的培養(yǎng)條件上，選擇稀釋率0.10 h－1，轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度18℃、通氣量0.5 vvm、p H=7.0的條件下進行3個批次連續(xù)培養(yǎng)，實驗結果如表3所示。由表3可知，3次連續(xù)培養(yǎng)過程中菌體比發(fā)光度可穩(wěn)定在700 m V以上，穩(wěn)定性良好。其中持續(xù)時間最短8 d，最長可達12 d。

表3　不同批次連續(xù)培養(yǎng)中菌體比發(fā)光度Table 3 Luminosity variation during different batches

圖9所示為明亮發(fā)光桿菌其中一次成功培養(yǎng)的菌體生長和發(fā)光情況。由圖可見，成功培養(yǎng)過程中菌體濃度及發(fā)光度變化較為穩(wěn)定，OD600在1.5～3.0之間，比發(fā)光度在700～1 500 m V范圍，整體比發(fā)光度水平較高，隨著時間的延長，二者皆呈現(xiàn)下降的趨勢，符合微生物生長規(guī)律。

在連續(xù)培養(yǎng)期間，菌種會面臨著老化以及活性降低的問題，時間越久活性越低。在補料期間每天需更換補料瓶，這亦會加大染菌的幾率。相比Sedky［12］、Pooley［13］、Stefanie［16］等對發(fā)光菌進行的連續(xù)培養(yǎng)持續(xù)時間，本實驗連續(xù)培養(yǎng)時間可長達12 d，結果較為理想，能夠滿足水質(zhì)連續(xù)檢測的需要，為發(fā)光桿菌在日后水質(zhì)原位、連續(xù)、在線監(jiān)測的應用奠定基礎。

3　結 論

（1）在搖瓶培養(yǎng)中，采用含有不同營養(yǎng)物的培養(yǎng)基對明亮發(fā)光桿菌進行培養(yǎng)，結果顯示全料下的菌體生長發(fā)光狀態(tài)最好；分別探索了溫度、接種量、轉(zhuǎn)速及p H對明亮發(fā)光桿菌生長和發(fā)光的影響，得到最適培養(yǎng)條件為：溫度18℃，初始p H 7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量2%，在此條件下，菌體最大比發(fā)光度可達2 500 m V。

圖9　連續(xù)培養(yǎng)中菌體比發(fā)光度變化Fig.9 Luminosity variation during chemostat cultivation

（2）在5 L發(fā)酵罐中對明亮發(fā)光桿菌進行批式培養(yǎng)，探索轉(zhuǎn)速和通氣量對菌體生長和發(fā)光的影響。得到最適轉(zhuǎn)速為200 r/min。此轉(zhuǎn)速下，菌體最大比發(fā)光度可達2 200 m V且可持續(xù)4 h。在最適轉(zhuǎn)速200 r/min下，考察不同通氣量對發(fā)光菌生長和發(fā)光的影響。結果顯示，通氣量為0.5 vvm時的菌體生長發(fā)光水平最佳，最高可達2 000 m V，高于通氣量分別為0.2 vvm和0.4 vvm時的比發(fā)光度值。

（3）進一步在5 L發(fā)酵罐中探索稀釋率對明亮發(fā)光桿菌連續(xù)培養(yǎng)的影響。得到最適稀釋率為0.10 h－1，此條件下菌體比發(fā)光度可達到1 000 m V。在最佳培養(yǎng)條件：稀釋率0.10 h－1，轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度18℃、通氣量0.5 vvm、p H 7.0時對發(fā)光桿菌進行3次連續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，主要參數(shù)變化相對穩(wěn)定，菌體生長發(fā)光狀況良好，菌體比發(fā)光度可維持在700 m V以上，培養(yǎng)時間最短為8 d，最長可達12 d，能夠滿足水質(zhì)連續(xù)監(jiān)測的需要，可進一步用于實踐之中。

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Optimization of Continuous Cultivation for Photobacterium Phosphoreum

JIANG Yuan-yuan1， MENG Qin1， SU Jia-yuan1， LI Pei1，
GUO Mei-jin2， FENG Yao-yu1
（1.State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process，School of Resources and Environmental Engineering；
2.School of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

The detection of water toxicity by bioluminescent bacterium was restricted because the stability of commercially available lyophilized powder varied among different batches and long resuscitation time.The cultivation of Photobacterium phosporeum was scaled up from shake flask to 5 L fermenter in order to obtain bacteria with stable luminosity.The optimum culture conditions in shake flask were as follows：18℃，p H 7.0，rotation speed 200 r/min and inoculation amount 2%，under which the specific luminosity can reach 2 500 m V.In 5 L fermenter，the optimum conditions were as follows：rotation speed 200 r/min，aeration rate 0.5 vvm and dilution rate 0.10 h－1，under which the specific luminosity during the continuous cultivation ranged from 500 m V to 1 000 m V in several batches，and the continuous cultivation was maintained for about 10 d.

uminescent bacteria；shake-flask culture；continuous culture；optimum conditions

X172

A

1006-3080（2016）01-0048-06 DOI：10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.01.008

2015-05-08

國家科技部水污染控制與治理科技重大專項（2014ZX07104006）；生物反應器國家重點實驗室“十二五”自主研究課題（2060204）

蔣媛媛（1990-），女，安徽蕪湖人，碩士生，從事環(huán)境微生物研究。E-mail：jiangyuanyuan415@foxmail.com

馮耀宇，E-mail：yyfeng@ecust.edu.cn