• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    AKT-mTOR信號(hào)通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的意義

    2016-10-26 01:21:16張麗勇
    中國老年學(xué)雜志 2016年15期
    關(guān)鍵詞:苯胺藍(lán)傳代終板

    張麗勇

    (白城醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校生理教研室,吉林 白城 137000)

    ?

    AKT-mTOR信號(hào)通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的意義

    張麗勇

    (白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理教研室,吉林白城137000)

    目的探討AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的表達(dá)情況。方法取清潔級(jí)SD大鼠12只,分離并培養(yǎng)椎間盤軟骨終板細(xì)胞,建立體外自然傳代退變模型。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(自然傳代第2代細(xì)胞),自然退變組(自然傳代第5代細(xì)胞)、AKT-mTOR信號(hào)通路抑制組(含LY294002抑制劑培養(yǎng)基傳代至第5代),AKT-mTOR信號(hào)通路激動(dòng)組(含IGF-1激動(dòng)劑培養(yǎng)基傳代至第5代)。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài);甲苯胺藍(lán)染色檢測細(xì)胞蛋白聚糖變化;RT-PCR檢測細(xì)胞中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9以及AKT-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵基因mTOR的表達(dá)情況;Western印跡檢測AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況。結(jié)果隨著傳代次數(shù)增加,大鼠軟骨終板細(xì)胞的表現(xiàn)逐漸減少。自然退變組Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05),AKT-mTOR信號(hào)通路抑制組表達(dá)水平明顯低于自然退變組(P<0.05);AKT-mTOR信號(hào)通路激動(dòng)組表達(dá)水平明顯高于自然退變組(P<0.05)。四組的AKT蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);抑制組p-AKT蛋白表達(dá)水平低于另外3組,而激動(dòng)組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05)。結(jié)論AKT-mTOR信號(hào)通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中具有重要作用,添加AKT-mTOR信號(hào)通路抑制劑、激動(dòng)劑能夠加速、抑制細(xì)胞體外退變的發(fā)生。

    椎間盤退行性改變;軟骨細(xì)胞;AKT/mTOR

    椎間盤退變是脊柱退行性疾病發(fā)生的起因和病理基礎(chǔ)。軟骨終板是椎間盤主要供養(yǎng)途徑,是維持椎間盤正常形態(tài)和生理功能的關(guān)鍵〔1〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的一種,其所處的信號(hào)通路包括上游的P13K、AKT、PTEN、TSC1/2,以及下游的SK6、4EBP。而信號(hào)通路中P13K、AKT突變可引發(fā)mTOR通路的高度激活〔2〕。相關(guān)研究顯示,mTOR作為P13K相關(guān)激酶之一,在控制細(xì)胞生長周期方面具有重要作用〔3〕。本研究旨在探明AKT-mTOR信號(hào)通路與大鼠軟骨終板細(xì)胞退變的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1動(dòng)物和試劑清潔級(jí)SD大鼠12只,4~5周齡,雌雄各半,體重140~180 g,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。膠原酶、胰蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司);LY294002 AKT信號(hào)通路抑制劑(美國SIGMA公司);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);PCR試劑盒及相關(guān)抗體(北京天根生化科技有限公司);IGF-1 rat recombinant(上海浩然生物技術(shù)有限公司);AKT、p-AKT(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組斷髓處死12只大鼠,75%乙醇溶液中浸泡20 min,無菌操作臺(tái)內(nèi)取完整腰椎,逐個(gè)剝離大鼠腰椎間盤1~5段終板軟骨,胰蛋白酶消化分離軟骨終板細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞單層融合度85%~90%時(shí)開始細(xì)胞傳代,傳至第2代后終止,2×105個(gè)/孔接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,連續(xù)培養(yǎng)2~3 d。其中第2代細(xì)胞為空白對(duì)照組;第2~5代細(xì)胞為自然傳代組;細(xì)胞傳代過程中添加30 μmol/ml的含LY294002 AKT信號(hào)通路抑制劑的細(xì)胞培養(yǎng)液,傳代至第5代為AKT-mTOR信號(hào)通路抑制組;細(xì)胞傳代過程中添加20 ng/ml的含IGF-1 AKT信號(hào)通路激動(dòng)劑的細(xì)胞培養(yǎng)液,傳代至第5代為AKT-mTOR信號(hào)通路激動(dòng)組。

    1.2.2甲苯胺藍(lán)染色各組中細(xì)胞融合約80%時(shí)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色:除去細(xì)胞培養(yǎng)液后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3~4次,4%多聚甲醛固定45 min后除去固定液,用PBS沖3~4次,甲苯胺藍(lán)染色60 min,PBS洗凈后放于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

    1.2.3RT-PCR檢測使用Trizol抽提各組軟骨終板細(xì)胞的RNA,Agilent 2100 bioanalyzer檢測提取RNA的純度,取1 μg總RNA,一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR擴(kuò)增體系為10 μl(SYBRR染料預(yù)混的extaq 酶5 μl,上游引物和下游引物各0.5 μl,cDNA模板4 μl),引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成?;靹蚝蟪R?guī)反應(yīng)條件下置于RT-PCR儀中反應(yīng)。

    1.2.4Western印跡檢測吸除6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,PBS沖3~4次,每孔加入100 μl含PMSF的蛋白裂解液,冰袋上裂解40 min,4℃ 12 000 r/min離心20 min,吸取上清液至無菌EP管中,BCA法測定提取得到的蛋白質(zhì)濃度。每組取蛋白質(zhì)樣品20 μg,行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜120 min。5% BSA封閉60~120 min,加一抗(1∶1 000),4℃過夜,TBST沖洗3次,加二抗(1∶5 000),溫室孵育3 h,TBST沖洗3次。紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并收集數(shù)據(jù),GAPDH為內(nèi)參。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1大鼠軟骨終板表型變化隨著傳代次數(shù)增加,大鼠軟骨終板細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出梭形變化,出現(xiàn)多角形和觸角,第2~5代呈現(xiàn)出纖維化趨勢,見圖A1~A4。大鼠軟骨終板細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色顯示,第2~5代染色逐漸變深、深染,見圖B1~B4??瞻讓?duì)照組、自然退變組和第5代激動(dòng)劑組的軟骨終板細(xì)胞形態(tài)、甲苯胺藍(lán)染色顯示:第5代激動(dòng)劑組細(xì)胞形態(tài)和染色與自然退變組相比恢復(fù)明顯,但未恢復(fù)到空白對(duì)照組形態(tài),見圖2。

    A1~A4為自然傳代第2~5代細(xì)胞形態(tài);B1~B4為自然傳代第2~5代甲苯胺藍(lán)染色圖1 大鼠軟骨終板細(xì)胞形態(tài)和甲苯胺藍(lán)染色(×100)

    圖2 自然傳代第2代、自然傳代第5代、第5代激動(dòng)劑組細(xì)胞形態(tài)和甲苯胺藍(lán)染色(×100)

    2.2大鼠軟骨終板相關(guān)基因RT-PCR檢測自然傳代組中:第2~5代大鼠中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達(dá)明顯降低;抑制組的表達(dá)明顯低于自然傳代組(P<0.05);激動(dòng)劑組表達(dá)明顯高于自然傳代組(P<0.05)。

    2.3大鼠軟骨終板細(xì)胞中AKT及p-AKT表達(dá)變化Western印跡檢測顯示,空白對(duì)照組、自然退變組、AKT-mTOR信號(hào)通路抑制組和激動(dòng)組的AKT蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。抑制組p-AKT蛋白表達(dá)水平低于另外3組,而激動(dòng)組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05),見圖3。

    圖3 Western印跡檢測大鼠軟骨終板細(xì)胞的AKT水平

    3 討 論

    PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,可影響細(xì)胞的增殖、分化PI3K是一種分布于細(xì)胞質(zhì)中的復(fù)合體,作為脂類激酶能夠催化磷脂酰肌醇D3位的酸化,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的整個(gè)周期以及能量轉(zhuǎn)運(yùn)等〔4〕。相關(guān)研究顯示,胰島素樣生長因子、表皮樣生長因子等多種信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體和生長因子均可啟動(dòng)PI3K-AKT信號(hào)通路的激活過程〔5〕。而PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、代謝中發(fā)揮重要作用。人類和鼠類在mTOR結(jié)構(gòu)的氨基酸分子水平上的同源性高達(dá)95%〔6〕,mTOR不僅有控制基因翻譯、參與DNA/RNA合成、影響蛋白質(zhì)降解等生理過程,最新研究還發(fā)現(xiàn)其與哺乳動(dòng)物生理性衰老及腫瘤發(fā)生具有明顯關(guān)聯(lián)〔7〕。mTOR信號(hào)通路不僅是細(xì)胞正常生長周期的調(diào)控中心,還是PI3K-AKT信號(hào)通路控制細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。mTOR位于PI3K-AKT信號(hào)通路的下游,能夠調(diào)控翻譯過程中的啟動(dòng)及延伸、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體代謝相關(guān)蛋白酶的轉(zhuǎn)錄、核糖體合成。

    相關(guān)研究顯示,AKT-mTOR信號(hào)通路與人體一系列退行性病變存在明顯相關(guān)性〔8〕。LY294002是目前常用的AKT-mTOR信號(hào)通路抑制劑,能夠抑制該通路的磷酸化而使其喪失活性,影響下游mTOR信號(hào),進(jìn)而抑制細(xì)胞分化、增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IGF-1是目前常用的AKT-mTOR信號(hào)通路激動(dòng)劑,能夠明顯加快關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化,以及軟骨基質(zhì)合成,能夠有效削弱LY294002對(duì)細(xì)胞的抑制效果。本研究結(jié)果顯示,AKT-mTOR信號(hào)通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞體外自然退變過程中起到重要作用,在軟骨終板細(xì)胞傳代過程中調(diào)控AKT-mTOR信號(hào)通路可有效加速、緩解甚至抑制大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞的生理性退變。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為抑制腰椎間盤生理性退變提供了一個(gè)全新思路和靶點(diǎn),可以此為基礎(chǔ)研發(fā)相關(guān)治療藥物。

    1鐘小明,胡偵明,沈皆亮,等.白藜蘆醇干預(yù)對(duì)已退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(6):1304-7.

    2Wang K,Chen YP,Lei Y,etal.Electrochemical method for monitoring the progress of polymerase chain reactions using Methylene blue as an indicator〔J〕.Mikrochimica Acta,2013;180(9/10):871-8.

    3Urquiza MP,Acatzi Silva AI.Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains〔J〕.Metrologia,2014;51(1):61-6.

    4徐宏光,彭紅心,程加峰,等.人頸椎椎體終板軟骨細(xì)胞退變模型的建立及其意義〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2011;91(41):2912-6.

    5Wang C,Zhou H,Zhu W,etal.Ultrasensitive electrochemical DNA detection based on dual amplification of circular strand-displacement polymerase reaction and hybridization chain reaction〔J〕.Biosensors Bioelectronics,2013;47:324-8.

    6Deng M,Wang Y,Li J,etal.N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis〔J〕.Anal Chim Acta,2014;827:47-53.

    7鐘小明.白藜蘆醇通過SIRT1/IGF-1R/AKT通路促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)〔D〕.重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2012.

    8王飛.腰椎間盤退變中軟骨終板細(xì)胞的凋亡及CTGF對(duì)其保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2010.

    〔2016-02-15修回〕

    (編輯滕欣航)

    吉林省教育廳“十二五”項(xiàng)目(20140129)

    張麗勇(1974-),女,碩士,副教授,主要從事臨床生理學(xué)研究。

    R68

    A

    1005-9202(2016)15-3651-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.018

    猜你喜歡
    苯胺藍(lán)傳代終板
    肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)飽和碳酸鋰染色法
    嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對(duì)其益生特性及貨架期菌數(shù)的影響
    塞尼卡病毒A在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)條件探索
    硫酸-甲苯胺藍(lán)-麗春紅苦味酸染色法在顯示組織肥大細(xì)胞中的應(yīng)用
    椎體終板參與腰椎間盤退變機(jī)制及臨床意義的研究進(jìn)展
    下腰痛患者終板Modic改變?cè)谘瞪系姆植继攸c(diǎn)
    《大鼠及小鼠原代肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)》圖版
    微生物實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析
    以甲苯胺藍(lán)為電化學(xué)探針的核酸適配體傳感器用于腺苷的檢測
    TNF-α和PGP9.5在椎體后緣離斷癥軟骨終板的表達(dá)及意義
    久久6这里有精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 少妇人妻久久综合中文| 久久久欧美国产精品| 亚州av有码| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品一区二区性色av| 日日啪夜夜撸| 男女啪啪激烈高潮av片| 一区二区三区精品91| 久久久午夜欧美精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| av网站免费在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 乱人伦中国视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩一区二区三区影片| 亚洲成人手机| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品久久久噜噜| 乱人伦中国视频| 丝袜脚勾引网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 我的老师免费观看完整版| 亚洲人成网站在线观看播放| 伊人久久国产一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩大片免费观看网站| 午夜福利,免费看| 春色校园在线视频观看| 黑人猛操日本美女一级片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热国产这里只有精品6| 蜜桃在线观看..| 香蕉精品网在线| 女性被躁到高潮视频| 亚洲色图综合在线观看| 各种免费的搞黄视频| 99精国产麻豆久久婷婷| av线在线观看网站| 国产精品一区www在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 成人美女网站在线观看视频| 99九九在线精品视频 | 少妇熟女欧美另类| 好男人视频免费观看在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品视频女| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美清纯卡通| 一区二区三区四区激情视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利在线观看免费完整高清在| a级片在线免费高清观看视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 人妻少妇偷人精品九色| 一级毛片我不卡| av国产精品久久久久影院| 日韩大片免费观看网站| 亚洲av男天堂| 日韩制服骚丝袜av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产色片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99热网站在线观看| 国产精品成人在线| 中文欧美无线码| 人妻 亚洲 视频| 精品一区二区三卡| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产69精品久久久久777片| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲高清免费不卡视频| 久久6这里有精品| videossex国产| av在线观看视频网站免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| h视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av天美| 高清毛片免费看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| videos熟女内射| 在现免费观看毛片| 国产精品久久久久久av不卡| 久久青草综合色| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久国内精品自在自线图片| 精品一区在线观看国产| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产永久视频网站| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本色播在线视频| av天堂中文字幕网| 永久免费av网站大全| 少妇精品久久久久久久| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人国产av品久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 深夜a级毛片| 日本与韩国留学比较| 精华霜和精华液先用哪个| av免费在线看不卡| 久久久久久久久大av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 色哟哟·www| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久久伊人网av| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本黄色片子视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品一区二区三区视频在线| 嘟嘟电影网在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产在线免费精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜福利,免费看| av天堂中文字幕网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产极品天堂在线| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久狼人影院| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久精品夜色国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 高清不卡的av网站| 偷拍熟女少妇极品色| 丰满乱子伦码专区| 亚洲内射少妇av| 成人国产av品久久久| 久久6这里有精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 22中文网久久字幕| 日本免费在线观看一区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久久久久久电影| 欧美xxⅹ黑人| 日本与韩国留学比较| 国产精品.久久久| 久久99一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美精品专区久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av福利片在线| 美女大奶头黄色视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲中文av在线| 99视频精品全部免费 在线| 人体艺术视频欧美日本| 成人毛片60女人毛片免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品自拍成人| 日本wwww免费看| 国产极品天堂在线| 亚洲欧美精品专区久久| 国产av码专区亚洲av| 插逼视频在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩制服骚丝袜av| 久久久国产一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黑人高潮一二区| 中国三级夫妇交换| 我要看日韩黄色一级片| 日韩免费高清中文字幕av| 少妇熟女欧美另类| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 成人影院久久| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 七月丁香在线播放| 欧美性感艳星| 精品久久国产蜜桃| 最黄视频免费看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线观看www视频免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产69精品久久久久777片| 亚洲国产成人一精品久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩精品有码人妻一区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 永久免费av网站大全| 在线观看免费日韩欧美大片 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 精华霜和精华液先用哪个| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美国产精品一级二级三级 | 超碰97精品在线观看| 两个人免费观看高清视频 | 亚洲自偷自拍三级| 男男h啪啪无遮挡| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 蜜桃在线观看..| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品一区二区在线观看99| 精品久久久噜噜| 在线免费观看不下载黄p国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩av久久| 男男h啪啪无遮挡| 成年av动漫网址| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 18禁动态无遮挡网站| 高清在线视频一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 国产av一区二区精品久久| 伦理电影大哥的女人| 日韩av不卡免费在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 国产在线免费精品| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成人精品福利久久| 人人妻人人看人人澡| 伦理电影大哥的女人| 亚洲第一区二区三区不卡| 看非洲黑人一级黄片| 午夜av观看不卡| 亚洲真实伦在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 丰满乱子伦码专区| 久久99热这里只频精品6学生| 久久午夜综合久久蜜桃| 多毛熟女@视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 午夜激情久久久久久久| 精品国产国语对白av| 一本久久精品| 国产精品女同一区二区软件| 国产综合精华液| 麻豆成人午夜福利视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产深夜福利视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产精品99久久久久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品国产av成人精品| 桃花免费在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产成人精品久久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产男女内射视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黑人高潮一二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 啦啦啦啦在线视频资源| 精品人妻熟女av久视频| 熟女人妻精品中文字幕| a 毛片基地| videossex国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 成人黄色视频免费在线看| 日韩伦理黄色片| 精品久久久久久久久亚洲| 777米奇影视久久| 午夜福利影视在线免费观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久99热6这里只有精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产乱来视频区| 亚洲av在线观看美女高潮| 啦啦啦啦在线视频资源| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一级毛片我不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 97在线人人人人妻| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产伦在线观看视频一区| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲美女视频黄频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲美女黄色视频免费看| 男女免费视频国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 97超碰精品成人国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 97超视频在线观看视频| 人人澡人人妻人| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国国产精品蜜臀av免费| 国产高清有码在线观看视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美日本中文国产一区发布| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费观看a级毛片全部| 少妇人妻 视频| 在线观看三级黄色| 成人国产av品久久久| 日韩人妻高清精品专区| 国产黄频视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲图色成人| 丝袜喷水一区| 少妇高潮的动态图| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品456在线播放app| 乱人伦中国视频| 国产精品人妻久久久久久| 色网站视频免费| 日韩伦理黄色片| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久欧美国产精品| 欧美三级亚洲精品| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 男男h啪啪无遮挡| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲第一av免费看| 免费少妇av软件| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产亚洲最大av| 欧美性感艳星| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 狠狠精品人妻久久久久久综合| www.av在线官网国产| 亚洲精品自拍成人| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品一区www在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲电影在线观看av| 国产成人精品婷婷| 我要看日韩黄色一级片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费看av在线观看网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 777米奇影视久久| 成人特级av手机在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 丝袜脚勾引网站| 久久久a久久爽久久v久久| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产亚洲网站| 两个人免费观看高清视频 | 日韩成人伦理影院| 亚洲国产精品999| 美女主播在线视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 91久久精品国产一区二区成人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久av网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久久久久伊人网av| 能在线免费看毛片的网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产av码专区亚洲av| 国产精品国产三级专区第一集| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 曰老女人黄片| 国产色婷婷99| 亚洲真实伦在线观看| av天堂久久9| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人一区二区在线| 男女边摸边吃奶| 久久人人爽人人爽人人片va| 性色avwww在线观看| a级毛色黄片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产永久视频网站| 精品午夜福利在线看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产综合精华液| 久久 成人 亚洲| 中文在线观看免费www的网站| 在线天堂最新版资源| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久国产欧美日韩av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 精品国产乱码久久久久久小说| 色婷婷av一区二区三区视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人免费无遮挡视频| 在线 av 中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 99视频精品全部免费 在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 观看美女的网站| 国产视频内射| 亚洲无线观看免费| 欧美日韩在线观看h| 99久久综合免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产美女午夜福利| 大香蕉久久网| 精品久久国产蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影| 99热全是精品| 边亲边吃奶的免费视频| 免费av中文字幕在线| 老熟女久久久| 国产av码专区亚洲av| 色视频在线一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 妹子高潮喷水视频| 丝瓜视频免费看黄片| av.在线天堂| 最近中文字幕高清免费大全6| 99热这里只有精品一区| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 嫩草影院入口| 亚洲国产色片| 亚洲无线观看免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 成人无遮挡网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 观看av在线不卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日本91视频免费播放| 国产精品一区二区性色av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久热久热在线精品观看| 99精国产麻豆久久婷婷| av一本久久久久| 99久国产av精品国产电影| 成人美女网站在线观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 日日爽夜夜爽网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲怡红院男人天堂| 老司机影院成人| 少妇高潮的动态图| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 婷婷色av中文字幕| 国产精品.久久久| 日本vs欧美在线观看视频 | 在线观看免费高清a一片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 青春草国产在线视频| 熟女av电影| 亚洲精品乱久久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产黄频视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 国精品久久久久久国模美| 精品人妻熟女av久视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 下体分泌物呈黄色| 在线播放无遮挡| 国产亚洲91精品色在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 丝袜在线中文字幕| av福利片在线观看| 高清av免费在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| av福利片在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久国产电影| 亚洲av国产av综合av卡| 成人漫画全彩无遮挡| 中文字幕免费在线视频6| 高清午夜精品一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 正在播放国产对白刺激| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美精品一区二区大全| 91九色精品人成在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲综合色网址| av不卡在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 91老司机精品| 中文字幕制服av| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲成人手机| 国产精品久久久人人做人人爽| 99香蕉大伊视频| a级毛片黄视频| 欧美在线黄色| 久久性视频一级片| 美女中出高潮动态图| 国产黄色免费在线视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲中文av在线| 日本av手机在线免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 麻豆av在线久日| av一本久久久久| 成年av动漫网址| 国产精品.久久久| 午夜久久久在线观看| 午夜影院在线不卡| 男人操女人黄网站| 午夜福利影视在线免费观看| h视频一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 一区二区三区激情视频| 大香蕉久久成人网| 女警被强在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 在线观看人妻少妇| 精品熟女少妇八av免费久了| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| av线在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 美国免费a级毛片| 宅男免费午夜| 免费在线观看黄色视频的| 啦啦啦啦在线视频资源| 90打野战视频偷拍视频| 国产av精品麻豆| 国产99久久九九免费精品| videos熟女内射| 日本wwww免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲性夜色夜夜综合| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 少妇 在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 大片免费播放器 马上看| 午夜免费观看性视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久人人97超碰香蕉20202| av福利片在线| 亚洲熟女毛片儿| 香蕉国产在线看| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 中国美女看黄片| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产色视频综合| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲九九香蕉| 黄色怎么调成土黄色| 欧美av亚洲av综合av国产av| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产亚洲精品一区二区www | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 人妻久久中文字幕网| 18禁观看日本| 性少妇av在线| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美激情在线| 满18在线观看网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产三级黄色录像| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 欧美日韩视频精品一区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美在线一区亚洲| 日日爽夜夜爽网站| 国产免费现黄频在线看| 9色porny在线观看| 大香蕉久久网| 9色porny在线观看| 国产在线视频一区二区| 精品一区在线观看国产|