BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱為治療三陰性乳腺癌提供新的治療方案

陳玉麗，朱勤偉，隋曉梅，王秀春

1.濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261041；

2.濰坊市中醫(yī)院，山東 濰坊 261041；

3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院放療科，山東 濰坊 261042

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BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱為治療三陰性乳腺癌提供新的治療方案

陳玉麗1，朱勤偉2，隋曉梅3，王秀春3

1.濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261041；

2.濰坊市中醫(yī)院，山東 濰坊 261041；

3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院放療科，山東 濰坊 261042

背景與目的：乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐漸上升，特別是三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）缺乏有效的治療靶點，死亡率更高。在以往的研究中，BRD4在多種腫瘤的進展中起到重要的作用。該研究旨在研究BRD4在耐吉西他濱的TNBC中所起到的作用，聯(lián)合BRD4沉默和吉西他濱治療TNBC的效果。方法：分別應用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MDA-MB-453在吉西他濱治療中表達變化。BRD4被shBRD4沉默后，通過體內(nèi)和體外實驗驗證BRD4在耐藥的TNBC中所起到的作用。結果：在TNBC中，BRD4在吉西他濱誘導后表達量明顯的升高（P＜0.05）。沉默BRD4基因后，吉西他濱的半數(shù)抑制率明顯降低，BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱使細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；在體外實驗中，BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱可以使腫瘤的生長速度明顯降低（P＜0.05）。結論：BRD4在耐藥的TNBC中起到重要的作用，BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱為治療TNBC提供新的治療方法。

三陰性乳腺癌； BRD4； 吉西他濱

近年來，乳腺癌發(fā)病率不斷升高。有文獻報道，乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］。目前，按照乳腺癌的基因表型可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性型和三陰型（triple-negative breast cancer，TNBC），其中Luminal型和HER-2陽性型在手術及放化療后，給予內(nèi)分泌、靶向治療后其死亡率明顯下降。TNBC約占全部乳腺癌的15%，分子表型為雌激素受體、孕激素受體、HER-2均為陰性，由于缺乏特異性靶點，所以治療方法只能選擇手術和放化療［2-3］。目前TNBC主要以蒽環(huán)類聯(lián)合紫杉類藥物為主的化療方案，但是患者出現(xiàn)復發(fā)耐藥時，就需要研究新的治療方案［4］。經(jīng)證實，吉西他濱在治療TNBC中具有較好的效果［5-6］，但是也有研究認為，TNBC在應用吉西他濱治療過程中容易出現(xiàn)耐藥［7］。因此，需要進一步地研究乳腺癌的發(fā)病機制，以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，更好地治療TNBC。

BRD4是BET蛋白家族成員，BET蛋白家族由BRDT、BRD2、BRD3和BRD4組成。應用BRD4的靶向藥物JQ1可以有效地控制急性白血病、胰腺癌、黑素瘤、骨肉瘤、前列腺癌和惡性周圍性神經(jīng)鞘瘤等腫瘤［8-11］。而最近的研究報道證實，BRD4在乳腺癌的進展中起到重要的作用［12］。然而，BRD4在藥物抵抗方面的研究目前闡述不清楚，這就需要進一步明確BRD4在TNBC中的作用和與藥物抵抗之間的關系。本研究旨在探討B(tài)RD4在耐吉西他濱的TNBC中的作用，以及沉默BRD4基因聯(lián)合吉西他濱治療TNBC的效果。

1　材料和方法

1.1材料

人TNBC細胞株MDA-MB-231和MDAMB-453購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司。BRD4多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。β-actin單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。BRD4引物購自上?；ぱ芯吭?。shBRD4由漢恒生物科技（上海）有限公司構建。

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及給藥方法

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MDAMB-453在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。所有的實驗細胞均處于對數(shù)生長期。用2 μmol/L的吉西他濱分別誘導TNBC細胞株24、48 h。

1.2.2建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shBRD4的MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞株

shBRD4由漢恒生物科技（上海）有限公司構建。shBRD4序列為5'-CAGACATCCACACACAGTA-3'，shcontrol序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。轉(zhuǎn)染前一天鋪6孔板，轉(zhuǎn)染時細胞密度為50%，細胞培養(yǎng)基被含有100 μL （1×108TU/mL）的病毒懸浮液和8 μg/mL 的 polybrene的1 mL無血清培養(yǎng)基更換，溫育24 h后，轉(zhuǎn)染細胞用含有3 μg/mL嘌呤霉素的含血清細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，嘌呤霉素抵抗的細胞株篩選3代后，通過蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）驗證沉默BRD4的效率。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測

每組細胞的總RNA通過TRIzol試劑抽提。按照寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄。反應條件：95 ℃ 2 min；60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。BRD4順義鏈為5'-CCCAATTACAACCCCGACATC-3'，反義鏈為5'- TCACCCGCAGTTTCACTCCT-3'；β-actin順義鏈為5'- GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，反義鏈為5'- ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'。

1.2.4Western blot檢測

加入蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，震蕩離心后抽提總蛋白。采用BCA法測定總蛋白濃度，將等量蛋白（25 μg）加入緩沖液后煮沸使蛋白變性。隨后在10% SDS-PAGE上電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗置于4 ℃冰箱溫育過夜。第2天，采用TBST沖洗30 min后，加入HRP標記的二抗在室溫溫育2 h，增強化學發(fā)光法顯影。

1.2.5MTT法檢測

采用MTT法檢測沉默BRD4前后吉西他濱對MDA-MB-231和MDA-MB-453的半數(shù)抑制率IC50值。

1.2.6動物實驗

4周齡雌性BALB/c裸鼠均購自揚州大學動物實驗中心，在SPF級動物實驗中心喂養(yǎng)并進行實驗。將shcontrol和shBRD4 MDA-MB-231細胞株分別注射到動物皮下，各12只，然后將兩組裸鼠分別再隨機分為shcontrol組，shcontrol+吉西他濱組，shBRD4組和shBRD4+吉西他濱組，每組6只，每5 d檢查腫瘤的體積，到25 d處死裸鼠，切除腫瘤，拍照，并稱量腫瘤的質(zhì)量。腫瘤體積計算公式為V（mm3）=0.5×長軸×短軸2。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0對所有的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。所有實驗均重復3次。數(shù)值的記錄方法為x±s，兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗方法進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

圖 1　BRD4經(jīng)吉西他濱誘導后表達明顯升高Fig. 1 The expression of BRD4 was increased in TNBC treated with gemcitabine*： P＜0.05， as compared with shcontrol. A， C： BRD4 expression in MDA-MB-231 cells； B， D： BRD4 expression in MDA-MB-453 cells

2.1吉西他濱誘導后BRD4在TNBC細胞株中表達升高

為了研究BRD4在TNBC耐藥中所起的作用，本研究首先研究BRD4在應用吉西他濱誘導MDA-MB-231和MDA-MB-453前后表達量的變化。應用2 μg/mL的吉西他濱誘導2種細胞株24或48 h后，通過Western blot和RT-PCR的方法，證實在細胞株中蛋白表達和mRNA表達明顯增加（圖1）。這種增加可能是乳腺癌細胞的一種適應性反應。

2.2沉默BRD4對吉西他濱誘導TNBC細胞株凋亡的影響

為了進一步地明確BRD4在TNBC中對吉西他濱耐藥中所起到的作用，首先建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了shBRD4和shcontrol的MDA-MB-231和MDAMB-453，用Western blot驗證其沉默效率。通過流式細胞術檢查細胞的凋亡率證實吉西他濱可以使MDA-MB-231和MDA-MB-453的凋亡率升高，而沉默BRD4可以使細胞凋亡率明顯升高。進一步研究吉西他濱的IC50值變化，結果發(fā)現(xiàn)，IC50值明顯減少（圖2）。

2.3在體外實驗中沉默BRD4對腫瘤生長速度的影響

本研究首先將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shBRD4和shcontrol的MDA-MB-231細胞株種植于裸鼠皮下并成瘤，然后分為shcontrol組、shcontrol+吉西他濱組、shBRD4組和shBRD4+吉西他濱組，每組6只。每3 d測量腫瘤的的大小，直到第25天，處死裸鼠后，取出腫瘤后拍照圖，腫瘤稱重，證實雖然BRD4和吉西他濱都可以減慢腫瘤的生長速度，但是當沉默BRD4后可以明顯減慢腫瘤的生長速度，說明他們具有協(xié)同治療作用（圖3）。

圖 2　沉默BRD4后增加TNBC對吉西他濱的敏感性Fig. 2 BRD4 silencing sensitized TNBC cells to gemcitabine in vitro*： P＜0.05， as compared with shcontrol； A： BRD4 expression in MDA-MB-231 cells； B： BRD4 expression in MDA-MB-453 cells； C： MDAMB-231 cells apoptosis； D： DA-MB-453 cells apoptosis； E： IC50of MDA-MB-231 shcontrol and MDA-MB-231 shBRD4； F： IC50of MDAMB-453 shcontrol and MDA-MB-453 shBRD4

圖 3　BRD4沉默后，腫瘤的生長速度明顯降低Fig. 3 BRD4 knockdown plus gemcitabine signifcantly suppressed the tumor growth in vivo*： P＜0.05， as compared with shcontrol； A： Tumor growth of diferent groups； B： Tumor weight of diferent groups； C： Tumor volume of diferent groups

3　討 論

本研究證實，BRD4在TNBC中可以增加藥物抵抗性。此外，在體內(nèi)和體外試驗中均證實吉西他濱和沉默BRD4基因可以協(xié)同治療TNBC，說明BRD4是治療TNBC的有效靶點。目前以手術為主的綜合治療，并沒有有效地改善TNBC患者的總生存率。目前TNBC缺乏特異性的靶向治療目標，這就需要我們尋找TNBC的發(fā)病機制，并找到新的治療方法。

近年來的研究已經(jīng)證實，在胰腺癌、惡性黑素瘤、骨肉瘤和惡性周圍型神經(jīng)鞘瘤中，通過抑制BRD4基因的表達可以有效地抑制上述腫瘤的進展。最新的研究證實，BRD4在乳腺癌中促進腫瘤的進展，然而尚無與藥物耐藥的相關研究，這就需要闡述BRD4在乳腺癌耐藥中的作用，并為治療乳腺癌提供新的治療靶點。

為了研究BRD4在乳腺癌耐藥中的作用，本研究首先檢測其在藥物治療中是否起到適應性反應，在乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MDAMB-453中加入吉西他濱，在藥物的誘導下，BRD4的表達明顯升高，這說明BRD4在DNA損傷應激反應中可能起到適應性反應。為了進一步研究BRD4是否在乳腺癌的耐藥中所起作用，本研究在TNBC細胞株中沉默BRD4基因，通過Western blot檢測驗證沉默效率，接著比較shcontrol組、shcontrol+吉西他濱組、shBRD4組和shBRD4+吉西他濱組在24和48 h的凋亡率。結果證實，雖然在乳腺癌中沉默BRD4基因或者采用吉西他濱均可以提高腫瘤細胞的凋亡率，但是當沉默BRD4基因+吉西他濱組卻明顯增加了乳腺癌細胞的凋亡率，說明沉默BRD4基因和吉西他濱治療乳腺癌具有協(xié)同治療作用。

為了進一步研究其在治療中所起到的作用，進行裸鼠成瘤實驗以驗證BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱治療乳腺癌的作用。結果證實，在shBRD4+吉西他濱組，腫瘤的生長速度明顯減慢，腫瘤種植25 d后，腫瘤質(zhì)量較shcontrol組明顯減少，說明在體內(nèi)實驗中，shBRD4聯(lián)合吉西他濱組可以明顯抑制腫瘤的生長速度。

綜上所述，本研究證實BRD4在TNBC的吉西他濱耐藥中起到重要的作用，通過在TNBC中沉默BRD4聯(lián)合吉西他濱可以有效地治療TNBC。

［1］ SIEGEL R, MA J, ZOU Z, et al. Cancer statistics, 2014［J］. CA Cancer J Clin, 2014, 64（1）： 9-29.

［2］ ANDREOPOULOU E, SCHWEBER S J, SPARANO J A, et al. Therapies for triple-negative breast cancer［J］. 2015, 16（7）：983-998.

［3］ WAHBA H A, EL-HADAAD H A. Current approaches in treatment of triple-negative breast cancer［J］. Expert Opin Pharmacother, 2015, 12（2）： 106-116.

［4］ LIEDTKE C, RODY A. New treatment strategies for patients with triple-negative breast cancer［J］. Oncotarget, 2015, 27（1）： 77-84.

［5］ HU X C, ZHANG J, XU B H, et al. Cisplatin plus gemcitabine versus paclitaxel plus gemcitabine as first-line therapy for metastatic triple-negative breast cancer （CBCSG006）： a randomised, open-label, multicentre, phase 3 trial［J］. Lancet Oncol, 2015, 16（4）： 436-446.

［6］ ZHANG J, FAN M, XIE J, et al. Chemotherapy of metastatic triple-negative breast cancer： Experience of using platinumbased chemotherapy［J］. 2014, 6（40）： 43135-43143.

［7］ O'SHAUGHNESSY J, SCHWARTZBERG L, DANSO M A, et al. Phase Ⅲ study of iniparib plus gemcitabine and carboplatin versus gemcitabine and carboplatin in patients with metastatic triple-negative breast cancer［J］. J Clin Oncol, 2014, 32（34）： 3840-3847.

［8］ ASANGANI I A, DOMMETI V L, WANG X, et al. Therapeutic targeting of BET bromodomain proteins in castration-resistant prostate cancer［J］. 2015, 510（7504）： 278-282.

［9］ HU Y, ZHOU J, YE F, et al. BRD4 inhibitor inhibits colorectal cancer growth and metastasis［J］. Int J Mol Sci, 2015, 16（1）：1928-1948.

［10］ VENKATARAMAN S, ALIMOVA I, BALAKRISHNAN I, et al. Inhibition of BRD4 attenuates tumor cell self-renewal and suppresses stem cell signaling in MYC driven medulloblastoma［J］. Oncotarget, 2014, 5（9）： 2355-2371.

［11］ WANG Y H, SUI Y N, YAN K, et al. BRD4 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell proliferation and enhances gemcitabine resistance［J］. Oncol Rep, 2015, 33（4）： 1699-1706.

［12］ BIHANI T, EZELL S A, LADD B, et al. Resistance to everolimus driven by epigenetic regulation of MYC in ER+ breast cancers［J］. Oncotarget, 2015, 6（4）： 2407-2420.

BRD4 scilencing plus gemcitabine may be a novel therapy for triple-negative breast cancer

CHEN Yuli1， ZHU Qinwei2， SUI Xiaomei3， WANG Xiuchun3 （1. Weifang Medical University， Weifang 261041，Shandong Province， China； 2. The Traditional Chinese Medicine Hospital of Weifang， Weifang 261041，Shandong Province， China； 3. Department of Radiotherapy of the Afliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261042， Shandong Province， China）

SUI Xiaomei E-mail： suixiaomei2000@126.com

Background and purpose： Breast cancer has the highest morbidity and mortality rate in women worldwide. Triple-negative breast cancer （TNBC） has no specifc target and has low survival rate. Recent studies have verifed BRD4 could promote tumor progression. This study aimed to detect the expression level of BRD4 in TNBC after treatment with gemcitabine， and to reveal the efect of BRD4 silencing plus gemcitabine as a treatment for TNBC. Methods： The expression of BRD4 in TNBC cell lines treated with gemcitabine was detected by reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western blot. The efect of BRD4 silencing plus gemcitabine in TNBC was illustrated in vitro and in vivo. Results： The expression of BRD4 in TNBC was signifcantly increased after treatment with gemcitabine. In vitro， BRD4 knockdown signifcantly lowered the IC50value. The apoptotic rate of TNBC was signifcantly increased in the BRD4 silencing plus gemcitabine group compared to the other. The growth rate of tumor in vivo was signifcantly lowered in the BRD4 silencing plus gemcitabine group. Conclusion： BRD4 may play an important role in the drug resistance to gemcitabine in TNBC. BRD4 silencing plus gemcitabine may be a novel treatment strategy for TNBC.

Triple-negative breast cancer； BRD4； Gemcitabine

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.09.005

R737.9

A

1007-3639（2016）09-0750-06

2016-01-21

2016-04-24 ）

濰坊市衛(wèi)生局科研立項項目（2014037）。通信作者：隋曉梅 E-mail：suixiaomei2000@126.com