李麗燕＊，俞金正，沈 群（永康市中醫(yī)院藥劑科，浙江永康 321300）

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2016）25-3509-04 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.16

李麗燕＊，俞金正，沈 群（永康市中醫(yī)院藥劑科，浙江永康 321300）

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2016）25-3509-04 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.16

目的：研究黃芪顆粒對病毒性心肌炎模型大鼠心肌細胞中小凹蛋白3（Cav-3）和Smad家族蛋白3（Smad3）表達的影響。方法：將90只大鼠隨機分為正常組、模型組、參麥注射液組［陽性藥物，0.2 g/（kg·d）］和黃芪顆粒低、中、高劑量組［0.42、0.84、1.68 g/（kg·d）］，每組15只。除正常組外，其余各組大鼠均ip CVB3病毒復(fù)制病毒性心肌炎模型。造模同時各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，連續(xù)15 d。各組分別于給藥3、9、15 d后取5只大鼠進行實驗，觀察大鼠心肌組織病理改變，并進行評分；檢測心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白的表達。結(jié)果：給藥15 d后，與正常組比較，模型組大鼠心肌纖維大量增生，發(fā)生明顯病變，病理評分和心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織病變得到改善，病理評分和心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：黃芪多糖可明顯下調(diào)病毒性心肌炎模型大鼠心肌細胞中Cav-3、Smad3基因的表達，推測是其防治病毒性心肌炎的作用機制之一。

黃芪顆粒；病毒性心肌炎；小凹蛋白3；Smad家族蛋白3；大鼠

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是一種嗜心肌性病毒在心肌細胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致的兒科常見心血管疾病，以心肌變性、壞死、間質(zhì)炎癥細胞浸潤及纖維滲出為主要病理改變，其病原體包括柯薩奇病毒、?？刹《尽⒓顾杌屹|(zhì)炎病毒、腺病毒等，且近年來VMC的發(fā)病率呈上升趨勢［1］。VMC本身屬急癥，可導(dǎo)致心力衰竭或心源性休克甚至猝死，目前國內(nèi)外對該病尚缺乏有效的治療藥物和措施。

黃芪系豆科黃芪屬植物，其提取物包含黃芪甲苷、黃芪皂苷及黃芪多糖等主要成分，在黃芪提取物制品中臨床主要以黃芪顆粒和黃芪注射液兩種劑型最為常用。實驗證實，黃芪提取物具有益氣扶正、增強免疫、抑制腫瘤、減毒增效等功效［2］，然而其作用機制尚未完全明確。小凹蛋白3（Caveolin-3，Cav-3）在心肌細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用，參與維持心肌的發(fā)育和能量代謝；Smad家族蛋白3（Smad 3）參與了心肌細胞的凋亡過程，與Cav-3在VMC的發(fā)病過程中共同發(fā)揮重要作用［3］。因此，本研究采用CVB3病毒感染，復(fù)制VMC大鼠模型，以黃芪顆粒進行治療，考察黃芪顆粒對大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3表達的影響，分析其防治VMC的可能作用機制，為其臨床應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Mini Protean 3 Cell垂直型電泳儀、Bio-Rad iQ5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；Allegra 25R高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；IX73倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪顆粒［南京同仁堂藥業(yè)有限公司，批號：140604，規(guī)格：15 g/袋］；參麥注射液（上海醫(yī)藥正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：151103，規(guī)格：2 g∶10 ml）；β-actin兔抗單克隆抗體、兔抗Cav-3、Smad3一抗（北京博奧森生物公司，批號：bs-0061R、bs-3610R、bs-3484R）；Trizol、RT-PCR試劑盒（江蘇恩莫阿賽生物科技有限公司，批號：N2015031152、P2014061181）；其余試劑為分析純。

1.3 動物與病毒株

健康SD大鼠90只，♀♂不限，體質(zhì)量（182.6±35.7）g，鼠齡7～9周，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供［合格證號：SYXK（遼）2005-0013］。

CVB3病毒株由武漢大學(xué)病毒學(xué)研究所提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠普通飲食、自由攝水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用苦味酸標記頭部及四肢。然后將大鼠隨機分為6組，即正常組，模型組、參麥注射液組和黃芪顆粒低、中、高劑量組，每組15只。除正常組外，其余各組大鼠ip CVB3稀釋液（0.2 ml）復(fù)制VMC模型［4］，每隔4 d注射1次；正常組大鼠ip等體積不含病毒的培養(yǎng)液。造模同時，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水20 ml/（kg·d）；黃芪顆粒低、中、高劑量組大鼠分別ig黃芪顆粒0.42、0.84、1.68 g/（kg·d）（分別由成人臨床用量的1、2、4倍劑量換算而得）；參麥注射液組大鼠ip參麥注射液0.2 g/（kg·d）［5］。每天根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，連續(xù)15 d；并每天觀察各組大鼠飲食、活動、毛色、排泄等一般情況，以考察毒性作用。

2.2 心肌組織病理觀察與評分

分別于給藥后3、9、15 d各組隨機取5只大鼠稱質(zhì)量、脫臼處死，迅速取出心臟用生理鹽水沖洗干凈后，用剪刀沿中軸線剪為兩半。一半經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋制作組織切片，然后行蘇木精-伊紅（HE）染色分析組織病理變化；另一半保存于液氮中。HE染色后以倒置顯微鏡觀察并計算炎癥細胞浸潤、心肌壞死面積占整個切片心肌面積的百分比。心肌組織炎癥、壞死病理變化半定量評分參照文獻［3］中方法。無炎癥細胞浸潤、心肌壞死，計0分；炎癥細胞浸潤、心肌壞死面積＜25%，計1分；炎癥細胞浸潤、心肌壞死面積為25%～50%，計2分；炎癥細胞浸潤、心肌壞死面積為50%～75%，計3分；炎癥細胞浸潤、心肌壞死面積＞75%，計4分。

2.3 心肌細胞中Cav-3、Smad3mRNA表達的測定

采用RT-PCR法。稱取給藥15 d后的心肌組織，勻漿，按Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，測定其純度后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR反應(yīng)模板。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，內(nèi)參）引物上游序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游序列：5′-TCCACCACCCTGTTCTGTA-3′；Cav-3引物上游序列：5′-TCAAGGACATTCACTGCA-AGG-3′，下游序列：5′-AAGAGCGGGTTGCAGAAGGTGC-3′；Smad3引物上游序列：5′-CCCAAGCTTTCGTCCATCCTGCCTTTCACT-3′，下游序列：5′-GGAATTCCTAAGACACACTGGAACAGCG-3′。用RT-PCR儀進行引物擴增，設(shè)置反應(yīng)條件為：95°、30s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環(huán)；95 ℃、15 s。計算目的基因的2－ΔΔct值［6］，以此值為參數(shù)進行半定量分析。實驗重復(fù)3次。

2.4 心肌細胞中Cav-3、Smad3蛋白表達的測定

采用Western blot法。稱取給藥15 d后的大鼠心肌組織0.5 g，加入1 ml RIPA裂解緩沖液冰浴研磨。在4 ℃下，以離心半徑為10 cm、12 000 r/min離心15 min，取上清，采用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度。取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠中，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜），用5%脫酯奶粉封閉，分別加一抗（兔抗Cav-3、Smad3抗體，稀釋比例為1∶1 000），37℃孵育2 h，0.1%三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（TBST）漂洗，然后加二抗［辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L），稀釋比例為1∶2 000］，室溫孵育2 h；TBST洗膜，增強化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯影，X光膠片定影。采用凝膠分析軟件Quantity One掃描條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin（內(nèi)參）灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。試驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

正常組大鼠毛色光澤、飲食正常，對刺激反應(yīng)靈敏，動作敏捷，無死亡情況。模型組大鼠在造模第3天開始出現(xiàn)少食、毛色灰暗、活動減少、對刺激反應(yīng)遲緩等現(xiàn)象，隨著時間的延長出現(xiàn)拱背、腹瀉、四肢腫脹等現(xiàn)象，且出現(xiàn)3例死亡。各給藥組大鼠在給藥9 d后出現(xiàn)毛色變灰暗、毛倒豎、活動及進食減少等現(xiàn)象，并出現(xiàn)輕微腹瀉、運動遲緩等癥狀；給藥15 d后逐漸恢復(fù)正常，進食增加，活動增多，無死亡情況，較模型組相對活躍。

3.2 各組大鼠心肌組織病理觀察結(jié)果

正常組大鼠心肌組織正常，無病理損傷。模型組大鼠在造模3 d后開始出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，有炎性細胞浸潤、心肌細胞腫脹、紋肌細胞出現(xiàn)壞死、局部纖維增生現(xiàn)象；9 d后出現(xiàn)炎性病灶、壞死區(qū)域增大的變化；15 d后炎性細胞浸潤被吸收、心肌纖維大量增生，病理評分較正常組明顯升高（P＜0.05）。黃芪顆粒各劑量組及參麥注射液組大鼠病理變化有所改善，給藥15 d后各給藥組大鼠病理評分均明顯降低（P＜0.05）。各組大鼠病理切片見圖1，病理評分結(jié)果見表1。

圖1 給藥15d后各組大鼠心肌組織切片圖（HE染色，×400）Fig 1 The cardiac muscle tissue sections of rats in all groups after 15days of drug use（HE staining，×400）

3.3 各組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達均減少（P＜0.05）。各組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達測定結(jié)果見表2，蛋白表達電泳圖見圖2。

表1 給藥15d后各組大鼠病理評分結(jié)果（±s，n=5）Tab 1 Pathological scores of rats in all groups after 15 days of drug use（±s，n=5）

表1 給藥15d后各組大鼠病理評分結(jié)果（±s，n=5）Tab 1 Pathological scores of rats in all groups after 15 days of drug use（±s，n=5）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

組別正常組模型組參麥注射液組黃芪顆粒低劑量組黃芪顆粒中劑量組黃芪顆粒高劑量組病理評分0 3.64±0.31＊2.26±0.22#3.01±0.24#2.35±0.26#2.21±0.18#

表2 各組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 2 The levels of the mRNA and protein expressions of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells of rats in all groups（±s，n=5）

表2 各組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白表達測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 2 The levels of the mRNA and protein expressions of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells of rats in all groups（±s，n=5）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

組別正常組模型組參麥注射液組黃芪顆粒低劑量組黃芪顆粒中劑量組黃芪顆粒高劑量組Cav-3蛋白0.35±0.07 0.64±0.13＊0.44±0.09#0.56±0.11#0.50±0.09#0.42±0.08#mRNA 0.25±0.06 0.48±0.10＊0.31±0.06#0.42±0.08#0.35±0.07#0.30±0.08#蛋白0.24±0.06 0.47±0.11＊0.30±0.05#0.41±0.09#0.36±0.06#0.29±0.07#Smad3 mRNA 0.42±0.08 0.71±0.12＊0.51±0.10#0.63±0.12#0.57±0.10#0.49±0.09#

圖2 各組大鼠心肌細胞Cav-3、Smad3蛋白表達電泳圖Fig 2 The electrophoregrams of Cav-3 and Smad3 protein expressions in the myocardial cells of rats in all groups

4 討論

近年抗生素的廣泛使用使病毒性心肌炎在兒童及青少年中的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病機制尚未完全清楚。心肌纖維化、免疫機制等均涉及其中［7-8］，病毒的直接損傷是最直接的因素，其中以CVB3病毒最為常見［9］。CVB3病毒首先通過心肌細胞表面的柯薩奇-腺病毒受體（CAR）黏附于心肌細胞，同時利用補體缺陷蛋白-衰老加速因子（DAF）作為協(xié)同因子，使病毒發(fā)生構(gòu)象改變［10］，然后將RNA釋放到基質(zhì)中，再利用宿主細胞自身蛋白合成系統(tǒng)合成病毒蛋白。研究顯示，感染CVB3病毒的心肌細胞通過蛋白激酶2A分解心肌細胞中抗萎縮糖蛋白復(fù)合物，進而損傷心肌細胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致心肌功能障礙［11］。

目前關(guān)于VMC尚無特效治療方法，臨床主要采用對癥支持治療、調(diào)節(jié)機體免疫力以及抗病毒治療為主。研究表明，病毒感染初期給予抗病毒藥物干預(yù)能夠顯著提高VMC模型動物的生存率，因此早期抗病毒藥物的應(yīng)用對抗病毒有重要作用，但目前國內(nèi)外對于VMC的治療尚缺乏安全、有效的藥物。近年，對中醫(yī)藥的抗病毒活性及保護心肌損害的研究逐漸引起研究者的關(guān)注。黃芪在臨床上能有效治療病毒性心肌炎，改善VMC患者的臨床癥狀，改善心臟早搏情況，縮短心肌損傷恢復(fù)時間［12-13］。李芳等［14］研究顯示，黃芪能夠降低感染CVB3后大鼠心臟組織的CAR表達，從而減輕CVB3病毒對心肌的損害。參麥注射液是由生脈散衍生而來，主要成分為紅參和北五味子，具有正性肌力、增加心肌收縮力、增加每搏輸出量及冠狀動脈流量的作用，可改善心肌缺氧狀況、降低心肌耗氧量、改善心律失常等，臨床研究證實其可明顯改善VMC患者病理癥狀，因此在本研究中筆者以其為陽性藥物。

Cav-3是表達于心肌和骨骼肌細胞的信號分子支架蛋白和負性調(diào)節(jié)蛋白，能夠與下游信號分子結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞對外界刺激的應(yīng)答。多數(shù)學(xué)者認為VMC的發(fā)展與心肌細胞纖維化密切相關(guān)。心肌細胞外基質(zhì)中的膠原纖維大量聚集，心肌纖維化在其中有重要作用，而轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）作為公認的調(diào)節(jié)心肌纖維化的關(guān)鍵因子，可激活Smad3，從而參與心肌細胞炎癥的發(fā)生。而心肌細胞內(nèi)TGF-β1的活性又受到Cav-3的調(diào)控［15］，因此Cav-3與Smad3通過TGF-β1的橋梁作用，在心肌炎癥的發(fā)生發(fā)展中共同發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果顯示，CVB3感染大鼠心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白的表達顯著升高；經(jīng)過黃芪顆粒給藥后大鼠心肌細胞中Cav-3、Smad3 mRNA及其蛋白的表達顯著降低，且心肌組織病理損傷較模型組亦顯著改善，這提示黃芪顆粒可能通過調(diào)節(jié)心肌細胞中Cav-3、Smad3的表達發(fā)揮治療VMC的作用。

綜上所述，黃芪顆粒能夠顯著改善CVB3感染大鼠心肌組織的病理損傷，具有抗CVB3感染的作用，其作用機制可能與下調(diào)心肌細胞中Cav-3、Smad3基因的表達有關(guān)。

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Effects of Astragalus Granules on the Cav-3 and Smad3 Expression in the Myocardial Cells of Rats with Viral Myocarditis

LI Liyan，YU Jinzheng，SHEN Qun（Department of Pharmacy，Yongkang Hospital of TCM，Zhejiang Yongkang 321300，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Astragalus granules on the expression of Caveolin-3（Cav-3）and Smad family member 3（Smad3）in the myocardial cells of rats with viral myocarditis.METHODS：90 rats were randomly divided into a normal group，a model group，a Shenmai injection group［positive drug，0.2 g/（kg·d）］and the groups of low，medium and high-dose Astragalus granules［0.42，0.84，1.68 g/（kg·d）］，with 15 rats in each group.The rats in all groups except for the normal group were given CVB3 ip for the establishment of viral myocarditis model.Meanwhile，the rats in the drug administration groups were given corresponding drugs ig，while those in the normal group and the model group were given normal saline ig，for 15 consecutive days.5 rats were selected from each group respectively on the 3rd，9th and 15th days of drug use to take an experiment.For the rats，the pathological change of the cardiac muscle tissue was observed and scored，and the mRNA and protein expression of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells were detected.RESULTS：After 15 days of drug use，compared to the normal group，the rats of the model group had hyperplasia of a large number of cardiac muscle fibers，obvious lesions at cardiac muscle fibers，and significantly higher pathological score and levels of the mRNA and protein expression of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells （P＜0.05）.Compared to the model group，the rats in the drug administration groups had cardiac muscle tissue lesions improved and had obviously lower pathological score and levels of the mRNA and protein expression of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Astragalus granules can markedly downregulate the gene expression of Cav-3 and Smad3 in the myocardial cells of rats with viral myocarditis，which is inferred as a prevention and treatment mechanism of viral myocarditis.

Astragalus granules；Viral myocarditis；Caveolin-3；Smad family member 3；Rats

2015-10-27

2016-06-17）（編輯：林 靜）

＊主管藥師。研究方向：藥理學(xué)。電話：0579-89277080。E-mail：497645135@qq.com