硼替佐米聯(lián)合毛喉素誘導硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞凋亡的實驗研究

王瑩瑩，鐘　瑤，俞夜花，唐　勇，杭海芳，朱　琦

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011

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硼替佐米聯(lián)合毛喉素誘導硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞凋亡的實驗研究

王瑩瑩，鐘瑤，俞夜花，唐勇，杭海芳，朱琦

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011

背景與目的：硼替佐米作為蛋白酶體抑制劑已成為新診斷和復發(fā)多發(fā)性骨髓瘤患者臨床治療的主要藥物，但仍有部分患者對硼替佐米產(chǎn)生耐藥而影響其長期生存。近年來研究發(fā)現(xiàn)，提高細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸濃度可以誘導骨髓瘤細胞凋亡并延緩其生長，成為骨髓瘤治療新途徑。該研究通過觀察硼替佐米聯(lián)合腺苷酸環(huán)化酶激動劑毛喉素（forskolin）對硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞的作用，探究克服骨髓瘤耐藥的可能途徑及其機制。方法：以硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞株H929-R和原代細胞為模型，通過觀察細胞生長、形態(tài)、凋亡相關基因的改變來研究硼替佐米、毛喉素單獨或聯(lián)合處理對硼替佐米耐藥細胞增殖及凋亡的影響；并應用Rh123/PI雙染法檢測藥物處理前后細胞內(nèi)線粒體跨膜電位的變化；同時采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fuorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測線粒體凋亡相關基因轉錄水平及抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的蛋白水平的改變。結果：硼替佐米（20 nmol/L）與毛喉素（50 nmol/L）能夠協(xié)同誘導硼替佐米耐藥細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，毛喉素可協(xié)同硼替佐米促使耐藥細胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降并下調(diào)其Bcl-2和Mcl-1蛋白的表達。結論：毛喉素聯(lián)合硼替佐米能夠誘導硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞凋亡。

毛喉素；硼替佐米；骨髓瘤細胞；凋亡

硼替佐米治療多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）已成為標準一線方案，使得MM患者緩解率較以往有明顯提高。但由于硼替佐米耐藥情況不可避免的發(fā)生，相當數(shù)量MM患者緩解后復發(fā)，成為MM患者長期生存主要障礙之一［1］。因此，尋找針對硼替佐米耐藥MM患者治療方法有其重要意義。近年來，體外和動物模型研究都發(fā)現(xiàn)一些使細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度增高的藥物可以誘導MM細胞增殖阻滯和凋亡，但單一cAMP通路調(diào)節(jié)劑存在所需藥物劑量大且易導致不良反應等問題［2］。為了尋找克服硼替佐米耐藥以及增強cAMP通路調(diào)節(jié)劑作用效應的可能途徑，我們以硼替佐米耐藥的MM細胞株H929-R和原代細胞為模型，觀察硼替佐米、腺苷酸環(huán)化酶激動劑毛喉素（forskolin）單獨和聯(lián)合處理對這些細胞的影響并探究其可能作用機制。

1　材料和方法

1.1制劑

毛喉素購自美國Sigma公司，以二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為50 mmol/L的儲存液；50 nmol/L硼替佐米購自美國Sigma公司，以0.9%NaCl溶液配制。

1.2細胞培養(yǎng)與細胞形態(tài)學觀察

MM硼替佐米耐藥細胞株H929-R由上海交通大學醫(yī)學院病理與病理生理學教研室提供。將2×105個/mL的上述細胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/mL谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Sigma公司）中，常規(guī)條件下培養(yǎng)（37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%，95%濕度）48 h后抽取部分細胞進行涂片，瑞士藍染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)，并以Image-Pro Plus軟件拍攝圖像。

1.3細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的H929-R細胞，按5×104個/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組分別單獨及聯(lián)合用50 nmol/L毛喉素和20 nmol/L硼替佐米處理H929-R細胞。同時設溶劑對照組和空白對照組，每組3個復孔。置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48、72 h后每孔分別加入10 μL CCK-8溶液（購自日本同仁化學研究所），混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀振蕩，以空白對照孔調(diào)零，測450 nm處各孔吸光度（D）值。按公式：細胞增殖抑制率（%）=（1-D實驗組/D對照組）×100% 進行計算。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率和線粒體跨膜電位

1.4.1細胞周期檢測

分別收集上述單獨及聯(lián)合用50 nmol/L毛喉素和20 nmol/L硼替佐米處理的細胞，經(jīng)PBS洗滌后加入75%乙醇，－20 ℃固定過夜；加入1×PBS 10 mL混勻，800×g離心5 min，離心半徑為8.5 cm，洗滌2次，分別加入100 mg/mL Rnase 37 ℃溫育30 min；采用100 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后行流式細胞儀檢測。所有數(shù)據(jù)由美國Beckman Coulter公司的Multicycle軟件收集、存儲和分析。

1.4.2細胞凋亡率檢測

根據(jù)Annexin-Ⅴ/FITC凋亡檢測試劑盒（購自美國BD公司）說明，將不同處理組細胞PBS洗滌后加入1 mL結合緩沖液，漂洗細胞1次。依次加入100 μL結合緩沖液及3 μL Annexin-Ⅴ/FITC，重懸混勻，避光溫育15 min，再加入3 μL PI，避光溫育3 min；每管加入結合緩沖液350 μL，1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.4.3線粒體跨膜電位檢測

將對照及各組H929-R細胞以1 mL培養(yǎng)液重懸。按照線粒體凋亡檢測試劑盒（購自美國Biovision公司）說明，分別加入10 μg/mL線粒體凋亡檢測試劑羅丹明（Rh123），并于37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中溫育30 min，800×g離心5 min，離心半徑8.5 cm，去除上清液，PBS洗滌1次。以250 μg/mL PI染色，流式細胞儀檢測，Rh123/PI熒光強度即為線粒體跨膜電位。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測細胞凋亡相關基因mRNA表達

以4×105個/mL密度接種H929-R細胞于6孔板。實驗組分別單獨及聯(lián)合用50 nmol/L毛喉素和20 nmol/L硼替佐米，對照組加入0.5%DMSO，每孔設復孔2個；置37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h收集細胞，抽提細胞總RNA反轉錄，進行PCR擴增；PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸40 s，共40個循環(huán)。檢測細胞caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Mcl-1基因的表達（各基因上下游引物見表1），ΔCt=Ct各組的值-CtGAPDH值，以2-ΔΔCt方法計算基因表達量。

1.6蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測細胞凋亡相關蛋白表達

在PBS洗滌后的各組H929-R細胞中加入細胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍定量后，取各組等量總蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，常規(guī)轉膜；室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應一抗（包括Bcl-2和Mcl-1），4 ℃過夜；經(jīng)含0.1%Tween-20的PBS充分洗滌后與相應稀釋度的二抗室溫反應1 h，顯影掃描保存。所用抗體均購自美國Santa Cruz公司。MM患者骨髓單個核細胞分選及CD138+細胞分選均按文獻［4］報道的方式進行。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。成組設計t檢驗法比較各組間差異。結果以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1毛喉素和硼替佐米聯(lián)合對H929-R生長的影響

硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞株H929-R經(jīng)50 nmol/L毛喉素和20 nmol/L硼替佐米單獨或聯(lián)合處理48 h后，形態(tài)學觀察顯示：同單藥組相比，聯(lián)合處理組細胞出現(xiàn)核固縮、碎裂等典型凋亡形態(tài)學改變。Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細胞凋亡也顯示：細胞在聯(lián)合處理組凋亡率明顯增加，并呈時間依賴性。72 h后，聯(lián)合處理組細胞幾乎全部凋亡。聯(lián)合處理組細胞凋亡率和硼替佐米組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

2.2毛喉素和硼替佐米聯(lián)合對H929-R細胞周期和線粒體跨膜電位的影響

經(jīng)50 nmol/L 毛喉素和20 nmol/L硼替佐米單獨或聯(lián)合處理H929-R48 h后，與單藥組相比，聯(lián)合處理組細胞明顯阻滯在細胞周期的靜止期（G0期）和DNA合成前期（G1期），相應地，DNA合成期（S期）細胞減少，但DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期）細胞無明顯改變。20 nmol/L硼替佐米單獨處理后的細胞周期分布則未見明顯變化。Rh123是一種親脂性陽離子熒光染料，可發(fā)射綠色熒光被線粒體吸收，其吸收量與△Ψm呈正比。H929-R細胞經(jīng)PI和Rh123雙染后分為PI-Rh123high、PI-Rh123low和PI+Rh123low共3個亞群，分別代表正常細胞（ΔΨm正常，膜完整）、凋亡細胞（ΔΨm崩潰，膜尚完整）和死亡細胞（ΔΨm崩潰，膜破壞）。H929-R經(jīng)50 nmol/L 毛喉素和20 nmol/L硼替佐米單獨或聯(lián)合處理后，聯(lián)合處理組的PI-Rh123low染色細胞相比硼替佐米單藥組明顯增多（P＜0.05，表3）。

表 1　RT-PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR

表 2　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R生長的影響Tab. 2 Efect of forskolin alone or combined with bortezomib on the survival of bortezomib resistance myeloma cell lines H929R

表 2　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R生長的影響Tab. 2 Efect of forskolin alone or combined with bortezomib on the survival of bortezomib resistance myeloma cell lines H929R

H929-R cells were treated with forskolin alone or in combinatiton with bortezomib for 48 and 72 h； *： P＜0.05 relative to untreated cells

G r o u p　S a m p l e / n　A p o p t o s i s / % 4 8 h　7 2 h C o n t r o l　6　0 . 4 ± 0 . 3　1 . 0 ± 0 . 6 F o r s k o l i n　6　2 5 . 8 ± 1 . 4　3 2 . 3 ± 0 . 4 B o r t e z o m i b　6　2 0 . 7 ± 3 . 9　3 0 . 4 ± 1 . 9 F o r s k o l i n + b o r t e z o m i n　6　5 9 . 3 ± 1 0 . 3*　8 2 . 6 ± 5 . 7*

2.3毛喉素和硼替佐米聯(lián)合對H929-R細胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子mRNA表達的影響

H929-R細胞分別經(jīng)50 nmol/L 毛喉素和20 nmol/L硼替佐米單獨或聯(lián)合處理48 h后，聯(lián)合處理組細胞內(nèi)Bcl-2 和Mcl-1的mRNA水平相比單藥組明顯下降（P＜0.05），而caspase-3及caspase-9 mRNA表達則明顯升高（P＜0.05，表4）。

2.4毛喉素單獨及聯(lián)合硼替佐米對硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞內(nèi)線粒體相關蛋白表達的影響

H929-R細胞經(jīng)50 nmol/L毛喉素單獨或聯(lián)合20 nmol/L硼替佐米處理后，細胞內(nèi)線粒體相關的抗凋亡蛋白Bcl-2及Mcl-1的蛋白表達水平顯著下降（圖1）。而硼替佐米單藥對該細胞內(nèi)的上述調(diào)控蛋白表達無明顯影響。

圖 1　Western blot檢測毛喉素聯(lián)合硼替佐米對H929-R細胞內(nèi)Bcl-2及Mcl-1蛋白表達的影響Fig. 1 The expression of Mcl-1 and Bcl-2 protein in H929-R cells treated with forskolin alone or in combinatiton with bortezomib for 48 h was tested by Western blot

2.5毛喉素聯(lián)合硼替佐米對硼替佐米耐藥原代細胞的影響

收集和分選硼替佐米耐藥MM患者的原代細胞內(nèi)CD138+細胞，經(jīng)50 nmol/L毛喉素單獨或聯(lián)合20 nmol/L硼替佐米處理48 h后，CD138+原代細胞的凋亡率在聯(lián)合處理組明顯增加，而硼替佐米單藥對該耐藥患者的CD138+細胞無明顯影響。聯(lián)合處理組的CD138+細胞凋亡率與硼替佐米單藥組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

表 3　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R細胞周期和線粒體跨膜電位的影響Tab. 3 Sensitivity of bortezomib resistance MM cell lines to combination of forskolin （50 nmol/L） and bortezomib （20 nmol/L）（%，x±s）

表 3　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R細胞周期和線粒體跨膜電位的影響Tab. 3 Sensitivity of bortezomib resistance MM cell lines to combination of forskolin （50 nmol/L） and bortezomib （20 nmol/L）（%，x±s）

H929-R cells were treated with forskolin alone or in combinatiton with bortezomib for 48 h； *： P＜0.05 relative to untreated cells

G r o u p　S a m p l e / n　C e l l c y c l e　P I -R h 1 2 3lowG0/ G1　S　G2/ M C o n t r o l　6　3 2 . 0 ± 1 . 2　3 6 . 8 ± 0 . 8　3 1 . 6 ± 1 . 4 0　2 . 0 6 ± 1 . 3 4 F o r s k o l i n　6　4 2 . 6 ± 0 . 6　2 5 . 6 ± 2 . 3　3 1 . 8 ± 0 . 4 5　4 0 . 2 0 ± 0 . 6 9 B o r t e z o m i b　6　3 0 . 1 0 ± 1 . 3　3 2 . 5 ± 2 . 1　3 7 . 4 ± 2 . 0 4　2 5 . 0 6 ± 0 . 8 6 F o r s k o l i n + b o r t e z o m i b　6　5 8 . 9 ± 1 . 6*　1 0 . 5 ± 1 . 6*　3 0 . 6 ± 1 . 0 5*　8 5 . 0 ± 1 . 4 5*

表 4　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R細胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子mRNA表達的影響Tab. 4 Reactivation of gene expression by forskolin combined with bortezomib treatment in bortezomib resistance myeloma cell lines H929-R

表 4　毛喉素（50 nmol/L）單獨及聯(lián)合硼替佐米（20 nmol/L）對H929-R細胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子mRNA表達的影響Tab. 4 Reactivation of gene expression by forskolin combined with bortezomib treatment in bortezomib resistance myeloma cell lines H929-R

H929-R cells were treated with forskolin alone or in combination with bortezomib for 48 h， *： P＜0.05 relative to untreated cells

G r o u p　S a m p l e / n　C a s p a s e -9　C a s p a s e -3　B c l -2　M c l -1 C o n t r o l　6　1 . 0 0 ± 0 . 0 0　1 . 0 0 ± 0 . 0 0　1 . 0 0 ± 0 . 0 0　1 . 0 0 ± 0 . 0 0 F o r s k o l i n　6　1 . 4 3 ± 0 . 3 6　1 . 6 3 ± 0 . 5 6　0 . 6 2 ± 0 . 2 1　0 . 5 3 ± 0 . 2 5 B o r t e z o m i b 　6　1 . 0 6 ± 0 . 6 5　1 . 2 6 ± 0 . 4 8　1 . 0 3 ± 0 . 0 5　1 . 2 0 ± 0 . 0 6 F o r s k o l i n + b o r t e z o m i b　6　2 . 0 5 ± 0 . 8 5*　2 . 1 2 ± 0 . 5 4*　0 . 4 2 ± 0 . 0 4*　0 . 3 7 ± 0 . 0 8*

圖 2　毛喉素聯(lián)合硼替佐米對骨髓瘤原代細胞生長的的影響Fig. 2 Efect of forskolin alone or combined with bortezomib on the survival of primary MM cells *：P＜0.05， as compared with each other

3　討 論

研究顯示，cAMP信號通路與包括MM在內(nèi)的多種惡性淋巴細胞異常增殖和凋亡受抑密切相關，調(diào)變該通路可以改變惡性淋巴細胞生物學行為［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，cAMP擬似物8-CPT-cAMP通過調(diào)變MM細胞內(nèi)凋亡相關蛋白（如Bcl-2和Bax等）而誘導MM細胞增殖阻滯和凋亡，但所需劑量較高而且作用時間較長［9］，提示單一cAMP通路調(diào)節(jié)劑對MM細胞作用有限。

硼替佐米作為蛋白酶體抑制劑已成功應用于MM的臨床治療，其主要通過調(diào)變MM細胞內(nèi)NF-κB途徑和抑制MM細胞內(nèi)蛋白酶體活性誘導MM細胞凋亡［5］。盡管硼替佐米為基礎的聯(lián)合化療方案顯示良好的臨床反應率，但是仍然有相當一部分MM患者緩解后短期內(nèi)復發(fā)并對硼替佐米發(fā)生耐藥，部分MM患者無法耐受其不良反應［6］，說明硼替佐米治療MM也有其局限性。進一步研究顯示，NF-κB信號通路、細胞凋亡途徑、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）以及部分原癌基因的表達異常與硼替佐米耐藥密切相關。因此，進一步探究硼替佐米作用機制，特別是其耐藥機制是當前研究熱點之一［7］。

鑒于此，本研究采用內(nèi)源性提高細胞內(nèi)cAMP的腺苷酸環(huán)化酶激動劑毛喉素與硼替佐米聯(lián)合處理硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞株H929-R，觀察通過內(nèi)源性提高細胞內(nèi)cAMP水平對克服硼替佐米耐藥的影響。結果提示，毛喉素聯(lián)合硼替佐米可抑制H929-R細胞生長，促使細胞停滯在G0/G1期。同時，經(jīng)兩藥聯(lián)合處理48 h的H929-R細胞呈現(xiàn)典型凋亡的形態(tài)學改變，Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示，細胞在聯(lián)合處理組凋亡率明顯增加。

研究發(fā)現(xiàn)，提高MM細胞株U266和INA6細胞內(nèi)cAMP水平能夠誘導細胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降及其下游caspase-9、caspase-3和PARP的活化，提示激活MM細胞內(nèi)cAMP信號通路可能通過經(jīng)典線粒體凋亡途徑來誘導MM細胞凋亡［8］。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)，毛喉素聯(lián)合硼替佐米可以誘使H929-R細胞線粒體跨膜電位改變。另外，RTFQ-PCR檢測結果顯示，聯(lián)合處理后，H929-R細胞內(nèi)線粒體凋亡相關基因caspase-9及caspase-3的轉錄水平明顯增高，而抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的轉錄水平則顯著降低，并且Western blot檢測結果也顯示，Bcl-2和Mcl-1的蛋白水平同樣在聯(lián)合處理組明顯下降。這提示毛喉素聯(lián)合硼替佐米可能通過介導線粒體凋亡途經(jīng)及下調(diào)抗凋亡家族蛋白Bcl-2和Mcl-1來誘導耐藥細胞株凋亡，但其具體作用機制有待深入研究。本實驗在硼替佐米耐藥患者的原代細胞中進行驗證，發(fā)現(xiàn)毛喉素聯(lián)合硼替佐米可明顯誘導硼替佐米耐藥原代細胞的凋亡。

綜上所述，毛喉素通過提高細胞內(nèi)cAMP含量介導線粒體凋亡途徑和下調(diào)耐藥細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1來克服硼替佐米耐藥效應，這為制定治療硼替佐米耐藥骨髓瘤的新型聯(lián)合化療方案提供了實驗及理論基礎。

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Experimental study on forskolin combined with bortezomib inducing apoptosis in bortezomib-resistant multiple myeloma cells

WANG Yingying， ZHONG Yao， YU Yehua， TANG Yong， HANG

Haifang， ZHU Qi （Department of Hematology， Shanghai Ninth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200011， China）
Correspondence to： ZHU Qi E-mail： zhuqi70@hotmail.com

Background and purpose： Although bortezomib has become one of the major therapeutic agents against newly diagnosed or relapsed multiple myeloma （MM）， there are some patients who become resistant to bortezomib and then relapse， emerging as a major obstacle to long-term survival of MM patients. It has been found that elevation of intracellular cyclic adenosine monophosphate （cAMP） levels could induce cell cycle arrest and apoptosis in MM cells，which has become an interesting approach to MM therapy. This study aimed to investigate possible efects of forskolin combined with bortezomib on bortezomib-resistant myeloma cells and further explore its mechanisms. Methods： The bortezomib-resistant MM cell lines H929-R and primary cells from patients who do not respond to bortezomib were used as in vitro models. The infuences of bortezomib and/or forskolin on MM cells were evaluated through cellular morphology， changes of cell distribution and apoptotic rate. Meanwhile， fow cytometry analysis was used to detect mitochondrial transmembrane potential （ΔΨm） and the expression levels of apoptosis regulators in these cells before and after the treatment were detected by Western blot. Results： Bortezomib （20 nmol/L） synergized with forskolin （50 nmol/L） to induce apoptosis of H929-R cells and bortezomib-resistant primary cells. In addition， bortezomib synergized with forskolin to induce collapse of mitochondrial transmembrane and facilitate the degradation of anti-apoptosis proteins including Bcl-2 and Mcl-1. Conclusion： Bortezomib could synergize with forskolin to induce apoptosis in bortezomib-resistant MM cells.

Forskolin； Bortezomib； Multiple myeloma cell； Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.09.010

R733.3

A

1007-3639（2016）09-0784-06

2016-02-11

2016-05-22）

上海市自然科學基金（13ZR1423800）。通信作者：朱 琦 E-mail：xzhuqi70@hotmail.com