QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定飼料中5種磺胺類藥物

徐堅，顧艷紅

（仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江臺州317300）

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檢測分析

QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定飼料中5種磺胺類藥物

徐堅，顧艷紅

（仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江臺州317300）

本實驗建立了QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定飼料中5種磺胺類藥物的方法。飼料樣品中5種磺胺類藥物經(jīng)乙腈提取，用PSA、C18和無水硫酸鈉分散固相萃取方法凈化，氮氣吹干復(fù)溶后，用高效液相色譜-紫外檢測器測定。在10～500 μg/L的線性范圍內(nèi)，5種磺胺類藥物線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.9990；檢測限和定量限分別為0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。在0.1～10 mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，豬、雞配合飼料中磺胺類藥物平均回收率為76.0%～101%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%～10.1%。該方法條件易于控制，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于飼料中5種磺胺類藥物的測定。

磺胺類藥物；飼料；QuEChERS；高效液相色譜法

磺胺類藥物（SA2）是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的藥物總稱，是常用的廣譜抗菌藥，因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價格低廉等特點，在動物養(yǎng)殖中被廣泛使用，其中一個重要的給藥途徑就是通過添加到飼料中使用。經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動物源性食品，可引起磺胺類藥物在人體內(nèi)的逐漸累積，其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等（李俊鎖等，2002）。為了從源頭控制動物性產(chǎn)品中磺胺類藥物的殘留，有必要對飼料中磺胺類藥物的檢測方法進行深入研究。目前，飼料及動物源性產(chǎn)品中磺胺類藥物的檢測方法多采用液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，而前處理以固相萃取法為主，過程較為繁瑣，檢測成本高（丑亞琴等，2013；朱莉萍等，2011；劉佳佳等，2011）。近年來，QuEChERS檢測技術(shù)以其快速、簡易、廉價、有效、穩(wěn)定、安全等特點在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、霉菌毒素檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但在飼料中磺胺類藥物的檢測方面鮮見文獻報道。本實驗采用QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定了飼料中5種磺胺類藥物的含量，與傳統(tǒng)固相萃取方法相比，大大節(jié)省了檢測成本，簡化了操作步驟，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent 1260高效液相色譜儀，配UV檢測器；XS-205電子天平（Mettler公司）；SL502 N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；3k30型冷凍離心機（Sigma公司）；BüCHI B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；20通道固相萃取裝置（Waters公司）；MS2 minishaker渦旋混勻器（IKA公司）。C18、PSA、GCB均為QuEChERS專用材料，美國Agilent公司；乙腈、甲醇、乙酸為色譜純，Merck公司；實驗用水為milli-Q超純水；磷酸、正丙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉等為分析純?；前范谆奏ぃ⊿M2）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺喹惡啉（SQ）和磺胺甲惡唑（SMZ）標(biāo)準(zhǔn)品，均購自SIGMA公司，含量均不少于99%。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制（500 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑50.0 mg（精確至0.01 mg），置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，于4℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 μg/mL）：分別精密量取5種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即濃度為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃避光保存。

1.2樣品前處理稱?。?±0.05）g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋振蕩1 min；加入25 mL乙腈，渦旋振蕩1 min；加入5 g無水硫酸鈉和2 g氯化鈉，中速振蕩提取10 min；于8000 r/min離心5 min，放置30 min；取上層乙腈提取液10 mL，置15 mL離心管中，加入C18150 mg、PSA 100 mg和無水硫酸鈉900 mg，渦旋1 min，于8000 r/min離心5 min，傾出上清液至另一15 mL離心管中，40℃下氮氣吹干；準(zhǔn)確加入1.0 mL流動相，渦旋混勻1 min溶解殘余物，過膜后上機測定。

1.3分析條件色譜柱：Waters symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-甲醇-2%乙酸溶液為（2∶2∶9，V/V/V），流速：1 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：50 μL。

1.4測定方法取適量相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和試樣溶液注入液相色譜儀，作單點或多點校準(zhǔn)，以色譜峰面積進行定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣中磺胺類藥物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)，試樣液測定過程中要參插注入標(biāo)準(zhǔn)工作液，以便準(zhǔn)確定量。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率取1.1中混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加流動相分別稀釋制成10、20、50、100、200、500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按設(shè)定的色譜條件進行儀器分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，各種化合物的質(zhì)量濃度為10～500 μg/L時線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。

2.2檢測限和定量限以豬、雞配合飼料樣品為基質(zhì)，分別添加濃度為0.02、0.05、0.1、0.2 mg/kg的磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，考察方法的檢測限和定量限。經(jīng)回收率實驗，當(dāng)飼料中添加磺胺類藥物為0.05 mg/kg時，信噪比（S/N）均大于3；當(dāng)飼料中添加磺胺類藥物為0.1 mg/kg時，信噪比（S/N）均大于10。因此，本方法的檢測限為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。考慮到磺胺類藥物是允許使用的獸藥，以上結(jié)果完全能滿足實際樣品檢測的需要。

2.3準(zhǔn)確度和精密度取豬、雞配合飼料樣品進行加標(biāo)回收率實驗，系統(tǒng)考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。分別進行0.1、0.2、10 mg/kg添加濃度的回收率實驗，每批次同一濃度做5個平行，每個濃度重復(fù)3次，分別計算批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率實驗結(jié)果見表1。

表1　不同飼料中5種磺胺類藥物的添加回收率和精密度

從回收率結(jié)果可以看出，豬、雞配合飼料樣品為0.1～10 mg/kg添加濃度時，平均回收率為76.0%～101%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%～10.1%，可見本方法能滿足豬、雞配合飼料中磺胺類藥物測定的需要。圖1為添加濃度為0.2 mg/kg時，磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液、豬空白飼料溶液和豬陽性添加飼料溶液的高效液相色譜圖。

2.4實際樣品檢測采用建立的檢測方法對市場隨機抽檢的124份豬、雞配合飼料樣品進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一份磺胺二甲嘧啶陽性樣品，其濃度為（8.32±0.58）mg/kg（n=3）。同時采用GB/T 19542-2007對該樣品進行了檢測，測定結(jié)果為（8.57±0.66）mg/kg（n=3），兩種檢測方法結(jié)果一致。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）、豬空白飼料樣品溶液（B）和豬陽性添加飼料樣品溶液（C）高效液相色譜圖

3　討論

3.1檢測條件的優(yōu)化與選擇

3.1.1檢測條件的確定目前，國內(nèi)外文獻報道液相色譜法測定磺胺類藥物的方法中，檢測器包括紫外檢測器和熒光檢測器兩種。采用熒光檢測器進行檢測雖然靈敏度較高，但是需要進行衍生化處理，操作步驟繁瑣。磺胺類藥物作為允許使用的獸藥，為了滿足臨床使用的需要，其添加濃度往往比較高，紫外檢測器在獸藥和飼料含量測定方面更為常用，波長通常為270 nm。本實驗采用紫外檢測器進行檢測，確定在270 nm波長的條件下進行檢測。

3.1.2液相色譜分離條件的確定由于磺胺類藥物含有氨基和苯磺酰胺結(jié)構(gòu)，屬于中等極性化合物，可采用傳統(tǒng)C18柱作為分析柱進行分離，同時考慮在流動相中添加酸來改變色譜行為。本研究對Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）柱、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）柱、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等三種規(guī)格的色譜柱進行了比較，結(jié)果表明分離結(jié)果均較為滿意。在流動相選擇上，比較了磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇和乙腈-甲醇-乙酸溶液體系的色譜保留性能和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-甲醇-乙酸溶液流動相體系磺胺類藥物峰型最好、靈敏度最高，且大大縮短了分離時間。通過進一步優(yōu)化乙酸溶液濃度和流動相配比，使磺胺類藥物獲得最佳峰型和保留時間，最終確定流動相為乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（2∶2∶9，V/V/V），流速為1.0 mL/min。

3.2樣品前處理方法的優(yōu)化磺胺類藥物在甲醇、乙腈中具有較好的溶解性，同時考慮到飼料中蛋白質(zhì)、脂肪含量高、樣品基質(zhì)復(fù)雜等特點，本實驗采用乙腈作為提取劑，蛋白沉淀效果較為理想，提取時加入硫酸鈉和氯化鈉，在鹽析作用下達(dá)到更好的除去雜質(zhì)的效果。提取完成后，結(jié)合QuEChERS方法對提取液進行了凈化。通過加標(biāo)回收實驗發(fā)現(xiàn)，石墨化炭黑（GCB）對磺胺類藥物吸附能力很強，凈化后回收率都偏低，而乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18和Na2SO4不僅對雜質(zhì)有一定的吸附能力，而且對磺胺類藥物的回收率影響小，優(yōu)化使用量后達(dá)到了較好的效果。

3.3干擾實驗考察在本研究色譜條件下，其他類似藥物對磺胺類藥物分析方法的干擾。以目前養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用獸藥，如諾氟沙星、恩拉霉素、替米考星、阿莫西林為代表，進行干擾實驗，采用磺胺類藥物色譜條件進行檢測，結(jié)果在該色譜條件下以上化合物均未出現(xiàn)色譜峰。

4　結(jié)論

本實驗建立了QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定飼料中5種磺胺類藥物含量的分析方法。該方法采用QuEChERS技術(shù)對樣品前處理條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，建立了快速、簡易、廉價、有效、穩(wěn)定、安全的前處理技術(shù)，并系統(tǒng)考察了液相色譜檢測條件，大大提升了檢測效率。在本實驗的色譜條件下，被測藥物與雜質(zhì)得到了較好的分離，出峰時間合適。實驗結(jié)果表明，該方法條件易于控制，結(jié)果準(zhǔn)確、加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠滿足日常檢測的要求，適用于飼料中磺胺類藥物的測定。

［1］丑亞琴，唐巍，盧艷芬，等.高效液相色譜法同時測定水產(chǎn)品中四種磺胺類藥物殘留前處理條件的優(yōu)化［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2013，1：25～31.

［2］李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析［M］.上海：上?？萍汲霭嫔纾?002. 228～232.

［3］劉佳佳，佘永新，劉洪斌，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中24種磺胺類藥物殘留.分析試驗室，2011，30：9～13.

［4］朱莉萍，朱濤，武娜，等.高效液相色譜法測定豬肉中磺胺類藥物［J］.肉類研究，2011，10：29～31.

A QuEChERS sample pretreatment coupled with high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of 5 sulfonamides in feed was optimized and validated.Samples were extracted by acetonitrile，and a QuEChERS purifing method with PSA，C18and Na2SO4was followed.Finally，the extraction was evaporated（40℃）and residue was dissolved in mobile phase.A waters symmetry C18colmun（250 mm×4.6 mm，5 μm）was employed for separation.As the results showed，the calibration curves were linear between 10 μg/L and 500 μg/L for sulfonamides（r2＞0.9990），and the limit of detection（LOD）was 0.05 mg/kg，and the limit of quantitation（LOQ）was 0.1 mg/kg.Recoveries of sulfonamides in swine and poultry feed were from 76.0%to 101%，when its additive concentrations were 0.1 mg/kg to 10 mg/kg，the relative standard deviation（RSD）for within-run assays were 2.1%～10.1%.It was concluded that this method was simple，sensitive and reliable for determination of sulfonamides in feed.

sulfonamides；feed；QuEChERS；HPLC

S816.17

A

1004-3314（2016）04-0039-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160410