桂花組織基因表達中熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

付建新，張　超，王藝光，趙宏波，2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

桂花組織基因表達中熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

付建新1，張超1，王藝光1，趙宏波1，2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

為了篩選桂花Osmanthus fragrans不同組織基因表達分析中適合的內(nèi)參基因，以桂花 ‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhong Gui’花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉和1年生莖等5個不同組織為材料，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測7個候選內(nèi)參基因的表達水平，并利用geNorm，NormFinder和BestKeeper軟件對各候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價，最后利用桂花不同組織中OfCRTISO1基因相對表達水平驗證篩選的內(nèi)參基因的可靠性。結(jié)果表明：綜合3個軟件的評價排序，確定不同組織中最佳內(nèi)參基因為OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差內(nèi)參基因。OfCRTISO1基因相對表達水平分析證實，不同組織中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2個表達最穩(wěn)定的基因組合，即可獲得更為精確的基因表達結(jié)果。旨在為桂花組織間重要基因的定量表達分析提供科學(xué)依據(jù)。圖4表4參34

植物學(xué)；桂花；內(nèi)參基因；geNorm；NormFinder；BestKeeper

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，qRTPCR）因具有靈敏度高、特異性強、精準性高、檢測范圍廣等優(yōu)點［1］，已被廣泛應(yīng)用于植物基因表達的相關(guān)研究中。利用qRT-PCR分析基因相對定量表達時，為了消除不同組織細胞間初始模板量、核糖核酸（RNA）制備和反轉(zhuǎn)錄過程中的偏差，需要引入內(nèi)參基因（reference gene）對表達結(jié)果進行校正［2-3］。實際研究中常選擇的內(nèi)參基因［4-8］只能在一定的試驗范圍內(nèi)相對穩(wěn)定表達，不能保證在所有試驗條件下均能穩(wěn)定表達［9-11］。如果盲目以一種看家基因作為任何試驗條件下的內(nèi)參基因，容易得到精確度低甚至錯誤的結(jié)果［12］，因此，在利用qRT-PCR進行基因表達分析時，根據(jù)試驗處理及不同實驗材料的特點，優(yōu)化和選擇合適的內(nèi)參基因就顯得極其重要。桂花Osmanthus fragrans是中國十大名花之一，隨著桂花分子生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，基因表達分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于揭示其觀賞性狀形成機制的研究中，因此，篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因在桂花重要基因表達分析中起著關(guān)鍵的作用。已有研究篩選出桂花不同品種、不同發(fā)育狀態(tài)花序和不同溫度處理條件中合適的內(nèi)參基因［13］，卻未對不同組織中適合的內(nèi)參基因進行篩選。本研究將以桂花 ‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhong Gui’不同組織（花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉、1年生莖）為材料，利用qRT-PCR檢測7個候選內(nèi)參基因的表達水平，并利用軟件geNorm［3］，NormFinder［2］和BestKeeper［14］對各候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價，篩選出最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，并研究桂花類胡蘿卜素異構(gòu)酶（OfCRTISO1）在不同組織中的表達模式，驗證篩選得到的內(nèi)參基因的可靠性，希冀為后續(xù)研究不同組織重要基因的定量表達提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃10 a樹齡地栽桂花 ‘堰虹桂’為試驗材料，對其花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉、1年生莖進行取樣，液氮速凍后，于-80℃儲藏備用。

1.2方法

1.2.1不同組織材料總RNA提取與cDNA的第1鏈的合成采用RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）按照說明書步驟提取各樣品的總RNA。紫外分光光度計和10.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。采用Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大連）按照說明書合成cDNA的第1鏈后，于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2內(nèi)參基因的選擇及特異性引物設(shè)計本研究從前期構(gòu)建的桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中取肌動蛋白基因（OfACT），延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α），NADP-異檸檬酸脫氫酶基因（OfIDH），GTP結(jié)合蛋白RAN1基因（OfRAN1），β微管蛋白基因（OfTUB），泛素結(jié)合酶E2基因（OfUBC2）和18S核糖體RNA基因（Of18S）等7種看家基因作為候選的內(nèi)參基因。根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5等軟件設(shè)計各候選內(nèi)參基因的qRT-PCR引物（引物序列見表1），其中Of18S引物引自文獻［5］。

表1　qRT-PCR檢測中7個候選內(nèi)參基因的引物序列Table 1　Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis

1.2.3內(nèi)參基因的qRT-PCR分析利用兩步法來進行qRT-PCR分析，在7300實時PCR儀（Applied Biosystems）運行?；赟YBR Green染料的qRT-PCR來檢測內(nèi)參基因的循環(huán)閾值Ct值，所用反應(yīng)體系和程序參考Takara 公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒的說明書。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，其中2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，上下游定量引物10.0 μmol·L-1各0.8 μL，模板cDNA 2.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用滅菌雙蒸水補齊至20.0 μL。qRT-PCR擴增采用兩步法，即在95℃預(yù)變性30 s之后，先運行40個循環(huán)的95℃5 s，60℃31 s，再運行溶解曲線階段的95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。通過觀察ABI 7300實時PCR儀在PCR反應(yīng)后生成的溶解曲線為單一峰判定所用引物無非特異擴增；實驗得到定量Ct值用于后期內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與分析本研究采用geNorm［3］，NormFinder［2］和BestKeeper［14］軟件對7種候選內(nèi)參基因在桂花不同組織中的表達穩(wěn)定性進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而篩選桂花組織基因表達中最合適的內(nèi)參基因。

1.2.5桂花OfCRTISO1基因驗證內(nèi)參基因穩(wěn)定性利用桂花不同組織中OfCRTISO1基因表達模式驗證篩選的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，其表達上游引物為5′-GAAAAACAAGGGATTCTCGGA-3′，下游引物為5′-GCAGATAGTAGGCAAGGGTCAA-3′。

2　結(jié)果與分析

2.1候選內(nèi)參基因引物評價

以桂花嫩葉的cDNA為模板，利用7對引物均能擴增出與各候選內(nèi)參基因預(yù)期大小一致的單一條帶（結(jié)果未顯示），說明這7對引物均能特異性地擴增相應(yīng)片段，可以用于qRT-PCR分析。qRT-PCR溶解曲線分析表明：這7對引物的擴增產(chǎn)物單一，可用于下一步分析。將反轉(zhuǎn)錄的嫩葉cDNA樣品以5倍濃度梯度稀釋，以此為模板進行qRT-PCR擴增后制作7種內(nèi)參基因的標準曲線，結(jié)果（表2）顯示：各內(nèi)參基因的線性相關(guān)系數(shù) R2≥0.990 0，引物的擴增效率為 97.7%～109.6%，符合qRT-PCR對擴增效率的要求。

表2　7個候選內(nèi)參基因擴增特性Table 2　Amplicon characteristics of seven candidate reference genes

2.2候選內(nèi)參基因的表達水平分析

7個候選內(nèi)參基因在不同組織中的Ct值平均為13.395～26.259（圖1），其中Of18S在所有樣品中的轉(zhuǎn)錄水平最高，Ct值最小（13.395）；而OfTUB基因的表達水平最低，Ct值最大（26.259）。從表達量變異系數(shù)看，OfRAN1最小，然后是OfUBC2，而OfIDH最大。

2.3候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性分析

本研究首先采用geNorm軟件對7個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析（圖2），結(jié)果顯示：在不同組織中，OfRAN1和OfUBC2基因的基因表達穩(wěn)定值（M）最?。∕=0.014 8），表示這2個基因表達最為穩(wěn)定，其次是OfACT（M=0.038 4）和OfEF1α （M=0.045 3）。OfIDH，OfTUB和Of18S是穩(wěn)定性排序靠后的3個候選內(nèi)參基因，其中Of18S的M值最大（M=0.158 1），是最不穩(wěn)定內(nèi)參基因。

圖1　不同組織中7個候選內(nèi)參基因的平均Ct值Figure 1　Mean Ctvalues of seven candidate reference genes in different tissues

利用geNorm程序?qū)?nèi)參基因的配對差異值Vn/n+1進行分析（圖3），發(fā)現(xiàn)所檢測的V2/3低于程序默認取舍值0.15，說明無需引入第3個基因進行校正，因此選擇表達最為穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因即OfRAN1和OfUBC2，以兩者的幾何平均值作為參照可更為準確地校正目的基因的表達。

圖2　geNorm軟件分析7個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值（M）Figure 2　Expression stability values（M）of seven candidate reference genes as calculated by geNorm

圖3　geNorm軟件分析7個候選內(nèi)參基因的配對差異值（VPV）Figure 3　Pairwise variation?。╒PV）of seven candidate reference genes as calculated by geNorm

此外，為保證結(jié)果分析的準確性，本研究還利用NormFinder和BestKeeper分析7個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性（表3），結(jié)果顯示：NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果與geNorm分析的結(jié)果整體上一致。通過3個軟件評價得到的穩(wěn)定性排序中，OfRAN1和O-fUBC2均是表達穩(wěn)定性最高的2個基因，其次是OfACT和OfEF1α，表明這2個基因在不同組織中的表達較為穩(wěn)定。而根據(jù)3個軟件的分析，OfIDH，OfTUB和Of18S是表達穩(wěn)定性最差的3個候選內(nèi)參基因。綜合3個軟件對最佳內(nèi)參基因和最差內(nèi)參基因的評價（表4），得到不同組織中最佳內(nèi)參基因為OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差內(nèi)參基因。

表3　NormFinder和BestKeeper分析7個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Table 3　Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper

2.4桂花OfCRTISO1基因驗證內(nèi)參基因穩(wěn)定性

為了驗證篩選的最佳內(nèi)參基因穩(wěn)定性是否準確，我們利用不同內(nèi)參基因或組合校正桂花不同組織中OfCRTISO1基因的相對表達（圖4）。選擇OfRAN1，OfUBC2，OfRAN1 和OfUBC2基因組合進行校正的OfCRTISO1基因表達模式相同，均在盛開花序中表達量顯著高于其他組織，在花蕾、嫩葉和成熟葉中的表達量相同，而在1年生莖中表達量最低。以穩(wěn)定性較差的其他內(nèi)參基因進行校正時，OfCRTISO1基因表達模式產(chǎn)生變化。上述結(jié)果表明：3個軟件對內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的排序結(jié)果可靠，證實OfRAN1和OfUBC2為不同組織中最佳內(nèi)參基因。

表4　最佳內(nèi)參基因和最差內(nèi)參基因綜合結(jié)果Table 4　Aggregated result of the optimal and worst reference genes

3　討論

理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同的基因型、不同發(fā)育階段、不同組織器官、不同脅迫條件下均恒定表達，但事實上，并沒有一個基因在所有試驗條件下能穩(wěn)定表達［15］，因此，需要根據(jù)不同試驗材料和不同試驗處理條件下篩選合適的內(nèi)參基因。本研究通過對7個候選內(nèi)參基因在5個不同組織中的表達穩(wěn)定性進行研究，篩選得到桂花不同組織中最佳內(nèi)參基因為OfRAN1和OfUBC2，為后續(xù)桂花不同組織中目標基因表達規(guī)律的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖4　不同內(nèi)參基因或組合校正桂花不同組織中OfCRTISO1基因的相對表達Figure 4　Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization

目前，3個統(tǒng)計分析軟件geNorm，NormFinder和BestKeeper常用于確定不同植物材料或試驗條件下最佳的內(nèi)參基因［6，13，16-17］。然而，3個軟件在許多物種中的分析結(jié)果存在差異，如芝麻Sesamum indicum［6］，黃花蒿Artemisia annua［18］和牛奶子Elaeagnus umbellata［19］。在本研究中，3個軟件的分析結(jié)果整體排序一致（圖2和表3）。OfRAN1和OfUBC2基因在geNorm和NormFinder的穩(wěn)定性排序中并列第一，而Best-Keeper軟件評價OfRAN1為表達最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，OfUBC2基因以微弱差距排列第二。綜合3個軟件分析結(jié)果確定OfRAN1和OfUBC2基因為桂花不同組織中最佳內(nèi)參基因。有研究證實：選擇2個或2個以上的內(nèi)參基因作參照，可以減弱單一內(nèi)參變化的影響，不同內(nèi)參表達的相似性有助于增加結(jié)果的可靠度及精確度［3，20-21］，因此確定OfRAN1和OfUBC2基因組合為桂花不同組織中表達分析的內(nèi)參基因可更為準確地校正桂花不同組織中目的基因的表達結(jié)果。

RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白家族的一類，在真核生物進化過程中比較保守，在許多細胞生理進程過程中發(fā)揮著重要的作用［22-24］。RAN同源基因RAN3，是金魚草Antirrhinum majus中qRTPCR分析常用的內(nèi)參基因［25-26］。通過對矮牽牛Petunia hybrida開花過程中相關(guān)候選內(nèi)參基因的篩選，證實RAN1是矮牽牛中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因之一［27］。與ACT，EF1α和TUB等其他傳統(tǒng)內(nèi)參基因相比，將RAN基因作為內(nèi)參基因進行研究和應(yīng)用的報道較少。本研究證實RAN1在桂花不同組織中穩(wěn)定表達，是最佳內(nèi)參基因之一。此外，RAN1被證實是桂花不同品種中表達量最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因［13］。與RAN基因相同，OfUBC2在桂花不同組織中也穩(wěn)定表達，是另一個最佳內(nèi)參基因。作為一個傳統(tǒng)內(nèi)參基因，UBC基因在擬南芥Arabidopsis thaliana［28-30］，月季Rosa hybrida［31］，側(cè)柏Platycladus orientalis［32］等物種的內(nèi)參基因篩選中均表現(xiàn)最佳。

本研究發(fā)現(xiàn)Of18S在桂花不同組織中表達最不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因在桂花中應(yīng)用。同樣，在丹參Salvia miltiorrhiza［33］，牡丹Paeonia suffruticosa［34］，大白菜Brassica rapa ssp.pekinensis［8］和西瓜Citrullus lanatus［16］中，Of18S基因也被證實是表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這可能與18S基因在樣品中高豐度表達有關(guān)。

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Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）normalization in the gene expression of sweet osmanthus tissues

FU Jianxin1，ZHANG Chao1，WANG Yiguang1，ZHAO Hongbo1，2
（1.School of Landscape Architecture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China；2.The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

To select the suitable reference gene（s）for gene expression analysis in different tissues of Osmanthus fragrans，five tissues：buds，fully-opened inflorescences，young leaves，adult leaves，and one-year-old stems，from O.fragrans‘Yanhong Gui’were used as materials to detect the expression levels of seven candidate reference genes by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Then，an aggregated analysis of gene expression stability for these candidates was conducted using three software programs：geNorm，NormFinder，and BestKeeper.Finally，the relative expression level of OfCRTISO1 in different tissues was analyzed to verify the reference genes selected in this study.Results of the aggregated analysis showed that OfRAN1 and OfUBC2 were the best reference genes from the different tissues，and Of18S was the worst reference gene.In addition，analysis of the relative expression level for OfCRTISO1 confirmed that OfRAN1 and O-fUBC2 were the two most stable reference genes in the qRT-PCR analysis of the tissues，and the application of OfRAN1 and OfUBC2 was enough to achieve more accurate and reliable results in these tissues.Thus，the pre-sent study has provided an important reference for analyzing the expression of key genes in different tissues of O.fragrans.［Ch，4 fig.4 tab.34 ref.］

botany；Osmanthus fragrans；reference gene；geNorm；NormFinder；BestKeeper

S687

A

2095-0756（2016）05-0727-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.001

2015-09-10；

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項目（31501790，31170656）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ15C160004）；浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金人才啟動項目（2014FR072）

付建新，講師，博士，從事園林植物遺傳育種和分子生物學(xué)研究。E-mail：fujianxin2008@sohu.com。通信作者：趙宏波，教授，博士，從事觀賞植物遺傳育種和植物繁殖生態(tài)研究。E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報，2016，33（5）：727-733

Journal of Zhejiang A＆F University