正交試驗優(yōu)化杠板歸的蜜炙工藝

沈 偉，路立峰，李赫宇（1.山東中醫(yī)藥高等專科學?？蒲刑?，山東煙臺 64199；.山東藥品食品職業(yè)學院中藥系，山東威海 6410；.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 00457）

正交試驗優(yōu)化杠板歸的蜜炙工藝

沈 偉1＊，路立峰2，李赫宇3（1.山東中醫(yī)藥高等專科學?？蒲刑?，山東煙臺 264199；2.山東藥品食品職業(yè)學院中藥系，山東威海 264210；3.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457）

目的：優(yōu)化杠板歸的蜜炙工藝。方法：以有效成分槲皮素和水溶性浸出物的含量為綜合評價指標，選取蜂蜜用量、悶潤時間、烘制溫度及烘制時間為考察因素，采用L（934）正交試驗優(yōu)化杠板歸的蜜炙工藝并進行驗證試驗。結(jié)果：最優(yōu)蜜炙工藝條件為取杠板歸藥材加蜂蜜30%，悶潤120 min，70 ℃溫度下烘制50 min。驗證試驗中制備的3批炙杠板歸的槲皮素含量均大于0.05%，水溶性浸出物含量均大于25%（RSD均＜2.5%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的炮制工藝穩(wěn)定、可行，為規(guī)范杠板歸飲片的蜜炙操作與成品質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)。

杠板歸；蜜炙工藝；正交試驗；槲皮素；水溶性浸出物

杠板歸，收載于2015年版《中國藥典》（一部）中，又名扛板歸、犁尖草、蛇牙草、貫葉蓼、河白草、刺蓼、蛇倒退等，系蓼科植物杠板歸Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分，味酸，性微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具有清熱解毒、利水消腫、止咳的功能，主治咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿少、濕熱瀉痢、濕疹、癤腫、蛇蟲咬傷等［1］，主要含有黃酮類、蒽醌類、苯丙素類、萜類、酰胺類和其他類化合物［2-3］?，F(xiàn)代藥理實驗結(jié)果表明，杠板歸具有抗炎、祛痰止咳、抗菌、保肝、抗皰疹病毒、抗腫瘤等活性作用［4-6］，其在全國各地均有分布，民間常用單味杠板歸蜜炙品或復方制劑治療咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳（百日咳）等癥，效果顯著［7-8］。目前應(yīng)用最多的飲片為生品杠板歸和蜜炙杠板歸，明代陳嘉謨在《本草蒙筌》有“蜜制甘緩難化，增益元陽”的論述，意即蜜炙后能增強藥物的潤肺祛痰、止咳平喘、補中益氣之功。但蜜炙杠板歸的工藝尚不規(guī)范，《中國藥典》、全國及各省中藥炮制規(guī)范均未規(guī)定杠板歸的炮制工藝及技術(shù)參數(shù)，各地飲片質(zhì)量差異較大。本試驗在傳統(tǒng)蜜炙操作的基礎(chǔ)上，以杠板歸有效成分槲皮素和水溶性浸出物的含量為綜合評價指標，采用正交試驗法，對蜂蜜用量、悶潤時間、烘制溫度及烘制時間4個因素進行考察，優(yōu)化其恒溫干燥條件下的蜜炙工藝，為炙杠板歸的炮制與飲片的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)與參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010AHT高效液相色譜儀、LC Solution色譜工作站、恒溫柱箱、自動進樣器、紫外檢測器（日本島津公司）；R200D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

杠板歸飲片（亳州市滕王藥業(yè)有限責任公司，批號：2014-0816，經(jīng)山東中醫(yī)藥高等專科學校中藥鑒定教研室張欽德教授鑒定為蓼科植物杠板歸的干燥地上部分）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200907，純度：＞98%）；蜂蜜（北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司，批號：20140603，食用級）；甲醇為色譜純；磷酸、乙醇為分析純；水為雙蒸水并經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 煉蜜的制備

取蜂蜜適量，先用中火加熱至微沸，再用文火加熱，使溫度達116～118 ℃，至滿鍋起魚眼泡、手捻有黏性、兩指間尚無長白絲出現(xiàn)，即可［9］。

2.2 蜜炙杠板歸的制備

取煉蜜適量，加入至凈杠板歸飲片中拌勻，悶潤適當時間，單層平鋪于不銹鋼托盤上，置于恒溫干燥箱中適當溫度下烘至一定時間，取出，放涼，即得。

2.3 槲皮素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2 C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；流動相為甲醇-0.4%磷酸（50∶50），流速為1.0 ml/min；檢測波長為360 nm；進樣量為10 μl；理論板數(shù)按槲皮素峰計應(yīng)不低于4 000。在上述色譜條件下，取“2.3.2”“2.3.3”項下對照品溶液、供試品溶液和空白溶液進樣分析，結(jié)果表明槲皮素與其他組分分離良好，詳見圖1。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品（120 ℃干燥4 h）適量，用甲醇溶解并定容至5 ml量瓶中。精密吸取上述溶液1.25 ml用甲醇定容至100 ml量瓶中，得12.506 mg/L的對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.3 供試品溶液和空白溶液的制備 取1號正交試驗樣品，粉碎，過三號篩；取約1.0 g，精密稱定，置于250 ml燒瓶中，精密加入70%乙醇80 ml，稱質(zhì)量；置于90 ℃水浴中加熱回流3 h，放冷，再稱質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；減壓回收溶劑，浸膏用甲醇定容至25 ml量瓶中，超聲10 min溶解，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。除不加入樣品外，其余操作同上制備空白溶液。

2.3.4 線性關(guān)系及定量限考察 分別精密量取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml置于5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。進樣測定，以峰面積（y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，得槲皮素回歸方程為y=2.6×106x－4.7×103（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，槲皮素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.25～12.5 μg/ml，定量限為0.125 μg/ml（信噪比為10）。

2.3.5 精密度試驗 精密量取槲皮素對照品溶液10 μl，分別連續(xù)進樣6次，進行測定。結(jié)果顯示，槲皮素峰面積的RSD為0.15%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密量取1號正交試驗供試品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、12、24 h進樣分析。結(jié)果顯示，供試品溶液中槲皮素峰面積的RSD為0.27%（n=6），表明樣品至少在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 取同一炙杠板歸飲片粉末（1號正交試驗樣品）6份，每份1.0 g，精密稱定，測定并計算槲皮素含量，結(jié)果RSD為0.24%（n=6），表明方法重復性好。

2.3.8 回收率試驗 取已知含量的同一炙杠板歸飲片粉末（1號正交試驗樣品）6份，每份0.5 g，精密稱定，各分別精密加入適量槲皮素對照品，混合均勻，依法提取，測定回收率。結(jié)果顯示，槲皮素平均回收率為100.43%（RSD=1.34%，n=6），表明該方法準確度好。

2.4 水溶性浸出物含量測定

按照2015年版《中國藥典》（四部）水溶性浸出物測定法（熱浸法）［10］測定。稱取炙杠板歸粉末約4 g，加水80 ml進行試驗。

2.5 綜合評分標準

以綜合加權(quán)評分法對蜜炙杠板歸飲片質(zhì)量進行評價，有效成分槲皮素含量、水溶性浸出物含量的加權(quán)系數(shù)分別設(shè)為0.7、0.3，槲皮素含量得分=槲皮素含量×70/9個樣品中槲皮素最高含量；水溶性浸出物含量得分=水溶性浸出物含量×30/9個樣品中水溶性浸出物最高含量；綜合評分=槲皮素含量得分+水溶性浸出物含量得分。

2.6 正交設(shè)計優(yōu)化杠板歸蜜炙工藝

在預試驗基礎(chǔ)上，以煉蜜用量（與藥材的質(zhì)量百分比，A）、悶潤時間（B）、烘制溫度（C）、烘制時間（D）為考察因素，稱取凈選后的杠板歸飲片9份，每份100 g，按L9（34）正交試驗設(shè)計加入相應(yīng)量煉蜜，拌勻，置于密閉容器中悶潤不同時間后，單層平鋪于不銹鋼托盤上，轉(zhuǎn)移至烘箱中，分別在規(guī)定烘制溫度下烘制一定時間，取出，晾涼。測定槲皮素及水溶性浸出物含量并計算綜合評分。每次試驗平行做3次（n=3）。因素與水平見表1；正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis results of variance

由極差R可知，4個因素對綜合評分影響順序為C＞D＞A＞B；因素A：k2＞k1＞k3，因素B：k3＞k1＞k2，因素C：k3＞k2＞k1，因素D：k3＞k2＞k1，可得杠板歸最優(yōu)蜜炙工藝為A2B3C3D3。

由方差分析可知，以因素B為誤差項進行方差分析，結(jié)果顯示因素C（烘制溫度）對試驗結(jié)果有顯著性影響，因素A和因素D無顯著性影響。

綜合直觀分析和方差分析結(jié)果確定，恒溫干燥條件下蜜炙杠板歸的最優(yōu)工藝為A2B3C3D3，即加煉蜜30%，再加入凈杠板歸飲片，拌勻、悶潤120 min，置于70 ℃溫度下恒溫烘制50 min，取出，晾涼，即得。

2.7 驗證試驗

取凈杠板歸3份，每份100 g，按優(yōu)化的蜜炙工藝進行驗證試驗，分別測定槲皮素和水溶性浸出物含量。結(jié)果制備的3批炙杠板歸槲皮素含量均大于0.05%，水溶性浸出物含量均大于25%，RSD均小于2.5%，表明本試驗確定的恒溫干燥條件下蜜炙杠板歸的工藝科學、穩(wěn)定、合理、可行，結(jié)果見表4。

3 討論

表4 驗證試驗結(jié)果Tab 4 Results of verification test

傳統(tǒng)蜜炙工藝多為煉蜜拌炒法，但炒制溫度較難控制，溫度過高則易造成飲片出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，溫度過低則易導致飲片含水量過高、容易發(fā)霉、不便貯藏。本試驗采用恒溫干燥條件下的蜜炙工藝，相比傳統(tǒng)法優(yōu)點主要有三點：一是受熱均勻，制得的飲片顏色鮮艷，有光澤，較酥脆，無焦糊現(xiàn)象；二是由于烘制時間較長，既能使飲片充分吸收輔料煉蜜，確保藥物與煉蜜療效協(xié)同增強，同時也能促使水分蒸發(fā)，使炮制飲片含水量適宜，易于貯藏保管；三是操作簡便，溫度易于控制，而且衛(wèi)生清潔，降低了環(huán)境污染，可用于大批量杠板歸飲片的蜜炙加工操作，并能保證成品質(zhì)量。

槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抗病毒等多方面生物活性。最新研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制人肺腺癌NCI-H1395細胞增殖［11］，是杠板歸的主要有效成分?！吨袊幍洹分袑Ω馨鍤w的質(zhì)量控制亦采用槲皮素為指標成分。本試驗采用綜合評分法，綜合了杠板歸的有效成分槲皮素含量和水溶性浸出物含量兩個指標，可以比較客觀、綜合地反映各個因素對炙杠板歸飲片質(zhì)量的影響。

本試驗通過正交設(shè)計，考察了蜂蜜用量、悶潤時間、烘制溫度及烘制時間等因素對蜜炙杠板歸效果的影響，優(yōu)化了恒溫干燥條件下杠板歸的蜜炙工藝，為規(guī)范杠板歸飲片的蜜炙操作與成品質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)，同時對于該中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的批量生產(chǎn)加工亦具有較高的借鑒價值。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：166.

［2］馬青云，黃圣卓，李紅芳，等.杠板歸中化學成分生防活性研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（21）：5 245.

［3］成煥波，劉新橋，陳科力.杠板歸乙酸乙酯部位化學成分研究［J］.中藥材，2012，35（7）：1 088.

［4］邢煜君，王海燕，王俊霞，等.杠板歸抗氧化作用及抑制α-葡萄糖苷酶活性［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：189.

［5］張可鋒，杜正彩，高雅，等.杠板歸抗二甲基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化的作用及其機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（16）：242.

［6］張長城，黃鶴飛，周志勇，等.杠板歸提取物抗單純皰疹病毒-Ⅰ型的藥理作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21 （11）：2 835.

［7］項秀荷.自擬杠百方治療百日咳221例［J］.湖北中醫(yī)雜志，2000，22（1）：36.

［8］羅榮泉.加味葦莖湯治療咳嗽變異型哮喘52例［J］.新中醫(yī)，2007，39（8）：70.

［9］劉波.中藥炮制技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：176.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：202.

［11］李林，王迪進，萬軻，等.槲皮素對人肺腺癌NCI-H1395細胞凋亡的影響［J］.中國藥房，2015，26（34）：4 786.

（編輯：劉 萍）

Optimization of Processing Technology of Honey-fired Polygonum perfoliatum by Orthogonal Test

SHEN Wei1，LU Lifeng2，LI Heyu3（1.Dept.of Scientific Research，Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Shandong Yantai 264199，China；2.Dept.of Traditional Chinese Medicine，Shandong Drug and Food Vocational College，Shandong Weihai 264210，China；3.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

OBJECTIVE：To optimize the processing technology of honey-fried Polygonum perfoliatum.METHODS：The processing method of honey-fried P.perfoliatum was optimized by L（934）orthogonal test with the contents of effective component quercetin and water-soluble extract as comprehensive evaluation index，with the amount of honey，moistening time，baking temperature and baking time as investigating factors.RESULTS：The optimal processing technology was as follows as 30%honey，moistening for 120 min，baking for 50 min at 70 ℃.In verification test，the content of quercetin in 3 batches of honey-fried P.perfoliatum was higher than 0.05%，and the content of water-soluble extract was higher than 25%（RSD＜2.5%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized processing technology is stable and practical，and can provide reference for standardizing the processing technology and quality control of honey-fried P.perfoliatum.

Polygonum perfoliatum；Processing technology of honey-fried；Orthogonal test；Quercetin；Water-soluble extract

R285.2

A

1001-0408（2016）25-3561-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.32

2016-02-23

2016-04-14）

＊講師，碩士。研究方向：中藥化學、中藥炮制學。電話：0535-5136962。E-mail：shenweitcm@163.com