基于絡(luò)病學(xué)探討內(nèi)毒素“二次打擊”急性肺損傷大鼠的Rho/ROCK機(jī)制及川芎嗪的保護(hù)作用

李　言　梁俊清　張高峰　李　佳　楊錫蘭　陳前芬　趙士弟

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，蚌埠，233030； 2 河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，石家莊，050035)

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基于絡(luò)病學(xué)探討內(nèi)毒素“二次打擊”急性肺損傷大鼠的Rho/ROCK機(jī)制及川芎嗪的保護(hù)作用

李言1梁俊清2張高峰1李佳1楊錫蘭1陳前芬1趙士弟1

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，蚌埠，233030； 2 河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，石家莊，050035)

目的：研究?jī)?nèi)毒素血癥“瘀滯絡(luò)脈”急性肺損傷大鼠的Rho/ROCK機(jī)制及川芎嗪的保護(hù)作用。方法：以內(nèi)毒素“二次打擊”建立大鼠內(nèi)毒素血癥“瘀滯絡(luò)脈”急性肺損傷模型，分別設(shè)正常對(duì)照組、模型組、川芎嗪低劑量組、高劑量組，測(cè)定呼吸頻率、肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞(PMN)百分率、肺濕/干重比、肺組織髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性、ROCK mRNA表達(dá)量，并觀察、評(píng)估肺組織損傷嚴(yán)重程度。結(jié)果：與模型組相比，川芎嗪顯著降低呼吸頻率、PMN百分率、肺濕/干重比、MPO活性、ROCK mRNA表達(dá)量，減輕大鼠急性肺損傷病理改變。結(jié)論：川芎嗪可能通過(guò)抑制Rho/ROCK通路對(duì)內(nèi)毒素血癥“瘀滯絡(luò)脈”大鼠急性肺損傷有較好的保護(hù)作用。

絡(luò)病學(xué)；內(nèi)毒素血癥；急性肺損傷；川芎嗪；Rho/ROCK

膿毒癥(Sepsis)多為內(nèi)毒素血癥(Endotoxemia)，是現(xiàn)代急診醫(yī)學(xué)面臨的一個(gè)常見(jiàn)而復(fù)雜的難題，為全身性炎性反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)甚至多器官衰竭(Multiple Organ Failure，MOF)的前期狀態(tài)，具有高死亡率、高醫(yī)療費(fèi)用的特點(diǎn)[1]。新近發(fā)現(xiàn)中藥單體川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)可保護(hù)膿毒癥動(dòng)物心腎肺功能[2-4]，但確切機(jī)制未明。因此，繼承和發(fā)展絡(luò)病學(xué)有關(guān)理論，深入探討內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制和川芎嗪的保護(hù)作用，對(duì)于內(nèi)毒素血癥的有效防治和川芎嗪的推廣應(yīng)用都具有積極意義。

綜合相關(guān)研究表明，內(nèi)毒素血癥急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)，特征性病理生理學(xué)改變是肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成、毛細(xì)血管內(nèi)皮通透性增高，中性粒細(xì)胞黏附、遷移，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙由血管向肺泡、肺間質(zhì)外滲，釋放大量促炎介質(zhì)，由此導(dǎo)致中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷[5]。而Rho/Rho激酶(ROCK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活在血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)改變中起著關(guān)鍵作用[6-7]。

20世紀(jì)80年代以來(lái)，絡(luò)病學(xué)理論與實(shí)踐的不斷進(jìn)展[8-9]和內(nèi)毒素血癥病理機(jī)制的深入研究[10-11]，為“瘀滯絡(luò)脈”病機(jī)假說(shuō)提供了初步的現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。有學(xué)者研究表明，川芎嗪有抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的作用[12]。川芎嗪是否通過(guò)減輕骨架重構(gòu)、通絡(luò)排毒，防治內(nèi)毒素血癥？源于此，本研究基于絡(luò)病學(xué)，試圖揭示內(nèi)毒素血癥“瘀滯絡(luò)脈”病機(jī)假說(shuō)的現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)，探討中藥單體川芎嗪對(duì)內(nèi)毒素血癥急性肺損傷時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)、血管內(nèi)皮屏障損傷的影響及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年Wistar大鼠，體重200～250 g(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002)，雌雄各半。

1.2試劑及儀器內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)055:B5(美國(guó)Sigma公司)；注射用鹽酸川芎嗪(批號(hào)：20140403，80 mg/瓶；合肥平光制藥有限公司)；呼吸頻率監(jiān)測(cè)儀(Model RM-80，美國(guó)Columbus Instruments)；第一條鏈合成試劑盒(天根生化有限公司)；PCR master mix(Fermentas公司)；MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2　方法

2.1動(dòng)物模型制備將LPS溶于0.9%生理鹽水(NS)制成1 mg/mL溶液備用。大鼠隨機(jī)分為4組：G1(生理鹽水對(duì)照組)，G2(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，G3(低劑量TMP組)和G4(高劑量TMP組)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)G1組腹腔注射生理鹽水1 mL/kg體重作為對(duì)照，其余各組大鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg)進(jìn)行首次打擊(圖1)。16 h后，所有動(dòng)物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，仰位于60°的平板上。行頸部正中手術(shù)暴露氣管，G1組氣管滴注NS(1 mL/kg)，其余各組大鼠氣管滴注LPS(3 mg/kg)進(jìn)行二次打擊；此后每只大鼠通過(guò)1 mL注射器注入0.1 mL空氣[13]。大鼠滴注后垂直位旋轉(zhuǎn)0.5～1 min以使滴注液均勻分布到肺部。

圖1　圖示動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)流程：大鼠隨機(jī)分為4組(G1～G4)

注：G1(生理鹽水對(duì)照組)，G2(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，G3(低劑量TMP組)和G4(高劑量TMP組)。(▼:實(shí)驗(yàn)終點(diǎn))

2.2川芎嗪應(yīng)用G3和G4組在首次打擊之前30 min和二次打擊之后30 min，腹腔注射TMP(G3)40 mg/kg或TMP(G4)80 mg/kg生理鹽水溶液，其余各自同樣時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。

2.3檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1呼吸頻率利用全身體積描記(Whole-body Plethysmography)-呼吸頻率監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)呼吸頻率，并以此反映肺功能的損傷情況。靜息狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量4次取平均值。

2.3.2肺組織病理檢測(cè)呼吸頻率后過(guò)量麻醉動(dòng)物并處死，開(kāi)胸取右下肺(n=6)，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片、染色、封片等步驟，用普通光學(xué)顯微鏡觀察切片。切片由病理醫(yī)師雙盲觀測(cè)和評(píng)分[14]。

2.3.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細(xì)胞百分率是急性肺損傷白細(xì)胞炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志。大鼠處死后進(jìn)行左肺支氣管肺泡灌洗(n=6)，以2 mL生理鹽水灌洗左肺，反復(fù)3次，總回收量約為5 mL。將BALF以300×g速度4 ℃離心，取沉渣涂片，瑞士-吉姆薩染色，光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞百分率。

2.3.4肺濕/干重比測(cè)定生理鹽水沖洗右上肺表面血污(n=6)，用濾紙吸干，稱濕重，置70 ℃烘箱48 h至恒重后稱干重，計(jì)算肺濕/干重比，并以此評(píng)估肺組織的水腫程度。

2.3.5肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取右后肺(n=6)制成組織勻漿、離心后取上清加反應(yīng)液在酶標(biāo)儀460 nm波長(zhǎng)下，測(cè)各管OD值。計(jì)算公式：MPO單位/克濕片=(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/(11.3×取樣量g)。

2.3.6ROCK2 mRNA表達(dá)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法。用Trizol試劑盒提取肺組織的總RNA，按試劑盒步驟進(jìn)行第一條鏈合成和RT-PCR。ROCK2引物為：上游5'CCAGTATAGGCAGTGGACCAG3'，下游5'GGTCGGACATGAAATAGCTTGT3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為232bp；GAPDH引物為：上游5'AAGTTCAACGGCACAGTCAAG 3'，下游5'CCAGTAGACTCCACGACATACTCA 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為137bp。取PCR產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀下進(jìn)行灰度掃描并觀察拍照，分析光密度積分值，結(jié)果以ROCK2條帶密度與內(nèi)參照GAPDH條帶密度的比值作為mRNA的相對(duì)含量。

3　結(jié)果

3.1動(dòng)物一般表現(xiàn)除對(duì)照組外，內(nèi)毒素“二次打擊”后其余各組表現(xiàn)出不同程度的豎毛、反應(yīng)性下降、進(jìn)行性呼吸困難、氣促和發(fā)紺等表現(xiàn)，表明已成功造成內(nèi)毒素血癥急性肺損傷模型。

3.2川芎嗪對(duì)內(nèi)毒素血癥急性肺損傷的保護(hù)作用呼吸頻率相對(duì)值的變化(實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诤粑l率/實(shí)驗(yàn)前靜息呼吸頻率)作為肺功能損傷的整體表現(xiàn)(圖2A)，在單純內(nèi)毒素“二次打擊”組明顯上升(與對(duì)照組比較，P<0.01)，在應(yīng)用川芎嗪的2組顯著下降(與模型組比較，P<0.01)。

圖2　(A)TMP對(duì)呼吸頻率的影響；(B)TMP對(duì)肺損傷積分的影響

注：G1(生理鹽水對(duì)照組)，G2(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，G3(低劑量TMP組)和G4(高劑量TMP組)。與G1比較，#P<0.01；與G2比較，*P<0.01

此外，通過(guò)組織學(xué)評(píng)估內(nèi)毒素血癥急性肺損傷程度。內(nèi)毒素引起明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間質(zhì)增厚(間質(zhì)水腫)和肺泡損傷，而川芎嗪能夠大幅度改善這些損傷性變化(圖3)。同時(shí)，對(duì)肺損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分結(jié)果顯示，川芎嗪能夠顯著降低肺損傷評(píng)分(圖2B)(與對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，P<0.01)。

圖3　TMP對(duì)組織學(xué)變化的影響(400×)

注：A(生理鹽水對(duì)照組)，B(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，C(低劑量TMP組)和D(高劑量TMP組)

進(jìn)而，通過(guò)肺濕/干重比和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細(xì)胞百分率評(píng)估肺水腫程度。此兩項(xiàng)指標(biāo)在模型組顯著上升(圖4)(與對(duì)照組比較，P<0.01)；而在應(yīng)用川芎嗪的2組顯著下降(與模型組比較，P<0.01)。

圖4　(A)TMP對(duì)肺濕/干重比的影響；(B)TMP對(duì)BALF中PMN百分率的影響

注：G1(生理鹽水對(duì)照組)，G2(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，G3(低劑量TMP組)和G4(高劑量TMP組)。與G1比較，#P<0.01；與G2比較，*P<0.01

3.3川芎嗪降低急性肺損傷MPO活性MPO活性檢測(cè)可反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，與正常組比較，內(nèi)毒素“二次打擊”后MPO活性顯著升高(圖5A)(P<0.01)，川芎嗪能夠顯著降低MPO活性(P<0.05，G3 vs.G2；P<0.01，G4 vs.G2)。

圖5　(A)TMP對(duì)MPO活性的影響；(B)TMP對(duì)ROCK2 mRNA表達(dá)量的影響

注：G1(生理鹽水對(duì)照組)，G2(內(nèi)毒素“二次打擊”組)，G3(低劑量TMP組)和G4(高劑量TMP組)。與G1比較，#P<0.01；與G2比較，*P<0.01，**P<0.05

3.4川芎嗪下調(diào)ROCK2 mRNA表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示(圖5B)，內(nèi)毒素“二次打擊”組大鼠肺組織ROCK2 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著升高(P<0.01)；而在應(yīng)用川芎嗪的2組其表達(dá)水平顯著下降(與模型組比較，P<0.01)。

4　討論

內(nèi)毒素血癥時(shí)肺血管內(nèi)皮屏障通透性的升高，是中性粒細(xì)胞外滲至血管外組織、觸發(fā)肺損傷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；诮j(luò)病學(xué)理論，參照最新《膿毒癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南》，該《指南》指出：膿毒癥的基本病機(jī)是正虛毒損、瘀滯絡(luò)脈、氣機(jī)逆亂，臟腑功能失調(diào)(圖6)。因此，“瘀滯絡(luò)脈”是內(nèi)毒素血癥乃至膿毒癥的重要病位特征[15-16]。既往及前期研究都提示，絡(luò)脈受損、內(nèi)皮通透性升高，可歸因于Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)，但具體機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素血癥急性肺損傷組在功能學(xué)、形態(tài)學(xué)改變以及肺泡中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的同時(shí)，MPO活性、ROCK2 mRNA表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，提示Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了“瘀滯絡(luò)脈”骨架重構(gòu)的病理過(guò)程。

依據(jù)脈絡(luò)學(xué)說(shuō)“營(yíng)衛(wèi)承制調(diào)平”的核心理論[8]、針對(duì)其病機(jī)，確立膿毒癥的主要治則[15]：扶正排毒通絡(luò)、分層扭轉(zhuǎn)，而通絡(luò)以制其“絡(luò)道亢變”、顧護(hù)和修復(fù)人體的排毒管道、調(diào)其氣機(jī)逆亂、改善各臟腑的溫煦濡養(yǎng)，應(yīng)貫穿膿毒癥治療的全程。

圖6　內(nèi)毒素血癥的“瘀滯絡(luò)脈”病機(jī)假說(shuō)

近期研究提示，中藥單體川芎嗪可能通過(guò)減輕機(jī)體過(guò)度炎性反應(yīng)、改善器官組織微循環(huán)等作用，阻止膿毒癥的加劇[2-3,17]，并且不良反應(yīng)較少。川芎(Ligusticum Chuanxiong Hort.)是歷史悠久的傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效。川芎嗪是其有效成分之一，屬酰胺類生物堿，為四甲基吡嗪。本研究顯示，川芎嗪對(duì)內(nèi)毒素血癥急性肺損傷的具有保護(hù)作用；同時(shí)，川芎嗪2組MPO活性、ROCK2 mRNA表達(dá)水平均顯著低于內(nèi)毒素血癥急性肺損傷組，提示川芎嗪保護(hù)內(nèi)毒素血癥急性肺損傷的分子機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而改善“瘀滯絡(luò)脈”骨架重構(gòu)有關(guān)。以上基本進(jìn)展有助于深入探討內(nèi)毒素血癥骨架重構(gòu)及其防治機(jī)制，并將進(jìn)一步豐富和完善內(nèi)毒素血癥“瘀滯絡(luò)脈”理論。

[1]Funk D,Kethireddy S,Kumar A.Improving Outcomes in Sepsis and Septic Shock：Getting it Right the First Time[A].J.Rello,J.Lipman，T.Lisboa.Sepsis Management[M].Springer Berlin Heidelberg,2012:219-235.

[2]楊澄,張敏州,郭力恒,等.川芎嗪對(duì)膿毒癥大鼠心功能保護(hù)作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(9):2302-2303.

[3]劉海華.川芎嗪對(duì)膿毒癥致急性腎損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué),2010.

[4]范驍欽.川芎嗪對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用,老年危重病患者營(yíng)養(yǎng)支持的臨床研究[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué),2008.

[5]Ragaller M,Richter T.Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J].Journal of Emergencies,Trauma and Shock,2010,3(1):43-51.

[6]Li Y，Wu Y,Wang Z，et al.Fasudil attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice through the Rho/Rho kinase pathway[J].Medical science monitor：international medical journal of experimental and clinical research,2010,16(4):BR112-118.

[7]Suzuki K,Nemoto K,Ninomiya N,et al.Fasudil,a Rho-kinase inhibitor，attenuates lipopolysaccharide-induced vascular hyperpermeability and colonic muscle relaxation in guinea pigs[J].The Journal of Surgical Research,2012,178(1):352-357.

[8]吳以嶺.通絡(luò)干預(yù)血管病變的整合調(diào)節(jié)機(jī)制——承制調(diào)平[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007,22(10):661-665.

[9]楊國(guó)棟.脈絡(luò)學(xué)說(shuō)理論與臨床實(shí)踐應(yīng)用研究[J].Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2014(12):1-5.

[10]Kwok W,Clemens M G.Rho-kinase activation contributes to Lps-induced impairment of endothelial nitric oxide synthase activation by endothelin-1 in cultured hepatic sinusoidal endothelial cells[J].Shock(Augusta，Ga.),2014,42(6):554-561.

[11]Reho J,Fisher S.Myosin phosphatase isoforms in the microvasculature during endotoxemia(678.2)[J].The FASEB Journal,2014，28(1Sup):678.2.

[12]羅運(yùn)春,項(xiàng)薔薇,王強(qiáng),等.川芎嗪對(duì)哮喘小鼠肺組織Rho和Rho激酶的表達(dá)及小鼠氣道炎癥的影響[J].中華兒科雜志,2008,46(11):868-869.

[13]Zou Y,Dong C,Yuan M,et al.Instilled air promotes lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J].Experimental and therapeutic medicine,2014,7(4):816-820.

[14]Wu Q,Gui P,Yao S,et al.Expression of integrin alpha v beta 6 in rats with ventilator-induced lung injury and the attenuating effect of synthesized peptide S247[J].Medical Science Monitor:International Medical Journal of Experimental and Clinical Research,2008,14(2):BR41-48.

[15]劉清泉,張偉,姜良鐸.瘀毒傷絡(luò)、阻絡(luò)病機(jī)與膿毒癥[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2010,8(17):199-200.

[16]吳以嶺.絡(luò)病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究(第二輯)[M].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,2006.

[17]王慧琦,陳遠(yuǎn)卓,李叢燁,等.川芎嗪對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,35(5):20-25.

(2015-07-23收稿責(zé)任編輯：張文婷)

A Modified Lipolysaccharide “Two-hit” Induced Acute Lung Injury Model in Rats via Rho/ROCK Mechanism and Protective Effects of Tetramethylpyrazine on Injury Based on Collateral Disease Theory

Li Yan1, Liang Junqing2, Zhang Gaofeng1, Li Jia1, Yang Xilan1, Chen Qianfen1, Zhao Shidi1

(1 Department of Pathophysiology, Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui Province 233030, China; 2 Hebei Yiling Medicalresearchinstituteco.,LTD,Shijiazhuang,HeibeiProvince050035,China)

Objective:To investigate the protective effect of tetramethylpyrazine (TMP) on acute lung injury (ALI) in endotoxemia rats with “Collaterals Damaged by Toxic Stasis” (YuZhiLuoMai) and its mechanism of Rho/ROCK. Methods:Endotoxemia rats model in ALI with YuZhiLuoMai were established through lipolysaccharide “two-hit”. Rats were randomized into 4 groups: G1 (normal control group), G2 (“two-hit” group), G3 (low dosage TMP group) and G4 (high dosage TMP group). Measure the respiratory rate, lung wet/dry weight ratio, BALF PMN percentage, pulmonary MPO activity, ROCK2 mRNA expression quantity, observe and evaluate the severity of lung tissue injury. Results:Compared with the G2 rats, TMP significantly reduced respiratory rate, PMN percentage and lung wet/dry weight ratio, MPO activity and ROCK mRNA expression quantity, and reduced the pathological changes in endotoxemia rats with ALI.Conclusion:We found TMP might have better protection against ALI in endotoxemia rats with YuZhiLuoMai through inhibiting RhoA/ROCK pathway.

Collateral Disease Theory; Endotoxemia; Acute lung injury (ALI); Tetramethylpyrazine (TMP); Rho/ROCK

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81202833)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：1308085MH140)

李言(1977—)，男，安徽，博士，副教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)疾病，E-mail：408829061@qq.com

趙士弟(1976—)，男，安徽，副教授，研究方向：心腦血管病理生理學(xué)，E-mail：zhsdi@126.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.033