不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁含量測定及其煎煮提取工藝優(yōu)化Δ

王 強(qiáng)，劉運(yùn)權(quán)，王 濤，劉 學(xué)，，朱晶晶，，張亞洲#（.貴陽中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽55000；.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院，貴陽 550003）

不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁含量測定及其煎煮提取工藝優(yōu)化Δ

王 強(qiáng)1＊，劉運(yùn)權(quán)1，王 濤2，劉 學(xué)1，2，朱晶晶1，2，張亞洲2#（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽550001；2.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院，貴陽 550003）

目的：測定不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量，優(yōu)化天山雪蓮的煎煮提取工藝。方法：采用高效液相色譜法測定10批不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量；以綠原酸和蘆丁提取轉(zhuǎn)移率的綜合得分為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化加水量、煎煮次數(shù)、煎煮時間的水平，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：10批雪蓮中綠原酸含量為0.380%～0.546%，蘆丁含量為0.334%～0.617%；最優(yōu)煎煮工藝條件為取天山雪蓮藥材100 g，浸泡20 min，煎煮3次，每次分別加12、10、10倍藥材的水，分別煎煮45、30、30 min。驗(yàn)證試驗(yàn)中綠原酸和蘆丁提取轉(zhuǎn)移率分別為96.2%、89.3%（RSD分別為2.66%、3.31%，n=3）。結(jié)論：不同產(chǎn)地的天山雪蓮有效成分含量存在一定的差異；優(yōu)化后的煎煮提取工藝穩(wěn)定、可行。

天山雪蓮；不同產(chǎn)地；含量測定；蘆丁；綠原酸；正交試驗(yàn)；煎煮提取工藝

天山雪蓮為菊科植物雪蓮Saussurea involucrata（Kar.et Kir.）Sch.-Bip.的干燥地上部分，又名新疆雪蓮或大苞雪蓮，系新疆維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材。清代趙學(xué)敏所著《本草綱目拾遺》對其記載功效包括“散寒除濕、活血通經(jīng)、強(qiáng)筋助陽、抗炎、鎮(zhèn)痛、收縮子宮”等。民間主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、閉經(jīng)、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽痿等癥［1-2］。

天山雪蓮主要含蛋白質(zhì)、氨基酸、蘆丁等黃酮類，紫丁香苷等木脂素類，大苞雪蓮內(nèi)酯等內(nèi)酯類，大苞雪蓮堿等生物堿類以及多糖類等化學(xué)成分［3-4］。為有效評價不同來源雪蓮的質(zhì)量并最大化提取出其有效成分，筆者對收集的10份不同產(chǎn)地的天山雪蓮藥材中的有效成分綠原酸和蘆丁進(jìn)行了含量測定，并對其煎煮提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200系列高效液相色譜儀、二級管陣列檢測器（DAD）（美國Agilent公司）；Royalstar全自動煎藥壺（榮事達(dá)公司）；KQ-300DB數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

10批天山雪蓮藥材均為筆者本人收集或購買的天山雪蓮（批號見后文），均由貴陽中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為正品天山雪蓮；綠原酸對照品（批號：20140721）、蘆丁對照品（批號：20130916）均購于成都維克奇生物有限公司（純度：均＞98%）；乙腈、甲醇為色譜級，磷酸為分析純，水為自制純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸與蘆丁含量測定[5-7]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（含0.4%磷酸），梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；DAD，綠原酸、蘆丁檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

取“2.1.2”項(xiàng)下綠原酸、蘆丁對照品混合溶液及“2.1.3”項(xiàng)下供試品（批號：TSXL-1）進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、蘆丁與其相鄰左右峰之間的分離度均大于1.5，詳見圖1。

A.混合對照品；B.供試品A.mixed control；B.test sample

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品32.3 mg至50 ml量瓶中，用水溶解得綠原酸對照品溶液；稱取蘆丁21.4 mg至50 ml量瓶中，用甲醇溶解得蘆丁對照品溶液。分別精密量取綠原酸對照品溶液1 ml和蘆丁對照品溶液2 ml至10 ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻后即得。

2.1.3 樣品處理 （1）溶劑的選擇：通過查閱文獻(xiàn)［5-7］及結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蘆丁溶于甲醇、綠原酸溶于水，故選取50%甲醇水為超聲溶劑（功率：300 W，頻率：40 kHz）。（2）超聲時間的選擇：經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲30、45、60 min后對2種成分的提取結(jié)果差別不大，故選取超聲時間為30 min。（3）供試品溶液制備：稱取樣品（批號：TSXL-1）適量至100 ml量瓶中，用50%甲醇水超聲30 min后，再用50%甲醇水稀釋至刻度，搖勻后用微孔濾膜過濾即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及定量限試驗(yàn) 分別精密量取綠原酸、蘆丁對照品溶液，用50%甲醇水稀釋至129.2、96.9、64.6、48.45、32.3、16.15、6.46 μg/ml（綠原酸）和171.28、128.46、85.64、64.23、42.82、21.41、8.56 μg/ml（蘆?。鬟M(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖。將峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得綠原酸的回歸方程為x=0.042y－0.202（r=0.999 9），蘆丁的回歸方程為x=0.073y－0.038（r=0.999 9）。結(jié)果表明綠原酸和蘆丁的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.46～129.2、8.56～171.28 μg/ml，定量限分別為6.46、8.56 μg/ml。

2.1.5 精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果精密度試驗(yàn)中綠原酸、蘆丁峰面積RSD分別為0.082%、 0.20%（n=5）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中綠原酸、蘆丁峰面積RSD分別為0.83%、0.85%（n=5），溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中綠原酸、蘆丁的加樣回收率平均值分別為101.14%（RSD=1.26%，n=3）、100.80%（RSD=1.85%，n=3），均符合規(guī)定。

2.1.6 不同來源天山雪蓮中綠原酸、蘆丁含量測定 取10批次樣品，同“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，計(jì)算含量。含量=有效成分質(zhì)量濃度（μg/ml）×提取液體積（100 ml）/［稱樣量（g）×（1－水分）］×100%。測定結(jié)果見表2。

表2 10批天山雪蓮藥材中綠原酸和蘆丁含量測定結(jié)果Tab 2 Content determination of chlorogenic acid and rutoside in 10batches of S.involucrate

結(jié)果，10批產(chǎn)地不同的天山雪蓮綠原酸含量為0.380%～0.546%，蘆丁含量為0.334%～0.617%，表明不同產(chǎn)地天山雪蓮藥材之間含量差異較大，其中以產(chǎn)地為阿克蘇和阿勒泰的天山雪蓮質(zhì)量為優(yōu)。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化天山雪蓮的煎煮提取工藝[8-9]

選批號為TSXL-5的樣品進(jìn)行正交試驗(yàn)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)選擇加水量、煎煮次數(shù)、煎煮時間為考察因素，以蘆丁和綠原酸提取轉(zhuǎn)移率｛提取液中有效成分含量×提取液總量（500 ml）/［藥材總質(zhì)量（100 g）×（1－水分）×藥材中有效成分含量］×100%｝的綜合得分為指標(biāo)（二者權(quán)重系數(shù)各為50%，綠原酸的提取轉(zhuǎn)移率（%）×50+蘆丁的提取轉(zhuǎn)移率（%）×50），采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。

取100 g天山雪蓮按正交試驗(yàn)安排進(jìn)行操作，藥材煎煮前泡統(tǒng)一浸泡20 min后處理。煎煮后合并煎煮液并稀釋至500 ml，搖勻后精密移取5 ml至100 ml量瓶中，用50%甲醇水稀釋至刻度。分別取10 μl進(jìn)樣測定，計(jì)算煎煮提取后綠原酸與蘆丁的提取轉(zhuǎn)移率。

因素與水平見表3，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

方差分析結(jié)果表明，B因素煎煮次數(shù)對結(jié)果具有顯著影響，而A和C因素即加水量和煎煮時間對結(jié)果則無顯著影響。經(jīng)綜合考慮，確定最優(yōu)煎煮提取工藝條件為A3B3C2，即取天山雪蓮藥材100 g，浸泡20 min，煎煮3次，分別加藥材量12、10、10倍的水，每次煎煮時間分別為45、30、30 min。按以上優(yōu)化工藝進(jìn)行3次試驗(yàn)以驗(yàn)證工藝穩(wěn)定性，結(jié)果3次試驗(yàn)中綠原酸提取轉(zhuǎn)移率為96.2%（RSD=2.66%，n=3），蘆丁提取轉(zhuǎn)移率為89.3%（RSD=3.31%，n=3），表明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。

表3 因素與水平Tab 3 Factors and levels

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 4 Design and results of orthogonal test

表5 方差分析結(jié)果Tab 5 Results of variance analysis

3 討論

筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在測定天山雪蓮有效成分含量過程中的打粉處理操作時，花瓣部分較容易粉碎，而花柄由于其纖維性較強(qiáng)，則需要打粉過篩處理5次以上，否則會影響樣品的均一性；另由于帶花柄的單株雪蓮質(zhì)量最大可在100 g以上，在樣品收集量不充足時，也應(yīng)該每批樣品盡量選取3～4株，以使打粉后樣品的選取具有批次代表性。

對天山雪蓮有效成分的含量測定結(jié)果表明，以綠原酸、蘆丁為指標(biāo)性成分進(jìn)行樣品質(zhì)量控制，均可以達(dá)到限定標(biāo)準(zhǔn)。但不同產(chǎn)地的藥材中有效成分含量不同，在相關(guān)研究中建議研究者注意由此帶來的對相關(guān)結(jié)果的影響。

由于綠原酸在水中溶解，而蘆丁在水中溶解性小，故在樣品提取中選擇由一定比例的甲醇與水混合后的溶劑提取效果更好。

由于2種有效成分化學(xué)性質(zhì)的差異，導(dǎo)致綠原酸保留時間短、易出峰，而蘆丁相對出峰時間較晚。為達(dá)到二者較好的分析效果，筆者在預(yù)試驗(yàn)中曾比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-冰醋酸水等不同的流動相條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-磷酸水梯度洗脫時2種有效成分均出峰時間較合適、峰形較好且與雜質(zhì)分離效果較好。

因蘆丁在水中溶解性小，故在天山雪蓮煎煮提取過程中以水為煎煮溶劑時可能對樣品中蘆丁的提取轉(zhuǎn)移率有一定的影響，導(dǎo)致其提取轉(zhuǎn)移率較低。若只煎煮1次，蘆丁提取轉(zhuǎn)移率一般僅為55%左右，而綠原酸基本可以達(dá)到80%左右，故建議應(yīng)多煎煮幾次。本試驗(yàn)最終的提取工藝也確定為煎煮提取3次。另外，筆者希望在后續(xù)試驗(yàn)中找到更合適的提取溶劑，以提高蘆丁的提取轉(zhuǎn)移率。

［1］蘇來曼·哈力克，凱賽爾·阿不拉，波拉提·馬卡比力，等.天山雪蓮花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.新疆中醫(yī)藥，2011，29 （5）：37.

［2］Chik WI，Zhu L，F(xiàn)an LL，et al.Saussurea involucrata：a review of the botany，phytochemistry and ethnopharmacology of a rare traditional herbal medicine［J］.J Ethnopharmacology，2015，168（20）：44.

［3］王曉玲，李啟發(fā)，丁立生.天山雪蓮的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2007，38（12）：1 795.

［4］歐元，袁曉凡，徐春明，等.天山雪蓮HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2008，39（1）：105.

［5］蘇來曼·哈力克，凱賽爾·阿不拉，敏德.RP-HPLC測定不同產(chǎn)地不同采集期天山雪蓮中綠原酸和蘆?。跩］.中草藥，2007，38（9）：1 412.

［6］董建輝，華卡.高效液相色譜法同時測定天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量［J］.中南藥學(xué)，2008，5（4）：333.

［7］賈麗華，凱賽爾·阿不拉.RP-HPLC法測定天山雪蓮口服液中綠原酸及蘆?。跩］.中成藥，2011，33（6）：1 080.

［8］翟科峰，邢建國，何承輝.正交試驗(yàn)法優(yōu)選天山雪蓮提取工藝的研究［J］.中成藥，2008，30（10）：1 455.

［9］劉桂花，何承輝，帕依曼·亥米提，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選復(fù)方雙金感冒顆粒的提取工藝［J］.中國藥房，2016，27（4）：510.

Content Determination of Chlorogenic Acid and Rutoside in Saussurea involucrate from Different Producing Areas and Optimization of Decoction and Extraction Technology

WANG Qiang1，LIU Yunquan1，WANG Tao2，LIU Xue1，2，ZHU Jingjing1，2，ZHANG Yazhou2（1.Dept.of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Guiyang TCM College，Guiyang 550001，China；2.School of Pharmaceutical Engineering，Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China）

OBJECTIVE：To detect the contents of chlorogenic acid and rutoside in Saussurea involucrate，and to optimize the decoction and extraction technology of S.involucrate from different producing areas.METHODS：The contents of chlorogenic acid and rutoside in 10 batches of S.involucrate from different producing areas were determined by HPLC.L9（34）orthogonal experiment was used to optimize the water amount，decoction times and decoction time using comprehensive score of extraction transport rate of chlorogenic acid and rutoside as index.The verification test was also conducted.RESULTS：The contents of chlorogenic acid and rutoside in 10 batches of S.involucrate were 0.380%-0.546%and 0.334%-0.617%；the optimal decoction technology was as follows as the amout of crude material of S.involucrate 100 g，soaking for 20 min，decocting for 3 times，12，10 and 10 fold of water，decocting 45，30 and 30 min，respectively.The extraction transfer rates of chlorogenic acid and rutoside were 96.2%（RSD= 2.66%，n=3）and 89.3%（RSD=3.31%，n=3）in verification test.CONCLUSIONS：For S.involucrate from different producing areas，the contents of effective components are different；optimized decoction and extraction technology is stable and feasible.

Saussurea involucrate；Different producing areas；Content determination；Rutoside；Chlorogenic acid；Orthogonal test；Decoction and extraction technology

R285.2

A

1001-0408（2016）25-3539-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.25

2016-04-20

2016-06-22）

（編輯：劉 萍）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No.黔科合J字〔2014〕2042號）

＊副教授，博士。研究方向：神經(jīng)性疾病的中藥治療。電話：0851-85284822。E-mail：liukangjing2006@163.com

副教授，博士。研究方向：天然藥物的活性成分和代謝。電話：0851-88210126。E-mail：yazhou_zhang2009@163.com