γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

汪祥燕，徐海燕，辛國(guó)芹，汪孟娟，董佩佩，趙影，谷巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

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添加劑

γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

汪祥燕*，徐海燕，辛國(guó)芹，汪孟娟，董佩佩，趙影，谷巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有許多重要的生理功能。利用酸菜、酸奶等食品進(jìn)行乳酸菌的分離，通過(guò)紙層析法篩選得到1株產(chǎn)GABA量較高的菌株Y-3，經(jīng)16SrDNA鑒定該菌株為短乳桿菌。單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的菌株Y-3最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%，初始pH為6.0，接種量6%，37℃靜置培養(yǎng)48 h，GABA產(chǎn)量達(dá)12 g/L以上，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了近5倍。

γ-氨基丁酸；分離；短乳桿菌；發(fā)酵

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白氨基酸，屬?gòu)?qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的作用（Li等，2010）。應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中能有效地提高動(dòng)物抗應(yīng)激能力和抗缺氧能力，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)（譚良溪等，2012；吳俊鋒和李呂木，2011）。通過(guò)減少動(dòng)物的無(wú)意識(shí)運(yùn)動(dòng)以減少能量消耗，達(dá)到促生長(zhǎng)的目的（吳凡和譚青松，2015；徐秋良等，2009）。GABA廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中，合成制備方法主要有化學(xué)合成、植物富集和微生物發(fā)酵3種（Dhakal等，2012）。目前GABA的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法，而安全性高的乳酸菌可以利用體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶，將L-谷氨酸鈉經(jīng)α-脫羧后產(chǎn)生GABA，開發(fā)前景廣闊。陸小雪等（2009）從泡菜和酸奶中分離出3株產(chǎn)GABA的乳酸菌，分別為乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種，其發(fā)酵液中GABA含量分別達(dá)到3.680、3.341、2.700 g/L。蔣冬花等（2007）分離出相對(duì)高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌，在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵液中GABA含量可達(dá)4 g/L。本試驗(yàn)從泡菜、酸奶等食品中分離高產(chǎn)GABA菌株，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，為微生物發(fā)酵富集GABA的研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料泡菜、酸菜及各品牌的酸奶（伊利、蒙牛、亞奧特）等。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1分離培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、吐溫-80 1 g/L、K2HPO42 g/L、醋酸鈉5 g/L、檸檬酸二胺2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、pH 6.5～6.8，37℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2種子培養(yǎng)基K2HPO42 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，無(wú)水乙酸鈉5 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L。

1.2.3TYG發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，丁二酸鈉5 g/L，L-谷氨酸鈉10 g/L，pH 6.6～6.8。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌的分離分別取泡菜汁、酸菜汁及伊利、蒙牛、亞奧特酸奶各1 mL，接種于50 mL分離培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d，取富集培養(yǎng)液各1 mL，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度，將所有樣品稀釋液各取0.3 mL，倒入已滅菌的平皿中，然后倒入冷卻至50℃左右的分離培養(yǎng)基混勻，凝固后置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，挑取帶有溶鈣圈的菌落，接種于MRS斜面培養(yǎng)基。

1.3.2乳酸菌的篩選將初篩得到的菌株轉(zhuǎn)接于液體MRS種子培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12～15 h，然后以2%的接種量接入到含1%L-谷氨酸鈉的TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液離心后進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.3分析方法

1.3.3.1γ-氨基丁酸含量的測(cè)定GABA含量的測(cè)定采用紙層析-比色法。（1）展開：采用新華3號(hào)濾紙，每個(gè)樣品點(diǎn)樣4 μL，在室溫下用不飽和法展開，展開劑用（苯酚∶水=4∶1）上行法展開；（2）定量：配制0.5%的GABA標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)樣4 μL；菌株發(fā)酵液經(jīng)離心后，取上清液點(diǎn)樣4 μL，放入層析缸中展開；（3）顯色：展開結(jié)束后自然晾干，用0.5%的茚三酮無(wú)水乙醇溶液噴淋，在65℃顯色30 min；（4）比色測(cè)定：剪下GABA顯色條帶，用5 mL硫酸銅乙醇溶液（0.1%硫酸銅溶液∶75%乙醇=2∶38）浸泡30 min，然后測(cè)定520 nm波長(zhǎng)下的吸光值（A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A值和樣品的A值即可計(jì)算出樣品的GABA含量。

1.3.3.2菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，在一定時(shí)間取培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（OD600）。

1.3.3.3pH的測(cè)定采用PHS-3C型精密pH計(jì)測(cè)定。

1.3.4發(fā)酵條件優(yōu)化采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.3.5菌株的鑒定

1.3.5.116SrDNA擴(kuò)增與序列分析目的菌株接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：1492r 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'27f 5'-AGAGTTG ATCCTGGCTCAG-3'；PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：Mixture 25 μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.5.2系統(tǒng)發(fā)育分析登錄GenBank（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov），利用Blast對(duì)菌株16SrDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行檢索，并下載相關(guān)屬種的16SrDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA5.2等軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選樣品經(jīng)處理后，利用乳酸菌選擇培養(yǎng)基從各分離源中共分離純化出113株乳酸菌，并編號(hào)保存。采用紙層析-比色法初篩，得到8株能夠利用L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化生成γ-氨基丁酸的菌株。

由表1可知，不同菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力有一定差別，僅2株菌的GABA產(chǎn)量高于1 g/L，其中Y-3在未經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化的條件下，可產(chǎn)生GABA 2.21 g/L。將Y-3菌株傳接10代，分別測(cè)定Y-3菌株1～10代發(fā)酵后GABA產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)其GABA產(chǎn)量穩(wěn)定，為（2.36±0.22）g/L，后續(xù)對(duì)菌株Y-3進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

表1　菌株篩選結(jié)果

2.2菌株Y-3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1接種量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響由圖1看出，接種量對(duì)Y-3菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA有較大的影響。接種量為2%～4%時(shí)，GABA產(chǎn)量在2.20 g/L左右；接種量增大至6%后，GABA產(chǎn)量明顯提高，達(dá)4.46 g/L，提高2倍；接種量大于6%后，GABA產(chǎn)量降低，反而不利于菌株生產(chǎn)GA-BA。所以，菌株Y-3最優(yōu)接種量確定為6%。

圖1　接種量對(duì)Y-3菌株GABA產(chǎn)量的影響

2.2.2pH對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0和自然pH（6.70左右），研究發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH增大，Y-3菌株的菌體量和發(fā)酵液pH逐漸增大。發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為4.0時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度僅有1.084；而在起始pH為6.0時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度為2.109，兩者相比，菌體密度增大了1倍。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH升高，GABA產(chǎn)量為先升高后降低，在pH=6.0時(shí)達(dá)最大，為3.10 g/L。在pH=6.0時(shí)菌體密度也較大，菌體量大代表有更多菌體參與GABA生產(chǎn)，因而GABA產(chǎn)量才會(huì)提高。雖然自然pH時(shí)（6.70左右）菌體生長(zhǎng)量大于pH為6.0時(shí)，但是此時(shí)的發(fā)酵液pH較低，降低了谷氨酸脫羧酶的活性，GABA產(chǎn)量反而沒有pH=6.0時(shí)高。綜合分析，發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH確定為6.0。

圖2　發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響

2.2.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響發(fā)酵時(shí)間對(duì)于菌株Y-3和PS-9生產(chǎn)GABA有很大的影響，結(jié)果見圖3。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌株Y-3的菌體密度逐漸增大，24 h達(dá)到最大，為2.109，之后處于基本穩(wěn)定狀態(tài)。發(fā)酵液pH在 24 h時(shí)最低，僅為2.94，然后升高，之后處于基本穩(wěn)定。分析原因可能是：24 h前菌株增殖速度快，處于菌體積累階段，菌株會(huì)迅速消耗葡萄糖，將其分解為小分子酸，使得發(fā)酵液pH降低，之后菌株Y-3會(huì)利用H+，在谷氨酸脫羧酶作用下將L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為GABA，又提高了發(fā)酵液的pH。且在一定范圍內(nèi)，GABA產(chǎn)量是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大的，在48 h時(shí)達(dá)到最大，為3.57 g/L。此后，GABA產(chǎn)量有下降但不明顯。從培養(yǎng)周期和成本等工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)因素考慮，培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，確定菌株Y-3最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響

2.3菌株Y-3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1碳源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及丁二酸鈉為唯一碳源，添加量為10 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后檢測(cè)發(fā)酵液的GABA含量，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，對(duì)于菌株Y-3，葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源最為適合，麥芽糖、可溶性淀粉和丁二酸鈉次之，蔗糖最差。葡萄糖作為可快速利用的碳源為菌株Y-3的生長(zhǎng)和GABA生產(chǎn)提供能量來(lái)源，故以其作碳源，無(wú)論是菌株生長(zhǎng)，還是GABA產(chǎn)量都優(yōu)于其他碳源。

圖4　碳源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

2.3.2氮源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選取胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨及硝酸鈉為唯一氮源，添加量為10 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)48 h檢測(cè)發(fā)酵液的GABA含量。由圖5可知，對(duì)于菌株Y-3，有機(jī)氮效果比無(wú)機(jī)氮效果好。硫酸銨、硝酸鈉兩種無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵效果最差，紙層析圖上基本看不出條帶。酵母膏作為單一氮源發(fā)酵效果最好，GABA最高為5.95 g/L，其次是牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨，玉米漿的效果較差。酵母膏中含有多種成分，相對(duì)于其他氮源，酵母膏的營(yíng)養(yǎng)成分可能更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)，且其可能含有刺激谷氨酸脫羧酶活性的因子，因此GABA產(chǎn)量較高。

圖5　氮源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

進(jìn)一步，以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在以酵母膏作氮源的基礎(chǔ)上分別復(fù)合蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨為復(fù)合氮源，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，以紙層析-比色法測(cè)定上清中GABA含量。由圖6可知，對(duì)于菌株Y-3，以酵母膏和胰蛋白胨復(fù)合時(shí)發(fā)酵效果最好，GABA的產(chǎn)量達(dá)6.26 g/L，比酵母膏作唯一氮源時(shí)產(chǎn)量提高5%。所以，菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA試驗(yàn)選擇酵母膏復(fù)合胰蛋白胨作氮源。

圖6　復(fù)合氮源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

2.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，酵母膏和胰蛋白胨為復(fù)合氮源，添加L-谷氨酸鈉，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

由表2可知，葡萄糖添加量對(duì)于GABA的產(chǎn)量影響最大。各成分對(duì)GABA產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋浩咸烟牵疽鹊鞍纂耍窘湍父啵綥-谷氨酸鈉，極差分析的最優(yōu)組合為A3B2C3D1。試驗(yàn)中最優(yōu)組合為A3B1C3D2，GABA產(chǎn)量為12.67 g/L。由于最佳的培養(yǎng)基組成在試驗(yàn)中沒有進(jìn)行，所以根據(jù)正交試驗(yàn)給出的最佳培養(yǎng)基成分進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)量與7號(hào)試驗(yàn)相比沒有明顯提高?？紤]成本等因素，確定菌株Y-3發(fā)酵配方為：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%，pH 6.0。

2.4發(fā)酵液處理及凍干粉γ-氨基丁酸含量測(cè)定按照優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵培養(yǎng)菌株Y-3，在發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液凍干處理，計(jì)算100 mL發(fā)酵液的凍干粉比例，并以紙層析-比色法測(cè)定凍干粉中GABA的含量。結(jié)果顯示，100 mL發(fā)酵液凍干后可得到3.72 g凍干粉，凍干粉中GABA含量為4.6%左右。

2.5菌株Y-3的鑒定

2.5.1菌落及菌體形態(tài)該菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，其菌落形態(tài)扁平，白色不透明，邊緣光滑，表面濕潤(rùn)，顯微鏡下觀察菌體為短桿狀，大多成對(duì)出現(xiàn)，革蘭氏染色陽(yáng)性。

2.5.216SrDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析該菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖見圖7，條帶在1000～2000 bp處，約為1500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖7　菌株Y-3擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

將菌株Y-3的16SrDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株Y-3與Lactobacillus brevis的序列同源性達(dá)到100%。鑒定該菌株屬于短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

從Genebank中調(diào)取并下載與菌株Y-3同源性較高的該屬內(nèi)其他相關(guān)菌株的16S rDNA，利用MEGA5.2軟件的Neighboring-joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。

圖8　菌株Y-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

3　小結(jié)

從泡菜、酸菜及不同品牌酸奶等分離源中分離純化得到113株乳酸菌，并以TYG培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵，篩選到8株能產(chǎn)GABA的菌株。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定菌株Y-3最佳培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件為：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%，初始pH為6.0，接種量6%，37℃靜置培養(yǎng)48 h，此時(shí)發(fā)酵液中GABA含量達(dá)12 g/L以上，比優(yōu)化前產(chǎn)量增加了近5倍。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行凍干處理，Y-3菌株100 mL發(fā)酵液凍干后可得4 g左右凍干粉，凍干粉中GABA含量為4.6%左右。通過(guò)16S rDNA鑒定，菌株Y-3為一株短乳桿菌。

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γ-amino butyric acid（GABA）as a putative inhibitory in the vertebrate nervous system，has many important physiological functions.Using filter paper chromatography method，a lacto-bacteria Y-3 highly yielding GABA was isolated from different foods such as pickled vegetable and yoghourt.Y-3 was identified as Lactobacillus brevis by its cultural characteristics，morphological characteristics and 16S rDNA sequence.The optimal fermentation medium composition by single factor and orthogonal test showed as follows：glucose 1.5%，yeast extract 0.5%，tryptone 1.5%，L-sodium glutamate 1.0%，sodium succinate 0.5%.The better fermentation conditions were as follows：initial pH 6.0，inoculation amount 6%，temperature 37℃，fermentation 48 h.Using this optimization conditions，the GABA yield was over 12 g/L，which increased nearly 5 times than that before optimization.

γ-amino butyric acid；isolation；Lactobacillus brevis；fermentation

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0027-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160407