中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟保護(hù)作用的研究

于佳民，張建梅，謝全喜，徐輝，谷巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

?

中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟保護(hù)作用的研究

于佳民，張建梅，謝全喜，徐輝，谷巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

試驗(yàn)將研制的中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑灌胃急性肝損傷模型小鼠，觀察其肝功能保護(hù)的作用。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選獲得具有保肝作用的最優(yōu)中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑配方：白芍12 g、茵陳5 g、五味子6 g、板藍(lán)根5 g，植物乳桿菌、糞腸球菌活菌數(shù)比例3∶1。灌胃該中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑提取液的急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素水平分別較模型組降低72.47%、60.63%、61.56%；小鼠肝細(xì)胞切片觀察，小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞濁腫及空泡樣變基本恢復(fù)正常。

急性肝損傷；肝細(xì)胞；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；谷草轉(zhuǎn)氨酶；總膽紅素

微生態(tài)制劑可以改善腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，抑制或殺滅有害菌，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡，從而降低血漿內(nèi)毒素的增加，起到保護(hù)肝臟的作用。中草藥毒副作用小、低耐藥、低藥物殘留，很多中草藥對(duì)肝細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用，已成為肝病治療研究的重要方向。五味子，性酸甘溫，歸肺心腎經(jīng)，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心之功效（馬育軒等，2014）。白芍性味苦、酸，微寒，具有歸肝、脾經(jīng)，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)的功效，臨床常用于治療慢性肝炎。研究表明，白芍及其總苷對(duì)各種化學(xué)性肝損傷均有明顯保護(hù)作用，能降低轉(zhuǎn)氨酶，使肝細(xì)胞變性壞死程度減輕（吳慶光等，2012）。板藍(lán)根有清熱解毒、涼血利咽之功效，近年來(lái)研究表明板藍(lán)根具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗內(nèi)毒素的作用。茵陳性味微寒，味苦，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，具有清濕熱，退黃疽的功效。本試驗(yàn)將研制的中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑用于急性肝損傷模型小鼠，以觀察其保護(hù)肝功能的藥理效應(yīng)，篩選出保肝作用較好的中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑益生菌由植物乳桿菌、糞腸球菌組成，比例為3∶1，活菌總數(shù)≥108cfu/mL，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。五味子6～18 g，茵陳5～15 g，白芍12～48 g，板藍(lán)根5～15 g，購(gòu)自永春堂大藥房，經(jīng)鑒定符合中國(guó)藥典2005年版的各項(xiàng)要求。聯(lián)苯雙醋滴丸，浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；分析純CCl4；市售精制豆油。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和總膽紅素（STB）試劑盒，均購(gòu)自上海科華生物。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物昆明系小鼠，體重（20±2）g，雄性，清潔級(jí)，購(gòu)自泰邦生物。小鼠預(yù)飼5 d，自由攝食和飲水，溫度18～20℃，自由光照，定時(shí)通風(fēng)換氣。

1.3試驗(yàn)儀器卓越330全自動(dòng)生化分析儀，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；AP280-2型石蠟包埋機(jī)；CX31正置顯微鏡，Olympus公司。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1藥液制備中草藥煎煮前加入適量的水（水量為藥物的8～10倍）浸泡30 min，先用武火煮沸，后用文火使藥液保持沸騰狀態(tài)，一劑藥煎煮3次，每次煎煮30 min，3次共濃縮為100 mL，中藥濃度為1 g/mL。將益生菌凍干菌粉（109cfu/g）與中草藥煎煮液混勻備用。

1.4.2動(dòng)物分組造模與給藥取96只雄性小鼠，隨機(jī)分成12組，每組8只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、中草藥復(fù)方試驗(yàn)組（Ⅰ～Ⅸ組）?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組每天正常飼喂；陽(yáng)性對(duì)照組每天以0.1 mL/10 g劑量給予聯(lián)苯雙酯溶液；各中草藥組每天以0.1 mL/10 g劑量連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，除空白對(duì)照組外，其余各組均以0.1 mL/10 g劑量灌胃0.3%CCl4豆油溶液，禁食，不禁水。24 h后眼球采血，以3000 r/min離心10 min，分離血清。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素含量。斷頸處死小鼠，取出肝臟，肉眼觀察肝臟顏色、大小、光滑度和韌性，切取部分肝臟，用10%甲醛溶液固定，送予山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院病理切片室制備切片，光鏡下觀察病理變化。

1.4.3正交試驗(yàn)確定中草藥組方將不同劑量的中草藥，采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，組合成不同的中草藥組方，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表1　因素與水平g

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案g

1.4.4數(shù)據(jù)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s多重比較法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素的影響表3結(jié)果表明，模型組血清ALT、AST與空白組比較均顯著升高（P＜0.01），STB與空白組比較極顯著升高（P＜0.01），表明造模成功。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組血清ALT、AST及STB與空白組比較差異不顯著（P＞0.05）。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組血清ALT、AST、STB與模型組比較分別降低66.75%、49.56%、54.62%（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅰ組的血清ALT、AST較模型組分別降低72.48%、60.64%（P＜0.01），與空白組接近，差異不顯著（P＞0.05）；血清STB較模型組降低61.56%，差異極顯著（P＜0.01），與空白組差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組Ⅷ組的血清ALT、AST較模型組分別降低62.43%、40.50%（P＜0.01），與空白組差異不顯著（P＞0.05）；血清STB較模型組降低58.19%（P＜0.01）。說(shuō)明中草藥復(fù)方Ⅰ、Ⅷ組在降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素的效果與聯(lián)苯雙酯作用相當(dāng)，其中中藥復(fù)方Ⅰ組效果較好，其他中草藥復(fù)方試驗(yàn)組降轉(zhuǎn)氨酶效果不如聯(lián)苯雙酯。

2.2肝組織病理觀察結(jié)果由病理切片可見(jiàn)，空白組小鼠肝組織肝竇清晰可見(jiàn)，肝細(xì)胞整齊排列，細(xì)胞質(zhì)豐富而均勻；模型組小鼠肝細(xì)胞濁腫并呈氣球樣變性，肝細(xì)胞核被脂滴擠向一側(cè)；陽(yáng)性組小鼠肝細(xì)胞損傷減輕，輕度淤血；中草藥復(fù)方Ⅰ組、Ⅷ組小鼠肝細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞濁腫及空泡樣變基本恢復(fù)正常，部分肝細(xì)胞核輕度固縮；其余各中草藥復(fù)方組的小鼠肝臟仍可見(jiàn)肝細(xì)胞淤血，空泡樣變。

3　討論

賈越光等（2014）運(yùn)用飽和水溶液法制備五味子保肝活性成分包合物，小鼠灌胃給藥，HPLC同時(shí)測(cè)定包合物在小鼠體內(nèi)不同組織中的藥物濃度，考察其在體內(nèi)的肝靶向性，五味子保肝活性成分在小鼠體內(nèi)各組織中的濃度分布特征顯示，包合物具有明顯的體內(nèi)肝靶向性。朱艷和王俊平（2012）利用丙戊酸鈉誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型，給藥組給予五味子乙素+丙戊酸鈉，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，結(jié)果表明，模型組血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶為（72.29±4.14）IU/L和（67.26±2.38）IU/L，給藥組血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶分別為（32.29±3.68）IU/L和（34.25± 5.69）IU/L，兩組差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明五味子乙素可緩解肝功能的損害，起到保肝作用。周艷麗等（2007）運(yùn)用雷公藤多苷片致小鼠急性肝損傷模型，探討白芍總苷對(duì)該模型肝損傷保護(hù)作用和機(jī)制，結(jié)果白芍總苷可以降低損傷肝組織ALT、AST含量，因此認(rèn)為白芍總苷可以對(duì)抗雷公藤多苷片所致小鼠急性肝損傷。周立等（2008）利用四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型，研究證明，茵陳的三氯甲烷提取物能明顯降低四氯化碳引起的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的增高。本試驗(yàn)研究顯示，灌胃由白芍12 g、茵陳5 g、五味子6 g、板藍(lán)根5 g組成的中草藥復(fù)方制劑Ⅰ的提取液的急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素水平分別較模型組降低72.47%、60.63%、61.56%；灌胃由白芍12 g、茵陳15 g、五味子12 g、板藍(lán)根15 g組成的中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑Ⅷ的急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷

表3　中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素含量的影響U/L

草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素水平分別較模型組降低62.43%、40.5%、58.19%。兩復(fù)合微生態(tài)制劑組的小鼠肝細(xì)胞切片觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞濁腫及空泡樣變基本恢復(fù)正常，其中中草藥復(fù)方制劑Ⅰ組的降低血清轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素的效果更好，表明該中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2005年版一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.166

［2］賈越光，丁志英，張?jiān)?五味子保肝活性成分包合物的制備及其肝靶向性研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2014，9（34）：50～53.

［3］馬育軒，黃艷霞，周海純.五味子現(xiàn)代藥理及臨床研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2014，1（31）：125～126

［4］吳慶光，姚海燕，藍(lán)森麟.白芍配伍緩性制毒淺析［J］.中藥與臨床，2012，2（1）：36～37

［5］周立，萬(wàn)麗，王敏.茵陳保肝活性部位的初步篩選研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（1）：114～115

［6］周艷麗，張磊，劉維.白芍總苷對(duì)雷公藤多苷片所致小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津中醫(yī)藥，2007，24（1）：61.

［7］朱艷，王俊平.五味子乙素對(duì)丙戊酸鈉肝臟損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2012，4（5）：405～406.

The traditional Chinese medicine compound probiotics by Micro-ecological theory and the theory of traditional Chinese medicine were developed.By studying the liver protection effects of traditional Chinese medicine compound probiotics on the model mouse of acute liver injury，the best Chinese medicine compound probiotics formula with hepatoprotective effect was got.Herbal formula was white peony root 12 g，wormwood 5 g，schisandra 6 g，radix isatidis 5 g.The ratio of Lactobacillus to Enterococcus faecalis was 3 to 1.Serum alanine amino transaminase，aspartate aminotransferase and total bilirubin levels in the mouse of acute liver injury gavaged the Chinese medicine compound probiotics extract were 72.47%，60.63%，61.56%lower than those of the model group；Mouse liver cells arranged in neat rows，liver cell damage was alleviated，cells cloudy swelling and vacuolar degeneration returned to normal.

acute liver damage；hepatocyte；alanine aminotransferase；aspartate aminotransferase；total bilirubin

飼料衛(wèi)生

S816.7

A

1004-3314（2016）07-0013-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160703

863課題“新型抗感染功能型微生態(tài)制劑研制與應(yīng)用”（2013AA102806）