MUC3A在肝外膽管癌組織中的表達(dá)及臨床意義

周海斌，金杭斌，謝璐，張?bào)泺P，楊建鋒

MUC3A在肝外膽管癌組織中的表達(dá)及臨床意義

周海斌，金杭斌，謝璐，張?bào)泺P，楊建鋒

目的探討?zhàn)さ鞍?A（MUC3A）在肝外膽管癌（ECC）組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集手術(shù)切除的ECC癌組織標(biāo)本35份（35例），以手術(shù)切緣陰性組織為正常組織標(biāo)本20份（20例）。采用鏈霉素親和生物素-過氧化物酶免疫組化方法（SP法）檢測并對比MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達(dá)情況，同時收集35 例ECC患者的臨床病理資料，分析MUC3A與臨床病理特性之間的相關(guān)性。結(jié)果MUC3A在腫瘤組織癌巢中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內(nèi)也可見到不同程度的免疫染色。MUC3A在ECC癌組織中的陽性表達(dá)率為85.7％，在正常膽管組織中的陽性表達(dá)率為35.0％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。膽管癌組織中MUC3A的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位方面均無關(guān)（均＞0.05）；MUC3A在癌組織低分化或未分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達(dá)率均高于癌組織的中分化或高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無周圍組織浸潤、UICC分期Ⅰ～Ⅱ期（均＜0.05）。結(jié)論MUC3A在膽管癌組織中高表達(dá)，并與病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期密切相關(guān)，MUC3A蛋白高表達(dá)提示ECC患者預(yù)后不良。

膽管腫瘤；肝外膽管癌；黏蛋白3A；臨床病理；預(yù)后

膽管癌統(tǒng)指膽管系統(tǒng)襯覆上皮發(fā)生的一種惡性程度很高的腫瘤，按所發(fā)生的部位可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌（ECC）兩大類［1］。ECC對化療、放療等輔助性治療普遍不敏感，手術(shù)切除腫瘤組織是唯一有效的治療手段，然而，臨床上超過2/3以上的患者明確診斷時已屬于晚期而失去了手術(shù)根治的機(jī)會［1-2］。對于無法手術(shù)切除病灶的患者，其生存期通常只有6～9個月［3-4］。由此，尋找探索ECC發(fā)病以及惡化進(jìn)展的相關(guān)因素及分子機(jī)制，對改善ECC患者預(yù)后及總體生存率具有重要意義。筆者前期通過抽取ECC患者膽汁進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在ECC患者與正常人群膽汁中MUC3A表達(dá)具有明顯的差異。為了更深入認(rèn)識MUC3A與ECC之間的關(guān)系，筆者應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測在膽管癌組織中的表達(dá)情況，并分析與ECC臨床病理特性的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2014 年12月杭州市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的ECC癌組織石蠟標(biāo)本35份（35例患者），術(shù)前均未接受化療或放療等抗腫瘤治療。其中男16例，女19例；年齡36～70歲，平均（52.6±8.9）歲。選擇其中經(jīng)病理學(xué)證實(shí)未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤的陰性切緣標(biāo)本作為正常膽管組織（20份，來自20例患者），其中男11例，女9例；年齡40～69歲，平均（58.5±9.5）歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。

1.2研究方法采用免疫組化方法檢測MUC3A在組織中的表達(dá)。（1）采用鏈霉素親和生物素-過氧化物酶免疫組化方法（SP法）進(jìn)行免疫組化染色，按照SP免疫組化試劑盒說明書所要求的步驟進(jìn)行操作；采用雙盲法、由兩名高年資病理專業(yè)醫(yī)師獨(dú)立閱片，以已知陽性切片作陽性對照片，用PBS代替一抗作陰性對照。（2）主要實(shí)驗(yàn)試劑：MUC3A采用小鼠抗MUC3A抗體（LifeSpan Biosciences，美國）。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：采用半定量方法，依據(jù)陽性染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比兩個方面。其中染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞無著色記0分、細(xì)胞著色為淺黃色記1分、細(xì)胞著色為棕黃色記2分、細(xì)胞著色為棕褐色記3分；陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞全部陰性記0分、陽性細(xì)胞比率＜10％記1分、陽性細(xì)胞比率為11％～50％記2分、陽性細(xì)胞比率為51％～75％記3分、陽性細(xì)胞比率＞75％記4分；然后將細(xì)胞染色強(qiáng)度的分值乘以陽性細(xì)胞比率的分值，依據(jù)所得數(shù)值的不同將免疫組化結(jié)果分為4個等級：0～2分記為―、3～4分記為+、6～8分記為2+、9～12分記為3+，其中0～2分定為陰性表達(dá)、3 ～12分定為陽性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達(dá)MUC3A在腫瘤組織癌巢中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內(nèi)也可見到不同程度的免疫染色。MUC3A在ECC癌組織中的陽性表達(dá)率為85.7％，在正常膽管組織中的陽性表達(dá)率為35.0％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=14.87，＜0.01），見表1。

2.2ECC患者臨床病理特征腫瘤位于肝門部13例、遠(yuǎn)端22例，分別占37.1％、62.9％；病理類型均為腺癌，其中高分化和中分化18例，低分化和未分化17例，分別占51.4％、48.6％；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例，分別占71.4％、28.6％；侵及周圍組織器官者23例、未侵及周圍組織器官12例，分別占65.7％、34.3％；UICC分期I～I(xiàn)I期9例、III～Ⅳ期26例，分別占25.7％、74.3％。

2.3MUC3A的表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系以年齡60歲、腫瘤位于肝門或遠(yuǎn)端、組織分化程度是中分化和高分化或低分化和未分化、有或無淋巴結(jié)、有或無周圍組織浸潤、國際抗癌協(xié)會制定的膽管癌臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)（即UICC分期）Ⅰ～Ⅱ或Ⅲ～Ⅳ為標(biāo)準(zhǔn)。膽管癌組織中MUC3A的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位方面均無關(guān)（均＞0.05）；MUC3A在癌組織低分化或未分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達(dá)率均高于癌組織的中分化或高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無周圍組織浸潤、UICC分期Ⅰ～Ⅱ期（均＜0.05），見表2。

3　討論

目前臨床上對ECC的診斷主要依據(jù)“無痛性黃疸+膽管擴(kuò)張+膽管腫物”的診斷模式，ECC早期診斷率不高，加上ECC惡性程度高，進(jìn)展快，因此，超過2/3以上的患者明確診斷時已屬腫瘤晚期［1-2］。本研究納入的術(shù)前判斷可行手術(shù)根治切除的35例患者中，術(shù)后發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期分別高達(dá)到71.4％、65.7％、74.3％。因此，除提高早期診斷率外，有必要深入進(jìn)行ECC惡化進(jìn)展的相關(guān)因素及分子機(jī)制研究，為進(jìn)一步提高臨床治療效果提供思路。

大量研究顯示黏蛋白是許多惡性腫瘤的有效且可靠的預(yù)后判斷指標(biāo)，MUC3是黏蛋白的一種，位于染色體7q22上的黏蛋白簇，歸類為膜相關(guān)黏蛋白，分為MUC3A和MUC3B兩個亞型［5］，以往MUC3A的研究多集中與胃腸道腫瘤，發(fā)現(xiàn)MUC3A的表達(dá)與胃癌、結(jié)腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)［6-7］。Shibahara等［8］通過免疫組化檢測闌尾腺癌組織MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC6、MUC16和MUC17的表達(dá)，多元分析顯示靜脈浸潤陽性、非治愈性切除和MUC3表達(dá)陽性是闌尾腺癌預(yù)后不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1　MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織的表達(dá)例

表2　MUC3A表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系例

有關(guān)MUC3A在肝膽管正常組織及膽管癌中表達(dá)的研究數(shù)量不多，且大多為國外研究。有研究顯示肝膽管上皮細(xì)胞在出生之前主要表達(dá)MUC1，出生之后停止表達(dá)而轉(zhuǎn)變?yōu)镸UC3表達(dá)［9］。Sasaki等［10］報(bào)道在正常膽囊及肝內(nèi)膽管組織黏蛋白基因主要表達(dá)MUC3；MUC3A在與肝硬化相關(guān)或合并肝細(xì)胞肝癌的膽管癌患者中表達(dá)是降低的［11］；并通過分析19例肝門部和10例遠(yuǎn)端膽管癌發(fā)現(xiàn)，MUC3A的表達(dá)與腫瘤部位具有相關(guān)性，肝門部陽性率（68％）明顯高于遠(yuǎn)端膽管癌（10％）［12］。但本研究結(jié)果未顯示肝門部與遠(yuǎn)端膽管在MUC3A陽性率上的差異，推測MUC3A表達(dá)與腫瘤部位不具有相關(guān)性，這可能與納入研究的人群、病理類型、分化程度及腫瘤分期等因素不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示MUC3A在ECC腫瘤組織癌巢中高表達(dá)，其陽性率明顯高于癌旁正常組織，MUC3A在腫瘤細(xì)胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內(nèi)也可見到不同程度的免疫染色，提示MUC3A可以被腫瘤細(xì)胞分泌至細(xì)胞外。MUC3A的陽性表達(dá)比例在腫瘤細(xì)胞分化低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍浸潤和UICC分期在III～I(xiàn)V患者中明顯升高，提示MUC3A與ECC病理類型、腫瘤分期密切相關(guān)，MUC3A的陽性表達(dá)可影響著ECC患者的預(yù)后，是預(yù)后不良的因素之一。

ECC組織學(xué)類型以腺癌最常見，本組35例患者均為腺癌。根據(jù)癌細(xì)胞分化程度將膽管癌劃分為4個病理類型：高分化型、中分化、低分化及未分化型，不同組織學(xué)類型的膽管癌其發(fā)生機(jī)制和生物學(xué)行為有所不同。因樣本量有限，本研究根據(jù)病理與預(yù)后的關(guān)系，將低分化及未分化型合并一組，中分化和高分化合并為一組，結(jié)果顯示低分化及未分化組MUC3A陽性率明顯高于中分化和高分化一組，提示MUC3A表達(dá)與ECC腫瘤細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，MUC3A陽性率越高，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，預(yù)后越差。與本研究結(jié)果不同，Mall等［13］通過對26例膽管癌組織標(biāo)本進(jìn)行黏蛋白免疫組化發(fā)現(xiàn)，僅6例（23.1％）患者M(jìn)UC3呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且MUC3在組織高分化中陽性表達(dá)率要明顯高于低分化和中分化，這也可能與納入研究的人群、腫瘤分期等因素不同有關(guān)。

手術(shù)切除是治療膽管癌的首要方法，手術(shù)效果主要取決于腫瘤的部位和腫瘤浸潤膽管的程度、手術(shù)無瘤切緣及是否有淋巴轉(zhuǎn)移。UICC分期對于ECC治療及預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。本研究中將Ⅰ、Ⅱ期合并為一組，Ⅲ期和Ⅳ期合并為一組，Ⅲ期和Ⅳ期組MUC3A陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ和Ⅱ期組，提示MUC3A陽性率與腫瘤分期密切相關(guān)，腫瘤分期越遲，MUC3A陽性表達(dá)率越高，提示預(yù)后越差。

綜上所述，MUC3A在ECC腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，并且該蛋白的表達(dá)狀態(tài)與病理類型、腫瘤分期具有密切的相關(guān)性，MUC3A蛋白高表達(dá)預(yù)示著ECC患者不良的預(yù)后。筆者下一步將通過研究MUC3A對膽管癌細(xì)胞的生長、克隆增殖及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步探討其在膽管癌發(fā)生和演進(jìn)過程中的作用及可能分子機(jī)制。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.033

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1671-0800（2016）08-1040-03

2016-05-04

（本文編輯：姜曉慶）

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C33251）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013KYB204）

310005杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州醫(yī)院

楊建鋒，Email：yjf-1976@163.com