三螺旋多糖的鏈結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

劉青業(yè)， 許小娟（.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原03005；.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢43007）

特約綜述

三螺旋多糖的鏈結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

劉青業(yè)1， 許小娟2
（1.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原030051；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢430072）

三螺旋多糖是自然界中存在的具有特殊鏈結(jié)構(gòu)的一類生物大分子，它不僅具有較高的生物活性，而且具有特殊的分子識別能力以及其他多糖無法比擬的功能特性。本文主要概述三螺旋多糖的鏈結(jié)構(gòu)及其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，分析其變性和復(fù)性過程中分子鏈間的相互作用，闡明三螺旋結(jié)構(gòu)形成和形態(tài)變化的科學(xué)規(guī)律。同時，綜述了三螺旋多糖的鏈構(gòu)象與其生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系，以及基于螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變構(gòu)建的多糖基功能材料的最新研究進(jìn)展。

三螺旋多糖；鏈結(jié)構(gòu)；功能

多糖不僅是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支撐和能源存儲物質(zhì)，還是參與生命有機(jī)體新陳代謝的基本物質(zhì)之一，它參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的識別和調(diào)控、細(xì)胞生物信息的攜帶和傳遞、免疫應(yīng)答以及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移等各種生命活動［1］，已成為生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)外又一重要的生物大分子。近年來，隨著生物高分子研究技術(shù)的發(fā)展及其在多糖領(lǐng)域的應(yīng)用，多糖及糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)象以及功能的研究有了空前的發(fā)展。與核酸和蛋白質(zhì)相比，多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，如糖苷鍵的多種鍵接方式、支化結(jié)構(gòu)、支化度、分子內(nèi)和分子間多重相互作用，導(dǎo)致多糖分子鏈在溶液中能以不同的鏈形態(tài)存在，如無規(guī)線團(tuán)鏈、單螺旋、雙螺旋、三螺旋、蠕蟲狀、棒狀和聚集體等［2-4］。其中，三螺旋多糖尤為引人注目。三螺旋結(jié)構(gòu)不僅賦予多糖更高的生物活性［5-7］，而且基于三螺旋結(jié)構(gòu)的變性-復(fù)性特征可構(gòu)建獨特的功能材料，如一維納米復(fù)合材料［8-10］、基因載體［11］、化學(xué)傳感器以及偏光材料［12］。由此，多糖的結(jié)構(gòu)與功能研究將成為未來生命科學(xué)以及納米材料科學(xué)的重要研究課題之一。

1　三螺旋多糖的鏈結(jié)構(gòu)及其溶液行為

在自然界中，三螺旋多糖來源廣泛，種類較多。迄今已報道的三螺旋多糖主要有裂褶菌多糖（schizophyllan，SPG）［14-15］、硬葡聚糖（scleroglucan）［16］、香菇多糖（lentinan，LNT）［17-19］、木聚糖（β-（1→3）-D-xylan）［20-21］、凝膠多糖（curdlan）［22］、霉菌多糖（cinerean）［23］、海帶多糖（laminarin）［24-25］和長裙竹蓀多糖［26］等。其中，三螺旋多糖的主鏈大多為β-（1→3）-D-葡聚糖，如圖1所示［13］。結(jié)構(gòu)最簡單的三螺旋多糖，即凝膠多糖和木聚糖，是一種由β-（1→3）-D鍵接的直鏈聚糖；而裂褶菌多糖、硬葡聚糖、霉菌多糖、海帶多糖和香菇多糖是一類主鏈為β-（1→3）-D，含有β-（1→6）側(cè)鏈的葡聚糖。糖殘基側(cè)鏈?zhǔn)欠翊嬖诩捌浯嬖陬l率會顯著影響多糖的物理性質(zhì)，例如：凝膠多糖無側(cè)鏈存在，即使分子量很小在水中也幾乎不溶，而側(cè)鏈的存在導(dǎo)致三螺旋多糖能溶于水，溶解度的大小取決于側(cè)鏈的多少和長短。

圖1　不同來源三螺旋多糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)示意圖［13］Fig.1 Repeating units of triple helical polysaccharides from various species［13］

自然界中已發(fā)現(xiàn)的三螺旋多糖有一個共同的特點，具有極其相似的X-射線衍射圖譜，即基本上都以右手三螺旋構(gòu)象存在，主要依靠分子內(nèi)和分子間氫鍵來維持和穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)。Sakurai以及Kony等［10，27］通過分子模擬分別得到凝膠多糖和裂褶菌多糖可能存在的三螺旋構(gòu)象模型圖，以及它們在x、y軸平面的投影（圖2）。主鏈葡萄糖環(huán)上C-4和C-6上的-OH通過分子內(nèi)氫鍵作用形成螺旋結(jié)構(gòu)；3條多糖分子主鏈則通過分子間的氫鍵，即每股鏈的糖環(huán)上C-2位-OH圍繞螺旋結(jié)構(gòu)的中心形成一個封閉的三角氫鍵網(wǎng)絡(luò)，每一個三角氫鍵網(wǎng)絡(luò)都被固定于同一個x-y平面上，并沿著螺旋中心軸線垂直排列，使三股鏈緊緊地結(jié)合在一起，形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。這種氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是目前公認(rèn)的比較合理的構(gòu)象模型。糖環(huán)上C-2位的-OH被認(rèn)為具有較強(qiáng)的疏水性，而C-6上的-OH則表現(xiàn)為親水性［21］，由于C-2位-OH形成的氫鍵位于三螺旋結(jié)構(gòu)中心，導(dǎo)致其中心空腔相當(dāng)疏水［10］。而且，多糖側(cè)鏈越多，三螺旋結(jié)構(gòu)的螺距越小，三螺旋鏈形成的疏水空腔則越大。例如，裂褶菌多糖的三螺旋空腔直徑大小為0.35 nm，而無側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的凝膠多糖則不存在螺旋空腔［28］。此外，Okobira等［28］通過分子模擬研究觀察到，水分子易與多糖側(cè)鏈以及主鏈形成兩種氫鍵作用，導(dǎo)致多糖在水溶液中存在旋光色散的熱波動現(xiàn)象。

多糖帶有大量羥基，非常容易形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)［29］。因此，三螺旋結(jié)構(gòu)之間存在強(qiáng)烈的聚集趨勢。如圖3 （a）所示，低分子量的三螺旋香菇多糖（Mw=4.6×105）由于強(qiáng)烈的氫鍵作用在水中以三螺旋鏈和三螺旋鏈的聚集體共存，原子力顯微鏡（圖3（b））顯示三螺旋棒狀短鏈平行排列形成 “柴捆”狀聚集體（圖3（c））［30］。研究表明，較低分子量的裂褶菌多糖（Mw=4.0×105）因其氫鍵作用聚集導(dǎo)致多糖溶液具有一定的液晶行為［31］；而較高分子量三螺旋多糖鏈相互纏結(jié)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致凝膠化。張俐娜等［32-34］通過SECMALLS-Visco三聯(lián)用技術(shù)研究了較高分子量的香菇多糖（Mw=1.03×106）在0.15 mol/L NaCl溶液中的溶液性質(zhì)，研究表明香菇多糖即使在稀溶液中也以三螺旋鏈及其聚集體形式共存，這種聚集體由可逆的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠構(gòu)成。因此，隨著濃度增加，香菇多糖溶液很容易形成凝膠。

圖2　凝膠多糖（a）和裂褶菌多糖（b）中可能存在的氫鍵模型［10，27］Fig.2 Proposed types of hydrogen bonds in triple helical curdlan（a）and schizophyllan（b）［10，27］

圖3　香菇多糖在水溶液中25℃時的自相關(guān)函數(shù)曲線（散射角θ=90°）（a）；香菇多糖在水溶液中25℃條件下的原子力三維圖譜（b）；香菇多糖在水溶液中的結(jié)構(gòu)形態(tài)示意圖［30］（c）Fig.3 Typical autocorrelation function of Lentinan in water as measured by DLS at at 25℃（scattering angleθ=90°）（a）；The 3D image of MAC mode AFM topographic images of Lentinan aqueous solution at 25℃（b）；Schematic of triple helical Lentinan in water solution（c）［30］

2　三螺旋多糖的鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變

2.1三螺旋低溫區(qū)構(gòu)象轉(zhuǎn)變

分子內(nèi)和分子間的氫鍵是維系多糖三螺旋結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動力。對于含有側(cè)鏈的三螺旋多糖，在水溶液中側(cè)鏈與主鏈以及側(cè)鏈與水分子形成的氫鍵是穩(wěn)定其三螺旋構(gòu)象的因素［28］，這也是具有側(cè)鏈的三螺旋多糖易溶于水的主要原因。大量實驗證明，裂褶菌多糖、硬葡聚糖以及香菇多糖等三螺旋多糖側(cè)基上的羥基與周圍環(huán)境中的水分子在低于室溫下形成氫鍵，使側(cè)鏈基團(tuán)以三螺旋主鏈為核心規(guī)整排列，使側(cè)鏈保持高度有序的結(jié)構(gòu)，與主鏈形成更剛性的三螺旋結(jié)構(gòu)，即三螺旋Ⅰ；而在室溫以上這種氫鍵作用被破壞，側(cè)鏈相對自由，此時的三螺旋稱之為三螺旋Ⅱ［35-41］。Kitamura等［38］利用超靈敏微量熱法和旋光測量證明裂褶菌多糖在水溶液中的低溫構(gòu)象轉(zhuǎn)變（低溫區(qū)氫鍵破壞）溫度為7.4℃，而當(dāng)溶液中c（KOH）=0.01 mol/L時，該轉(zhuǎn)變溫度升高至37.2℃；隨著溶液中堿濃度的增加，多糖鏈低溫構(gòu)象區(qū)轉(zhuǎn)變的協(xié)同單元尺寸逐漸減小，多糖鏈的剛性逐漸降低。Yoshiba等［42］用介電色散證明三螺旋裂褶菌多糖分子鏈周圍的水分子以3種形式存在，按照兩者相互作用的強(qiáng)弱將其分為結(jié)合水（最強(qiáng)）、結(jié)構(gòu)水（較強(qiáng)）以及自由水（弱），并將多糖低溫區(qū)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變歸結(jié)于結(jié)構(gòu)水和自由水之間的轉(zhuǎn)換。

張俐娜［41］等利用差示掃描微量熱法（US-DSC）對三螺旋香菇多糖在DMSO-水的二元溶劑體系中低溫區(qū)構(gòu)象轉(zhuǎn)變進(jìn)行了系統(tǒng)研究，如圖4（a）所示。第1個吸熱峰為多糖分子鏈從三螺旋Ⅰ到三螺旋Ⅱ的轉(zhuǎn)變，此時三螺旋的結(jié)構(gòu)并未被破壞，只是三螺旋鏈的側(cè)鏈從相對有序轉(zhuǎn)變到無序；當(dāng)ωDMSO＜80%時，多糖在DMSO-水混合溶液中的轉(zhuǎn)變溫度隨ωDMSO增加而升高；當(dāng)ωDMSO＞80%時，轉(zhuǎn)變溫度隨ωDMSO增加而降低，該轉(zhuǎn)變對應(yīng)于多糖在低溫區(qū)三螺旋Ⅰ到Ⅱ的可逆構(gòu)象變化，如圖4（b）所示。這主要是因為水通常以團(tuán)簇狀存在，容易與其他含-OH的分子結(jié)合形成氫鍵締合復(fù)合物，而且在低溫時較為穩(wěn)定；當(dāng)溫度升高，這種氫鍵作用被破壞，結(jié)構(gòu)水轉(zhuǎn)變成了自由水，構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致三螺旋主鏈和側(cè)鏈活動性增加［43］。

圖4　香菇葡多糖在DMSO-水混合溶劑中的熱容變化（a）；三螺旋構(gòu)象Ⅰ到Ⅱ的低溫區(qū)轉(zhuǎn)變示意圖（b）［41］Fig.4 Temperature dependence of the specific heat capacity（Cp）for lentinan in DMSO-H2O mixtures（a）；Schematic diagram of a model declaring the conformation transition from triple-helicalⅠtoⅡ（b）［41］

2.2三螺旋鏈-單鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變

三螺旋多糖依靠氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定存在于水溶液中。然而，它們在一定條件（強(qiáng)堿條件、強(qiáng)極性溶劑及高溫）下，分子內(nèi)和分子間氫鍵被破壞，三螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋轉(zhuǎn)變成無規(guī)線團(tuán)，該過程稱為三螺旋結(jié)構(gòu)的變性。例如，裂褶菌多糖在水溶液中以三螺旋構(gòu)象存在，而當(dāng)ωDMSO約為80%時，三螺旋構(gòu)象發(fā)生突變；ωDMSO≥87%時，多糖鏈則完全以無規(guī)線團(tuán)構(gòu)象存在，并且構(gòu)象區(qū)的轉(zhuǎn)變是一種非熱力學(xué)平衡的不可逆轉(zhuǎn)變［44］。香菇多糖在ωDMSO為80%～85%時也發(fā)生三螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變，即三螺旋多糖的變性，在此相對窄的區(qū)間內(nèi)，多糖的三螺旋構(gòu)象與無規(guī)線團(tuán)共存［45］。張俐娜等［46］還觀察到，當(dāng)香菇多糖的DMSO體系中加入LiCl后，多糖在LiCl-DMSO溶劑中具有更高的黏度和較大的黏度指數(shù)；這主要是由于Li+具有較高的電荷密度，很容易與DMSO中亞硫氧基上的氧緊密締合形成［Li-DMSO］+陽離子，Cl-則與多糖分子鏈上的羥基形成氫鍵，多糖分子鏈上的Cl-以及與大陽離子［Li-DMSO］+締合的Cl-之間的電荷排斥作用，阻礙了多糖分子鏈上的葡糖基自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致主鏈剛性增加。

強(qiáng)堿溶液也可以破壞三螺旋結(jié)構(gòu)，然而對其構(gòu)象轉(zhuǎn)變的報道卻大相徑庭。Matsumoto等［47-48］研究表明，凝膠多糖在室溫下，0.05 mol/L NaOH溶液中以三螺旋構(gòu)象存在；當(dāng)c（NaOH）=0.1 mol/L時，則以雙螺旋構(gòu)象存在；當(dāng)溫度升高到60℃時，則全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)線團(tuán)鏈。Zhang等［49］則認(rèn)為凝膠多糖存在一個構(gòu)象轉(zhuǎn)變區(qū)（c（NaOH）為0.19～0.24 mol/L），在該區(qū)域螺旋鏈被逐股剝離，即三螺旋的一股鏈從三螺旋慢慢脫落，進(jìn)而形成雙螺旋，最后雙螺旋解旋形成單股無規(guī)線團(tuán)鏈；當(dāng)c（NaOH）＜0.19 mol/L時為三螺旋構(gòu)象，而c（NaOH）＞0.24 mol/L時以無規(guī)線團(tuán)存在。對于裂褶菌多糖，當(dāng)c（NaOH）＞0.15 mol/L時，三螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湡o規(guī)線團(tuán)，且多糖溶液的黏度會隨時間增加而降低［38］。Norisuye等［15］認(rèn)為黏度隨時間的降低反映了多糖的降解，在這個區(qū)間多糖的變性和降解同時發(fā)生。然而，Gawronski等［23，50］認(rèn)為在轉(zhuǎn)變區(qū)黏度的變化反映了多糖變性的動力學(xué)過程，即螺旋破壞程度的大小，不存在降解現(xiàn)象。甚至，有人認(rèn)為裂褶菌多糖用NaOH處理后，三螺旋構(gòu)象不是轉(zhuǎn)變?yōu)閱螣o規(guī)線團(tuán)鏈，而是轉(zhuǎn)變?yōu)閱温菪?1-53］。類似地，香菇多糖在c（NaOH）為0.05～0.08 mol/L溶液中時，其分子量、均方根旋轉(zhuǎn)半徑以及特性黏度值等參數(shù)降低，且不可逆［19］。為了闡明多糖在堿性條件下分子鏈構(gòu)象參數(shù)轉(zhuǎn)變是由多糖主鏈斷裂降解還是高級結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致，張俐娜等［19］通過考察比旋光的變化，證明香菇多糖在NaOH溶液中分子鏈構(gòu)象參數(shù)的改變是由多糖鏈有序向無序的轉(zhuǎn)變造成的，即三螺旋構(gòu)象向單股無規(guī)線團(tuán)的轉(zhuǎn)變；同時，依據(jù)蠕蟲狀鏈模型理論進(jìn)一步闡明，當(dāng)香菇多糖的分子量超過2.33×105時，排除體積效應(yīng)較為明顯，OH-和多糖分子鏈的相互作用導(dǎo)致其主鏈更加伸展，剛性增加。

加熱也是螺旋結(jié)構(gòu)變性的有效途徑。由于較強(qiáng)的氫鍵作用，三螺旋多糖的變性需要更高的溫度，其在水溶液中完全解螺旋變性所需要的溫度為135～140℃［41，54］。少量DMSO或者NaOH的加入不會明顯改變?nèi)菪慕饴菪郎囟龋?dāng)溶劑中ωDMSO＜70%時，三螺旋的高溫構(gòu)象轉(zhuǎn)變溫度一直維持在130℃左右。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與DMSO、水及多糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵競爭作用有關(guān)［44-55］。當(dāng)溶劑中ωDMSO＞70%時，多糖分子更傾向于與DMSO形成新的氫鍵，從而破壞多糖側(cè)鏈與水分子以及多糖與多糖間的相互作用。圖5示出三螺旋香菇多糖在DMSO-H2O混合溶劑中的相圖［41］，詮釋了溫度以及溶劑對三螺旋多糖構(gòu)象的影響。與裂褶菌多糖［44，56］相似，香菇多糖在DMSO-水混合溶液中，于0～40℃（ωDMSO=0～85%）時以三螺旋Ⅰ構(gòu)象存在，對應(yīng)于A區(qū)，在該區(qū)間，側(cè)鏈糖基上的羥基與溶液中水分子之間的氫鍵作用維持其側(cè)鏈和主鏈高度有序，即三螺旋Ⅰ構(gòu)象；由于形成締合水網(wǎng)絡(luò)的氫鍵較弱，因此溫度升高則容易被破壞，導(dǎo)致香菇多糖從A區(qū)進(jìn)入B區(qū)，即三螺旋Ⅱ構(gòu)象；只有當(dāng)溫度很高（140℃以上）或DMSO含量很高（ωDMSO＞85%）時，香菇多糖才會從三螺旋解聚為單股柔順鏈，即香菇多糖由B區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)镃區(qū)。

圖5　香菇多糖在DMSO-水混合溶液中的相圖變化［41］Fig.5 The phase diagram for Lentinan in DMSO-water mixtures［41］

2.3三螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)性

多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)變性成單鏈后是否能再組裝形成三螺旋結(jié)構(gòu)？本文把三螺旋再形成的過程稱為三螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)性。有人認(rèn)為三螺旋多糖高溫構(gòu)象的變性行為是一個不可逆過程，因為解螺旋后的單鏈，完全匹配的三股鏈依靠氫鍵重新構(gòu)建新的三螺旋的幾率幾乎為零［44］。也有人提出類似于DNA雙螺旋的復(fù)性，變性的三螺旋多糖可以發(fā)生復(fù)性，但復(fù)性過程和產(chǎn)物更為復(fù)雜。實驗證明，多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)破壞后在一定條件下可復(fù)性成為三螺旋。例如，將三螺旋硬葡聚糖在160℃加熱15 min變性成為單鏈后，在低于構(gòu)象轉(zhuǎn)變溫度的某一高溫下退火，然后冰浴淬火至室溫可以復(fù)性；退火溫度越高，直鏈三螺旋成分越多；而且當(dāng)退火時間大于18 h，復(fù)性多糖會出現(xiàn)大的“團(tuán)簇”聚集體［57］。由此可見，退火溫度和時間嚴(yán)重影響多糖的復(fù)性。退火溫度與變性溫度之差越小，直至退火溫度逐漸減小到室溫，多糖越易復(fù)性為直鏈三螺旋構(gòu)象。多糖分子量的均一性也是影響復(fù)性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的重要因素。一般分子量分布越窄，復(fù)性后多糖的直鏈三螺旋結(jié)構(gòu)越多；多糖的分子量越低，直鏈三螺旋也會相應(yīng)增加，分子量太高反而會引起分子鏈之間的“團(tuán)簇”聚集。

多糖的濃度也是復(fù)性多糖結(jié)構(gòu)多樣性的影響因素之一。三螺旋香菇多糖質(zhì)量濃度太高，在DMSO-H2O混合溶液中（ωDMSO=5%）的復(fù)性產(chǎn)物容易出現(xiàn)大的“團(tuán)簇”聚集體；質(zhì)量濃度太低，多糖單鏈各自孤立存在，難以相互作用復(fù)性成為三螺旋。因此1×10-3～2×10-3g/m L被認(rèn)為是變性香菇多糖復(fù)性的最佳質(zhì)量濃度［58］。此外，混合溶液中DMSO的含量也會影響多糖的復(fù)性行為，當(dāng)ωH2O＜15%時，多糖分子鏈仍然以無規(guī)線團(tuán)存在；當(dāng)ωH2O≥25%時，單股分子鏈由于分子內(nèi)氫鍵的增強(qiáng)導(dǎo)致鏈的收縮和塌陷，進(jìn)而形成球形結(jié)構(gòu)和聚集體；只有當(dāng)ωH2O＞50%時，多糖鏈才可能重組形成三螺旋構(gòu)象；復(fù)性后多糖的黏度、楊氏模量以及旋光度比復(fù)性前螺旋多糖都有減小，進(jìn)一步證明復(fù)性過程的不可逆性以及復(fù)性多糖構(gòu)象的多樣性［59］。

圖6　硬葡聚糖經(jīng)變性-復(fù)性后的原子力顯微鏡圖（a）；變性硬葡聚糖復(fù)性后可能存在的結(jié)構(gòu)示意圖（b）［65］Fig.6 Tapping-mode AFM height topographs of renatured scleroglucan samples（a）；Schematic illustration of possible structural imperfections in renatured triplex structure（b）［65］

三螺旋多糖復(fù)性產(chǎn)物的形態(tài)復(fù)雜多樣，主要以直鏈和環(huán)狀的三螺旋結(jié)構(gòu)存在，同時還出現(xiàn)Y形支鏈狀、發(fā)簪狀三螺旋和團(tuán)簇多種結(jié)構(gòu)［57］。環(huán)狀三螺旋多糖的出現(xiàn)（圖6（a）），如同DNA復(fù)性過程中環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，引起了研究者的極大興趣。Stokke等［60-63］通過原子力顯微鏡對變性裂褶菌多糖和硬葡聚糖復(fù)性后的鏈形態(tài)進(jìn)行觀察，復(fù)性后的多糖存在著大量的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且環(huán)狀結(jié)構(gòu)會隨著退火溫度的增加而逐漸減少。他們還首次利用動態(tài)光散射和SEC-MALLS證明復(fù)性多糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)也是一種三螺旋結(jié)構(gòu)體［63-64］。環(huán)狀三螺旋比直鏈三螺旋具有更自由的連接組合方式，可通過熵增的方式彌補(bǔ)剛性鏈彎曲造成的能量損失。因此，三螺旋的剛性直鏈結(jié)構(gòu)并不是其能量最穩(wěn)定的構(gòu)象。他們還認(rèn)為，在復(fù)性過程中硬葡聚糖的單鏈分子首先會形成一個“有缺陷的線性三螺旋鏈”結(jié)構(gòu)（圖6（b）），隨著復(fù)性時間的增加，這些區(qū)域的分子鏈會通過氫鍵自動排列逐漸形成完整的三螺旋結(jié)構(gòu)［65］?？梢?，三螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)性過程非常復(fù)雜，導(dǎo)致復(fù)性產(chǎn)物的構(gòu)象也呈多樣變化。

如何控制多糖的復(fù)性構(gòu)象，在復(fù)性過程中得到完整的三螺旋構(gòu)象，這對多糖的生物活性及其功能應(yīng)用具有重要意義。許小娟等［66］利用Nano-DSC對三螺旋多糖在ωDMSO=5%的混合溶液中的復(fù)性過程及鏈形態(tài)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，香菇多糖復(fù)性產(chǎn)物中除含三螺旋（圖7（a）中的T 1吸熱峰）和單鏈外，還存在不完整的雙螺旋片段（圖7（c）），即圖7（a）中的T 2吸熱峰，且該雙螺旋片段隨復(fù)性時間的推移逐漸形成完整三螺旋結(jié)構(gòu)；同時，研究證明通過調(diào)控混合溶劑極性的改變速率可獲得完整的三螺旋構(gòu)象（圖7（b），ML）。該實驗結(jié)果可以通過兩種假設(shè)來解釋水交換速率對多糖構(gòu)象的影響，即“先自組裝再伸展”和“先伸展再匹配組裝”（圖7（d））。當(dāng)把大量的水瞬間加入到多糖-DMSO溶液中時，處于無規(guī)線團(tuán)構(gòu)象的多糖鏈瞬時被加入的水分子通過氫鍵作用所固定，導(dǎo)致多糖鏈無法及時伸展，隨后分子鏈之間通過氫鍵重組，發(fā)生鏈與鏈之間錯誤匹配的幾率增大，導(dǎo)致形成具有缺陷的三螺旋結(jié)構(gòu)的可能性增大；當(dāng)以透析或者模擬透析（溶劑替換比透析更慢）的方式進(jìn)行復(fù)性時，水分子慢慢滲透到多糖分子鏈之間，有利于多糖分子鏈在水分子作用下慢慢伸展，然后發(fā)生鏈與鏈之間的匹配重組，形成具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖。

3　多糖的分子識別與生物活性

多糖大分子鏈在溶液中的空間三維結(jié)構(gòu)對生物功能的影響以及對生命科學(xué)的發(fā)展都具有十分重要的意義。由于其較高的免疫調(diào)節(jié)［67］、抗腫瘤［68-69］以及抗炎［70］等活性，已經(jīng)作為一種免疫反應(yīng)修飾劑和調(diào)節(jié)劑廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并成為新藥研究的前沿領(lǐng)域和研究熱點［71-72］。然而，究竟是三螺旋多糖的單鏈還是三螺旋構(gòu)象使其具有較高的生物活性仍然存在爭議。三螺旋多糖的單鏈需要在高溫、強(qiáng)堿或者極性溶劑DMSO中才能獲得，這些條件在生物體內(nèi)難以獲得。因此，研究三螺旋多糖在單鏈狀態(tài)下的生物功能非常困難。Kojima等［73］利用凝膠滲透色譜從裂褶菌多糖中分離出具有單鏈和三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖試樣，并將其水溶液分別注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，三螺旋多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗S-180腫瘤生物活性，而單鏈多糖的抗腫瘤效果幾乎消失；該結(jié)果充分表明三螺旋構(gòu)象對于多糖生物活性的重要性。Stokke等［74］通過對硬葡聚糖免疫活性的研究表明，完整的線性三螺旋結(jié)構(gòu)是保持多糖較高免疫活性的前提條件，用高濃度NaOH溶液將其變性，再用酸中和復(fù)性后，形成的富含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)性多糖卻顯示較低的刺激腫瘤壞死因子（TNF-α）分泌的能力。張俐娜等［68］的研究表明，三螺旋香菇多糖具有較高的抗S-180腫瘤的活性，抑制率達(dá)到50.5%；而變性后的單鏈多糖則顯示較低的抑制率（12.3%）。在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，巨噬細(xì)胞中NO的合成以及鱟因子G的活化刺激都顯著依賴于多糖的三螺旋構(gòu)象［75］。綜上所述，適當(dāng)?shù)姆肿恿亢腿菪湗?gòu)象均有利于三螺旋多糖抗癌活性的提高。

圖7　復(fù)性香菇多糖在DMSO-H2O（ωDMSO=5%）混合溶液中不同復(fù)性時間下的熱容曲線（a）；復(fù)性香菇多糖在不同復(fù)性模式下的熱容曲線，第2個吸熱峰（35～48℃）在圖中用箭頭進(jìn)行了標(biāo)記（b）；復(fù)性香菇多糖結(jié)構(gòu)體中可能存在的雙螺旋片段示意圖（c）［66］；香菇多糖鏈在混合溶劑中可能存在的2種復(fù)性機(jī)制（d）Fig.7 Temperature dependence of excess heat capacity for r-LNT at different storage time in DMSO-H2O（ωDMSO= 5%）solutions（a）；DSC thermograms for r-LNT against different renaturation mode，the second endothermic peak（35～48℃）in DSC curves was indicated by arrow（b）；Schematic illustration of possible duplex segment in the renatured triplex（c）［66］；Schematic illustration of possible renaturation mechanisms for denatured polysaccharide in binary solvents（d）

4　三螺旋β-葡聚糖構(gòu)象轉(zhuǎn)變誘導(dǎo)糖基功能化材料的構(gòu)建

4.1納米功能材料的構(gòu)建

多糖螺旋結(jié)構(gòu)的破壞與轉(zhuǎn)變對于其生物活性的高效表達(dá)是不利的，因此保持多糖螺旋結(jié)構(gòu)的完整性尤為重要。有趣的是，Shinkai等［8］卻充分利用裂褶菌多糖以及凝膠多糖的三螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變特性，構(gòu)建了一系列納米復(fù)合功能材料，極大地拓寬了螺旋多糖的應(yīng)用領(lǐng)域。具有大π鍵共軛體系的聚合物，比如聚苯胺、聚噻吩等，是一類新型的導(dǎo)電高分子，分子之間容易發(fā)生無規(guī)聚集，嚴(yán)重影響其卓越的物理性能。Shinkai等利用變性三螺旋裂褶菌多糖可復(fù)性形成疏水空腔的特點，在一維尺度上構(gòu)建了有序結(jié)構(gòu)的聚苯胺納米纖維［76］以及手性聚噻吩納米線［77］（圖8（a））。同時，由于構(gòu)建的超分子體系是多糖鏈通過非共價鍵作用包裹客體分子而形成的，對裸露在表面的多糖進(jìn)行功能化修飾，還可以賦予超分子體系更加豐富的功能。比如，將多糖進(jìn)行甘露糖化修飾，可用于伴刀豆球蛋白A的分子識別［76］。如圖8（b）所示，熒光標(biāo)記的伴刀豆球蛋白A被超分子納米纖維表面甘露糖基化的多糖分子識別，并緊密地結(jié)合在一起。

圖8　手型聚噻吩納米線在裂褶菌多糖三螺旋空腔中的構(gòu)建示意圖（a）［77］；超分子聚苯胺-多糖復(fù)合材料的構(gòu)建示意圖，從左到右依次為甘露糖修飾的復(fù)合材料與FITC標(biāo)記的伴刀球蛋白A相互作用的共聚焦顯微圖、光學(xué)顯微圖和兩者的疊加圖（b）［76］；利用變性的三螺旋裂褶菌多糖構(gòu)建聚烷氧基硅烷納米線的示意圖（c）［78］；三螺旋裂褶菌多糖疏水空腔作為納米反應(yīng)容器的示意圖（d）［81-82］；利用變性三螺旋香菇多糖制備Au納米粒子和納米線的示意圖（e）［83］Fig.8 Schematic illustration of the chirally insulated PT-N+in the helical SPG cavity（a）［77］；Concept of the supramolocular functionalization of the entrapped PANIs（up），CLSM images of PANIs/mannose-modified SPG composite binded with FITC-Con A（down），form left to right：fluorescence image，optical microscope image and overlapped image（b）［76］；Schematic illustration of the composite formation of s-SPG with PMDS （c）［78］；Schematic illustration of our concept to utilize SPG as the reaction vessels（d）［81-82］；Scheme of synthesis and dispersion of Au NPs by s-LNT at different concentrations（e）［83］

三螺旋多糖不僅可以在水體系和強(qiáng)極性的有機(jī)溶劑中進(jìn)行納米材料的構(gòu)建，也可以與一些只能溶于非極性有機(jī)溶劑的高聚物相互作用，并將其包裹在空腔內(nèi)形成一維納米復(fù)合材料。如圖8（c）所示，將癸硅烷的環(huán)己烷溶液與變性的三螺旋多糖強(qiáng)堿溶液互混超聲分散后，用酸中和復(fù)性，癸硅烷分子鏈即被包裹在復(fù)性的三螺旋結(jié)構(gòu)空腔內(nèi)，形成新的納米復(fù)合材料［78］。此外，染料小分子也可與三螺旋多糖在復(fù)性過程中形成包合物。偶氮苯［79］和吡咯衍生物［80］小分子在三螺旋裂褶菌多糖的空腔里通過π-π堆疊或者偶極相互作用定向排列，形成具有不同光學(xué)特性的納米分子器件。甚至，二苯丁二炔衍生物［81］以及烷氧基硅烷［82］等一些聚合物單體也能以相同的方式進(jìn)入疏水空腔，在外界條件下引發(fā)聚合，形成一維尺度的聚合物納米纖維（圖8（d））。多糖本身具有相對較高的化學(xué)惰性，為聚合物單體提供了一個納米級的反應(yīng)環(huán)境。

三螺旋多糖不僅可以利用疏水空腔包覆多種客體分子，而且含大量羥基的多糖鏈還是一種良好的分散劑和還原劑。許小娟等［83］提出了一種利用三螺旋香菇多糖在水溶液中“一鍋法”合成和分散金納米粒子（Au NPs）的“綠色”方法。如圖8（e）所示，高溫（140℃）變性得到的三螺旋香菇多糖單鏈（s-LNT）在無還原劑的條件下，能將Au3+還原形成Au NPs；而且通過改變多糖的濃度、反應(yīng)溫度以及時間還可調(diào)控Au NPs的形狀和尺寸；Au3+在低s-LNT濃度下首先主要形成納米帶結(jié)構(gòu)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，金納米帶進(jìn)一步分散成球形納米粒子；而較高的多糖濃度則能夠迅速促進(jìn)球狀A(yù)u NPs的形成，且Au NPs被誘導(dǎo)緊密排列在復(fù)性的三螺旋疏水空腔內(nèi)，形成穩(wěn)定的納米線。Au NPs與多糖鏈上羥基基團(tuán)之間的相互作用和Au NPs被包裹進(jìn)復(fù)性多糖的疏水空腔為其在水溶液中的穩(wěn)定分散提供了保障。Bae等［84］利用羥胺化學(xué)還原和激光誘導(dǎo)熔融相結(jié)合技術(shù)，以變性裂褶菌多糖糖鏈為分子模板，也成功構(gòu)建了Au納米線一維納米材料。相比之下，前者提出的方法更為綠色、簡單?；谠撎匦?，將多糖鏈作為反應(yīng)位點，經(jīng)NaBH4還原形成的納米Se粒子［85］和Ag粒子［86］也可均勻地分散在多糖的水溶液中，形成穩(wěn)定的糖基復(fù)合物；制備得到的Se-香菇多糖復(fù)合物顯示出較高的抗腫瘤特性，而Ag-香菇多糖復(fù)合物則具有特殊的紫外吸收效應(yīng)。此外，香菇多糖三螺旋剛性鏈向柔順鏈的轉(zhuǎn)變可影響多糖鏈上鄰近Ag納米粒子的電磁場耦合效應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生新的紫外吸收峰。因此，可通過UV-Vis光譜的變化指示多糖三螺旋構(gòu)象的轉(zhuǎn)變［86］。

4.2膠束載體的構(gòu)建

三螺旋多糖作為一類重要的天然高分子，不僅具有優(yōu)良的抗腫瘤和抗炎癥等生物活性［69-70］，而且還具有被鼠和人的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及淋巴相關(guān)組織細(xì)胞特異性識別的特性［69，87］，因此，其具有作為載體材料的獨特優(yōu)勢。Numata［88］等利用三螺旋構(gòu)象變性-復(fù)性的特性，將三螺旋裂褶菌多糖（SPG）溶解在極性溶劑DMSO中變性，然后與聚苯乙烯（PS）-甲苯溶液在油水復(fù)合溶劑的O/W乳化界面，通過非共價鍵作用力自組裝構(gòu)建了一種兩親性膠束載體。如圖9所示，在界面處，變性SPG多糖鏈的復(fù)性行為使其纏繞在部分PS鏈上。該超分子自組裝體具有PS組成的疏水核和葡聚糖形成的親水殼。同時，將疏水分子卟啉（TMPP）加入PS溶液中，自組裝形成的膠束只有核發(fā)光，且放置長時間TMPP沒有沉淀，表明TMPP通過疏水作用進(jìn)入到疏水核中，并穩(wěn)定分散。此外，若對變性三螺旋多糖的分子鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，阻礙或干擾其復(fù)性行為，也可通過疏水作用構(gòu)建藥物載體膠束。

圖9　乳化作用構(gòu)建裂褶菌多糖膠束的示意圖以及糖鏈在膠束表面纏繞部分聚苯乙烯分子鏈構(gòu)建親水界面的示意圖［88］Fig.9 Concept proposed for the creation of microspheres on the emulsion template，and schematic representation of the partial wrapping of the hydrophobic polymer by SPG［88］

Maeda等［89］在裂褶菌多糖的側(cè)鏈引入疏水基團(tuán)奈，分子鏈通過疏水物理交聯(lián)作用可以形成微凝膠，并通過受體作用將鹽酸阿霉素特異性運送到免疫細(xì)胞內(nèi)。Nasrollahi等［90］在凝膠多糖分子鏈上引入阿霉素和曲妥單抗雙官能團(tuán)，構(gòu)建的藥物載體納米顆?？砂邢蜻\送鹽酸阿霉素，顯著改善Her2+乳腺癌治療的效果。

4.3雜交螺旋結(jié)構(gòu)功能材料的構(gòu)建

三螺旋多糖在復(fù)性過程中，不僅可通過分子鏈的自我識別以及重組形成三螺旋結(jié)構(gòu)，還可在一定條件下特異性識別其他高分子鏈雜化形成新的三螺旋復(fù)合物。Shinkai等［12］將變性的凝膠三螺旋多糖（Curorg）與具有共軛體系的噻吩聚合物（PT1）相互作用（圖10（a）），構(gòu)建了一種新型的復(fù)合物；復(fù)合物中，2條高分子鏈相互纏繞，形成較松散的、右旋雙螺旋結(jié)構(gòu)，賦予共軛聚合物鏈運動的自由性和共軛長度的有效性；該復(fù)合物顯示新穎的熱敏性，可以作為一種潛在的“分子溫度計”器件。

圖10　聚噻吩陽離子PT1、PEG化凝膠多糖以及兩性化凝膠多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)（a）；PT1/Cur-oeg復(fù)合物在溶液中5～85℃下的光學(xué)照片（b）；PT1/Cur-oeg復(fù)合物膜分別在潮濕空氣、甲醇蒸汽以及真空干態(tài)下的圖片（左），不同溶劑蒸汽誘導(dǎo)復(fù)合物膜顏色變化的機(jī)制示意圖（右）（c）［12］；ACs/PT1復(fù)合物在不同p H溶液中紫外光下的光學(xué)圖片（d）［91］Fig.10 Chemical structures of a cationic polythiophene（PT1），a PEGylated Curdlan（Cur-oeg）and an amphoteric curdlan（ACs）（a）；Photographs of the PT1/Cur-oeg complex solution under the temperature control from 5～85℃（b）；Photographs of PT1/Cur-oeg film which was subjected to humid air and methanol vapor and then dried in vacuo again（left）；Schematic representation of the vapor-induced color change in PT1/Cur-oeg complex film（right）（c）［12］；Photos of the emission color change for ACs/PT-1 complex aqueous solution with the p H change under the UV irradiation（d）［91］

在5～85℃，復(fù)合物的顏色隨溫度變化而發(fā)生明顯改變，由橙色轉(zhuǎn)變成黃色，且具有可逆性（圖10（b））；同時，該復(fù)合物干態(tài)膜還可以作為一種潛在的“濕度或者有機(jī)氣體的傳感器”（圖10（c）），當(dāng)把復(fù)合膜暴露在潮濕的空氣中時，膜由橙色轉(zhuǎn)變成紫紅色。這種顏色的變化是由于復(fù)合膜與水蒸氣接觸時，不良溶劑導(dǎo)致松散的雙螺旋結(jié)構(gòu)中PT1分子鏈部分片段的解離與聚集。因此，這種變化是不可逆的，當(dāng)把膜真空干燥后也不會恢復(fù)原來的橙色。然而，將膜浸潤在甲醇蒸氣后，膜由紫紅色恢復(fù)轉(zhuǎn)變成原來的顏色。這主要是因為甲醇作為PT1的良溶劑，可促進(jìn)PT1分子鏈的解聚，并與糖鏈重組形成初始結(jié)構(gòu)。若在凝膠多糖糖單元引入不同的功能基團(tuán)，如-NH2，其與PT1構(gòu)建的復(fù)合物則具有p H響應(yīng)性［91］。基于凝膠多糖的兩性特性，該復(fù)合物在不同的p H條件下結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，繼而產(chǎn)生不同顏色的熒光，并且肉眼可見。復(fù)合物在溶液中會隨p H由低到高的轉(zhuǎn)變依次顯示綠色→黃色→橙黃色→淡粉色→淡紫色→藍(lán)色的熒光變化（圖10（d））。由此，該復(fù)合物可以作為一種檢測p H變化的熒光分子探針。

5　三螺旋多糖與核酸之間的特異性分子識別與功能

5.1三螺旋多糖與核酸分子之間的特異性識別

多糖能夠通過氫鍵作用實現(xiàn)對客體分子的特異性識別［92-93］。如前所述，變性的三螺旋多糖可以依靠較強(qiáng)的分子間氫鍵作用，重新實現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。三螺旋多糖的這種復(fù)性行為與核酸分子之間的堿基配對極其相似。文獻(xiàn)報道，當(dāng)變性的三螺旋多糖與特殊序列的均聚核酸分子混合時，多糖鏈上的羥基和核酸鏈上的堿基之間依靠較強(qiáng)的氫鍵作用能夠?qū)崿F(xiàn)彼此的特異性識別，形成一種新的復(fù)合物［93-95］。例如，三螺旋香菇多糖的單鏈（s-LNT）與聚脫氧腺嘌呤核苷酸（poly（d A））相互作用，導(dǎo)致poly（d A）的圓二色譜和紫外吸收光譜發(fā)生顯著變化（圖11（a，b））。這主要是由于s-LNT通過氫鍵誘導(dǎo)poly（d A）在復(fù)合物中以螺旋的形態(tài)存在，導(dǎo)致相鄰堿基之間的堆疊作用增強(qiáng)。Sakurai等［93］認(rèn)為堿基和糖單元之間的疏水和氫鍵作用在復(fù)合物的形成過程中起關(guān)鍵作用，形成的復(fù)合物與線性三螺旋多糖結(jié)構(gòu)極其相似。與多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)相比，復(fù)合物可以看作是一條聚脫氧腺嘌呤核苷酸鏈替代了其中一條多糖鏈，和另外兩條多糖鏈構(gòu)建的三螺旋結(jié)構(gòu)（圖11（c））。Sakurai等［96］通過分子模擬對凝膠多糖與聚胞嘧啶核苷酸（poly（C））形成的復(fù)合物進(jìn)行計算，分析得出復(fù)合物中多糖鏈與核苷酸鏈主要依賴兩種氫鍵作用維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，堿基上的N3與糖單元的C2-OH以及N4上的質(zhì)子與另外一條多糖鏈上的O-2之間形成氫鍵（圖11（d））［96］；同時，證明復(fù)合物的圓二色譜最大吸收峰強(qiáng)度與兩者的化學(xué)計量比具有顯著的依賴關(guān)系［93］。通過對平衡點計量比例的計算，進(jìn)一步揭示復(fù)合物由兩條多糖鏈與一條核酸鏈構(gòu)成，形成的三螺旋復(fù)合物在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)棒狀鏈結(jié)構(gòu)［97］。此外，光散射和小角X-射線散射也證明兩者形成的復(fù)合物是一種棒狀鏈結(jié)構(gòu)［98］。多糖鏈與均聚核苷酸分子鏈之間的特異性分子識別能力是三螺旋多糖所特有的。除poly（d A）外，聚腺嘌呤核苷酸（poly （A））、聚胞嘧啶核苷酸（poly（C））和聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸（poly（d T））都可以與變性的三螺旋多糖相互作用形成三螺旋復(fù)合物。然而，聚尿嘧啶核苷酸（poly（U））、聚鳥嘌呤核苷酸（poly（G））、聚次黃嘌呤核苷酸（poly（I））、聚脫氧胞嘧啶核苷酸（poly（dC））和聚脫氧鳥嘌呤核苷酸（poly（d G））都不能和變性的三螺旋多糖單鏈相互作用形成復(fù)合物，因為這些核苷酸鏈在水溶液中通過分子內(nèi)氫鍵形成了二聚或者三聚體，導(dǎo)致與多糖鏈相互作用的氫鍵位點被占據(jù)［93-94］。此外，復(fù)性后的三螺旋香菇多糖與poly（d A）也可以相互作用形成復(fù)合物［95］，這主要是因為復(fù)性后的多糖存在大量不完整三螺旋結(jié)構(gòu)，裸露的氫鍵鍵合位點可以與核苷酸作用。然而，當(dāng)變性多糖以透析或者模擬透析的方式進(jìn)行復(fù)性后，復(fù)性的多糖主要以完整的三螺旋結(jié)構(gòu)存在［66］，其與核苷酸幾乎不發(fā)生作用。該結(jié)果進(jìn)一步證明，在復(fù)性過程中，溶劑水含量改變的速率對于調(diào)控三螺旋結(jié)構(gòu)形成的重要性，多糖與聚核苷酸分子鏈中裸露的氫鍵鍵合位點是兩者相互作用的基礎(chǔ)。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移和熒光各向異性分析技術(shù)的快速發(fā)展也為研究多糖鏈與均聚核苷酸鏈之間的相互作用提供了更加快速的方法。許小娟等［99］利用氧化石墨烯（GO）作為猝滅平臺，以熒光FAM標(biāo)記的核苷酸poly（d A）作為分子探針P1，構(gòu)建了一種檢測β-葡聚糖與聚核苷酸相互作用的傳感器。如圖12（a）所示，香菇多糖鏈s-LNT顯著增強(qiáng)了溶液的熒光強(qiáng)度，表明poly（d A）與變性的香菇多糖形成了三螺旋復(fù)合物；與此同時，s-LNT在極短時間內(nèi)引起P1各向異性值的劇烈增加（圖12（b）），進(jìn)一步證實多糖鏈與核苷酸鏈之間的特異性相互作用。此外，研究表明，具有不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的三螺旋多糖與核苷酸形成的復(fù)合物在氧化石墨烯表面具有不同的自組裝行為。如圖12（c）所示，帶側(cè)鏈的s-LNT選擇性識別分子探針P1形成剛性結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，遠(yuǎn)離GO表面，促使熒光強(qiáng)度恢復(fù)；而直鏈凝膠多糖s-CUR水溶性差，選擇性識別P1形成復(fù)合物后仍通過疏水作用附著在疏水的GO表面，引起較弱的熒光恢復(fù)。由此，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光各向異性分析方法檢測三螺旋多糖單鏈與聚核苷酸相互作用具有更高的靈敏度。

圖11　poly（d A）、t-LNT以及復(fù)合物poly（d A）/s-LNT在DMSO-H2O（ωDMSO=5%）混合溶液中的紫外圖譜（a）［95］；poly（d A）、t-LNT以及復(fù)合物poly（d A）/s-LNT在DMSO-H2O（ωDMSO=5%）混合溶液中的圓二色譜譜圖（b）［95］；分子模擬方法獲得的復(fù)合物poly（C）/s-SPG最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)形態(tài)（c）［96］；凝膠多糖與poly（C）之間的兩種氫鍵作用（d）［96］；poly（C）與s-SPG相互作用的工作繪制曲線，Ms-SPG和Mpoly（C）分別為裂褶菌多糖重復(fù)單元與核酸單元的摩爾濃度（e）［93］Fig.11 UV spectra for poly（d A），t-LNT，and poly（d A）/s-LNT in DMSO-H2O（ωDMSO=5%）solution（a）［95］；CD spectra for poly（d A），t-LNT，poly（d A）/s-LNT，and poly（d A）/t-LNT in DMSO-H2O（ωDMSO=5%）solution（b）［95］；The most stable structure for the poly（C）/s-SPG complex obtained by molecular mechanics calculations（c）［96］；Hydrogen bonds between Curdlan and poly（C）in the complex（d）［96］；The job plot for the poly（C）+s-SPG system，where Ms-SPGand Mpoly（C）are the molar concentrations of poly（C）and s-SPG，respectively（e）［93］

5.2三螺旋多糖-核酸復(fù)合物的功能

三螺旋多糖單鏈對聚核苷酸分子的特異性識別是三螺旋多糖所特有的功能，它作為一種新型材料在m RNAs的分離提?。?00］以及基因轉(zhuǎn)染方面［11，101-102］都具有應(yīng)用前景。具有蛋白質(zhì)編碼功能的m RNAs序列的分析和檢測是基因工程和DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵步驟［103］，簡單且快速地從RNA（tRNAs、r RNAs和mRNAs）序列中分離提取mRNAs非常重要。大多數(shù)真核生物的mRNAs中都含有一個具有150～300堿基數(shù)的聚腺嘌呤核苷酸poly（A）片段，為變性三螺旋多糖提供了作用位點。將變性三螺旋多糖與色譜柱填料通過共價鍵連接作為固定相，含m RNAs的緩沖液經(jīng)過色譜柱時，m RNAs上的poly（A）片段與多糖形成復(fù)合物，從而達(dá)到分離的目的。鍵合在色譜柱上的m RNAs經(jīng)過70℃熱水處理后，會從固定相上解離下來。因此，依賴多糖與核酸分子的識別作用可以實現(xiàn)mRNAs高效快速的分離。

變性三螺旋多糖與核酸形成的復(fù)合物還可作為一種潛在的基因載體，是此類復(fù)合物最具特色的功能。多糖與核酸構(gòu)建的復(fù)合體系作為一種優(yōu)秀的基因載體具備以下幾個特點：首先，三螺旋多糖是一種具有良好生物相容性且無細(xì)胞毒性的多糖，同時還具有多種生物活性；其次，三螺旋多糖本身對巨噬細(xì)胞具有靶向性，可以被細(xì)胞表面的受體識別，進(jìn)而被細(xì)胞攝取達(dá)到基因轉(zhuǎn)染的目的；第三，通過對三螺旋多糖側(cè)鏈的功能化修飾，可以達(dá)到多糖的特異性靶向識別，尤其是腫瘤細(xì)胞，可以較大程度地提高基因治療的效果；第四，多糖與核酸構(gòu)建的復(fù)合物具有較高的穩(wěn)定性，同時復(fù)合物的形成還可以在轉(zhuǎn)染過程中有效地保護(hù)核酸，避免酶對轉(zhuǎn)染基因的降解；第五，兩者形成的復(fù)合物體系在內(nèi)體或者溶酶體較低的p H環(huán)境中可以解離，釋放的基因序列經(jīng)內(nèi)體逃逸后可以進(jìn)行表達(dá)。

Shinkai和Sakurai等將目標(biāo)DNA序列與poly（d A）40片段以3種方式通過共價鍵連接，如圖13所示，然后利用變性的裂褶菌多糖s-SPG與poly（d A）40片段相互作用，構(gòu)建了一種新型的基因載體，成功用于Cp G DNA［11］、反義DNA［104-105］、siRNA［106］以及雙螺旋DNA［101-102］的轉(zhuǎn)染。

圖12　分子探針P1在不同條件下的熒光光譜（a）；熒光分子探針P1在分別加入變性多糖s-LNT以及三螺旋多糖t-LNT后的熒光各向異性值隨時間的變化曲線（b）；分子探針P1與不同類型的變性三螺旋多糖在氧化石墨烯表面的相互作用機(jī)制示意圖（c）［99］Fig.12 Fluorescence emission spectra of P1 at different conditions（a）；Fluorescence anisotropy changes of P1 in Tris-HCl buffer by adding s-LNT and t-LNT as a function of time（b）；Schematic illustration of in situ molecular probing the interaction between P1 and denatured triple-helicalβ-glucans（c）［99］

許小娟等［107-108］在轉(zhuǎn)染體系中引入二硫鍵，并基于三螺旋香菇多糖單鏈與poly（d A）50的相互作用成功構(gòu)建了一種新穎的基因載體。如圖14（a）所示，將Cp G DNA與poly（d A）50通過二硫鍵結(jié)合，然后與s-LNT相互作用，形成DNA-SS-poly（d A）50/s-LNT復(fù)合物；二硫鍵可以在不同的氧化還原勢能下發(fā)生斷裂，即在細(xì)胞外，二硫鍵可以穩(wěn)定存在；而在細(xì)胞內(nèi)，在較多還原性物質(zhì)（如半胱氨酸、γ-干擾素誘導(dǎo)的巰基還原酶（GILT）以及谷胱甘肽（GSH）等）作用下可發(fā)生斷裂［109］。因此，二硫鍵的引入使復(fù)合物具備了刺激響應(yīng)性，能夠在細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)智能釋放，從而避免poly（d A）片段對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染的干擾。同時，通過對不同分子量多糖構(gòu)建的基因載體轉(zhuǎn)染效率的考察，分子量為7.0×104的多糖構(gòu)建的基因載體顯示出較高轉(zhuǎn)染效率（圖14 （b）），這主要歸因于適當(dāng)分子量多糖構(gòu)建的基因載體不僅具備一定的穩(wěn)定性，而且具有適當(dāng)大小的粒徑尺寸，從而能被細(xì)胞攝取。轉(zhuǎn)染體系進(jìn)入細(xì)胞后，Cp G DNA從體系中釋放出來，并被鐘樣受體TLR-9識別，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-12p40的大量分泌（圖14（c））。二硫鍵的引入顯著提高了復(fù)合物載體的轉(zhuǎn)染效率。

圖13　兩端修飾雙鏈DNA的示意圖（a）［101］；仿病毒結(jié)構(gòu)修飾DNA的示意圖（b）［102］；SPG與d A-siTNFa的特異性識別與復(fù)合物的構(gòu)建示意圖，用于基因轉(zhuǎn)染體系（c）［106］Fig.13 Proposed methods to modify the end of double-stranded DNAs（a）［101］；The DNA design concept for increasing transfection by imitating viral genomes（b）［102］；Schematic illustration to show a complex structure made from d A-siTNFa and SPG and its molecular specificity（c）［106］

圖14　將目標(biāo)基因與poly（d A）50通過二硫鍵鍵合，s-LNT與poly（d A）50構(gòu)建Cp G DNA基因載體的示意圖（a）；流式細(xì)胞檢測空白樣品與Cy3標(biāo)記的復(fù)合物基因載體在RAW264.7細(xì)胞中的攝取效率（b）；RAW264.7細(xì)胞在不同化學(xué)物質(zhì)刺激作用下，細(xì)胞因子的釋放含量（c）［107］Fig.14 Concept proposed for the CpG DNA delivery system fabricated by s-LNT and poly（d A）50via disulfide bonding （a）；Flow cytometry images of the blank and complexes Cy3-DNA1-SS-poly（d A）50/s-LNT iuptaken by RAW264.7（b）；The cytokine secretions from RAW264.7 cells stimulated by various chemicals（c）［107］

此外，對多糖的功能性修飾也可顯著提高三螺旋多糖作為載體的優(yōu)越性。修飾后的多糖與聚核苷酸形成的復(fù)合物與細(xì)胞之間的特異性識別功能更加靈敏，可顯著提高轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)效果。比如，精胺和R8多肽（精氨酸）修飾的裂褶菌多糖有效提高復(fù)合物載體與抗原呈現(xiàn)細(xì)胞的識別能力，從而大幅度提高了CpG DNA轉(zhuǎn)染效率［11，110］；葉酸［111］和β-乳糖苷基團(tuán)［112］的引入還可以提高復(fù)合物分別對腫瘤細(xì)胞以及肝細(xì)胞的選擇性識別能力；對多糖PEG化修飾［113］還能有效避免基因轉(zhuǎn)染過程中溶酶體對基因序列的降解，較大程度地提高基因轉(zhuǎn)染效率。

三螺旋多糖與poly（d A）構(gòu)建的功能復(fù)合物不僅能夠促進(jìn)免疫因子的釋放，引起人體相應(yīng)的免疫應(yīng)答，而且，實驗研究顯示K Cp G DNA與裂褶菌多糖構(gòu)建的復(fù)合物還能靶向作用于核內(nèi)體，誘導(dǎo)外周血漿單核細(xì)胞產(chǎn)生大量的Ⅰ和Ⅱ型干擾素［114］。復(fù)合物能夠在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中富集，因此，該復(fù)合物可以作為一種有效的免疫佐劑，與抗原一起誘導(dǎo)人體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其刺激殺傷性T細(xì)胞的免疫分化。隨著合成化學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，三螺旋多糖基復(fù)合物還成功地用于蛋白多肽分子的轉(zhuǎn)運，并在癌癥和傳染病的治療中表現(xiàn)出優(yōu)異性能［115］。例如，卵清蛋白多肽片段（OVA257-264）與poly（d A）40通過共價鍵結(jié)合，可與變性裂褶菌多糖構(gòu)建功能復(fù)合物。同時，它與Cp G DNA/裂褶菌多糖復(fù)合物能夠協(xié)同作用，顯著降低腫瘤細(xì)胞的數(shù)量以及延緩腫瘤細(xì)胞的生長。

6　展 望

多糖作為繼蛋白質(zhì)和核酸之后的第三大生物高分子，其糖苷鍵鍵型和鍵接方式的多樣性導(dǎo)致多糖的高級結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，因此多糖能夠承載更多的生物信息。三螺旋多糖的高級結(jié)構(gòu)直接決定其生物功能，由此，剖析并精準(zhǔn)調(diào)控多糖螺旋結(jié)構(gòu)的形成，闡明它們與蛋白質(zhì)、核酸之間的相互作用將成為揭開生命奧秘的鑰匙。同時，變性三螺旋多糖對客體分子的識別，以及以螺旋鏈構(gòu)象為模板誘導(dǎo)自組裝構(gòu)建的糖基功能材料，在生物醫(yī)藥、化學(xué)傳感、手性聚合以及納米材料領(lǐng)域具有無可比擬的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

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Recent Progress in Chain Conformation and Function of Triple Helical Polysaccharides

LIU Qing-ye1， XU Xiao-juan2
（1.College of Chemical and Environmental Engineering，North University of China，Taiyuan 030051，China；2.College of Chemistry and Molecular Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China）

Triple helical polysaccharides，a naturally occurring biopolymer with special structure，not only shows high biological activity，but also exhibits particular molecular recognition and incomparable features. This review mainly introduces the chain structure and multiple conformation transition of triple helical polysaccharides，analyzes the molecular chain interactions during the denaturation and renaturation process，and reveals the scientific principles for the formation and morphological changes of triple helical structure.Meanwhile，the correlation of biological activity to chain conformation of triple helical polysaccharides，and the recent progress in polysaccharide-based functional materials which were constructed based on the conformation transition were also reviewed.

triple helical polysaccharides；chain conformation；function

O631

A

1008-9357（2016）02-0137-019DOI： 10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.02.002

2016-05-20

國家自然科學(xué)基金（20874078；21274114；21574102）；中北大學(xué)2015?；穑?10246）

劉青業(yè)（1984-），男，山西孝義人，博士，講師，主要研究方向為多糖鏈構(gòu)象與功能。E-mail：qingyeliu@126.com

許小娟，E-mail：xuxj@whu.edu.cn