Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化通關(guān)藤總皂苷的超聲提取工藝及其純化工藝研究Δ

徐東偉，王紹輝，劉同祥#（1.中央民族大學(xué)醫(yī)院藥劑科，北京 100081；.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081）

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化通關(guān)藤總皂苷的超聲提取工藝及其純化工藝研究Δ

徐東偉1＊，王紹輝2，劉同祥2#（1.中央民族大學(xué)醫(yī)院藥劑科，北京 100081；2.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081）

目的：優(yōu)化通關(guān)藤中總皂苷的超聲提取工藝及純化工藝，制備純化的通關(guān)藤總皂苷。方法：以通關(guān)藤總皂苷提取率為指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取溫度等為因素，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化通關(guān)藤總皂苷的超聲提取工藝；以洗脫液中總皂苷含量為指標(biāo)，考察乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷經(jīng)D101型大孔吸附樹脂吸附純化工藝的影響。結(jié)果：最優(yōu)超聲提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、液料比18.5∶1（ml/g）、提取溫度80 ℃；驗(yàn)證試驗(yàn)中通關(guān)藤總皂苷平均提取率為4.80% （RSD=1.06%，n=3），與預(yù)測(cè)值4.89%接近，偏差為1.84%。最優(yōu)純化工藝條件為以45%乙醇為洗脫溶劑除雜，再用90%乙醇進(jìn)行純化；驗(yàn)證試驗(yàn)表明通關(guān)藤總皂苷含量實(shí)測(cè)平均值為62.45%（RSD=0.88%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化后的工藝可較好地提取、純化通關(guān)藤中的總皂苷，且工藝穩(wěn)定、可靠。

通關(guān)藤；總皂苷；提取工藝；Box-behnken響應(yīng)面法；大孔吸附樹脂；純化

通關(guān)藤為蘿摩科植物通關(guān)藤［Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight etArn.］的干燥藤莖［1］，亦稱烏骨藤、通光藤、奶漿藤等，主要分布于云南、貴州、廣西和四川等地［2］。通關(guān)藤始載于《滇南本草》［3］，為我國(guó)傳統(tǒng)民族藥材，其味苦，性甘、涼，入肺、胃、膀胱經(jīng)；具有清熱解毒、止咳平喘、調(diào)節(jié)免疫作用，在云南、貴州民間廣泛用于治療癌癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，通關(guān)藤含有的獨(dú)特化學(xué)成分，具有明顯的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿、敗毒抗癌等作用，對(duì)胃癌、肝癌、肺癌等療效確切，以其為主要原料制備而成的消癌平制劑，在臨床上用于治療各種惡性腫瘤，療效良好［4-6］。通關(guān)藤含有甾體苷、多糖、生物堿、有機(jī)酸、樹脂及色素等多種化學(xué)成分，其中C21甾體苷類是其主要的化學(xué)成分。迄今為止，從中分離鑒定的C21甾體苷類化合物已達(dá)到50多種［7］。皂苷類成分被認(rèn)為是具有抗腫瘤作用的主要活性物質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)通關(guān)藤總皂苷的提取、純化工藝鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，筆者采用響應(yīng)面法對(duì)通關(guān)藤總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察大孔吸附樹脂純化通關(guān)藤總皂苷的工藝條件，優(yōu)化其提取、純化的工藝流程，為通關(guān)藤總皂苷的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-4802H型紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Unic公司）；JMB10001型電子分析天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AL404型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Heidolph 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（德國(guó)Heidolph公司）。

1.2 樹脂、藥材、對(duì)照品與試劑

D-101型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司，非極性，批號(hào)：110512）；通關(guān)藤藥材（廣州市華宇藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201310，經(jīng)中央民族大學(xué)劉同祥教授鑒定為真品）；對(duì)照藥材通關(guān)藤（批號(hào)：121522-201202）、通關(guān)藤苷H對(duì)照品（批號(hào)：111913-201202，純度：99.8%）均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、香草醛、濃硫酸、冰醋酸等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 通關(guān)藤總皂苷含量測(cè)定（香草醛-高氯酸法）[8]

2.1.1 最大波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的通關(guān)藤苷H對(duì)照品2.0 mg，加甲醇超聲溶解，定容至10 ml量瓶中，搖勻，即為對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.5 ml置于試管中，水浴加熱揮干除去溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 ml、高氯酸0.6 ml，搖勻；待溶液呈玫瑰紅色后，在70 ℃水浴中加熱15 min，冰水浴5 min冷卻；加冰乙酸10 ml，搖勻，放置20 min，在400～600 nm波長(zhǎng)下掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果通關(guān)藤苷H在可見光區(qū)域內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)為462 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 ml，置于試管中，自“2.1.1”項(xiàng)下“水浴加熱揮干除去溶劑”起操作，在462 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），以甲醇作為空白對(duì)照。以通關(guān)藤苷H質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=31.01c+0.003（R2=0.998）。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷H檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為1.83～29.18μg/ml。

2.1.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 按相關(guān)方法操作，結(jié)果精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD=1.24%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)中樣品含量的RSD=1.52%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)中樣品含量的RSD=1.72%（n=6，120 min內(nèi)）。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知總皂苷含量（4.05%）的通關(guān)藤粉末6份，分別加入通關(guān)藤苷H對(duì)照品約1 mg，80%乙醇超聲提取20 min。按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作后測(cè)定各供試品溶液的吸光度，代入回歸方程，計(jì)算樣品中總皂苷含量及回收率。結(jié)果平均回收率為98.85%（RSD=1.57%，n=6）。

2.1.5 總皂苷含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取通關(guān)藤總皂苷樣品100 mg置于20 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。準(zhǔn)確吸取0.2 ml置于試管中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作后測(cè)定吸光度，代入回歸方程，根據(jù)樣品質(zhì)量濃度計(jì)算樣品中總皂苷含量。

2.2 單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇超聲提取中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，通過考察各因素對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響，確定相關(guān)因素及其范圍。試驗(yàn)中超聲功率為500 W、超聲頻率為40 kHz?？傇碥仗崛÷视?jì)算公式為：樣品中通關(guān)藤皂苷的質(zhì)量/通關(guān)藤藥材質(zhì)量×100%。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 精確稱取通關(guān)藤粉末5 g共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溫度為40 ℃，液料比為15∶1，分別在50%、60%、70%、80%、90%乙醇條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關(guān)藤粗皂苷，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，以80%乙醇為提取溶劑時(shí)通關(guān)藤總皂苷提取率最優(yōu)，詳見圖1A。

圖1 各因素對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響Fig 1 Effects of each factor on the yield of total saponins

2.2.2 液料比對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取通關(guān)藤粉末5 g共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，提取溫度為40 ℃，分別在液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關(guān)藤粗皂苷，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，以液料比為15∶1時(shí)通關(guān)藤總皂苷提取率最優(yōu)，詳見圖1B。

2.2.3 提取溫度對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取通關(guān)藤粉末5 g 共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，液料比為15∶1，分別在30、50、60、70、80 ℃ 條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關(guān)藤粗皂苷，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，提取溫度為70 ℃ 時(shí)通關(guān)藤總皂苷提取率最高，詳見圖1C。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 精確稱取通關(guān)藤粉末5 g 共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，提取溫度為40 ℃，液料比為15∶1，分別超聲提取25、50、75、100、125 min。過濾，濾液蒸干，干燥得通關(guān)藤粗皂苷，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，提取時(shí)間與通關(guān)藤總皂苷提取率關(guān)系不明顯，詳見圖1D，故在響應(yīng)面試驗(yàn)中剔除該因素。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱取通關(guān)藤藥材17份，每份5 g，參考文獻(xiàn)［9-10］中方法，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）和提取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，以通關(guān)藤總皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平（共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定通關(guān)藤總皂苷的最優(yōu)提取條件。試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of Box-Behnken central composite design

2.3.2 多元二次回歸模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中BC、AC、C2項(xiàng)的P值均＞0.05，為不顯著項(xiàng)，故將其剔除，手動(dòng)優(yōu)化。最終建立多元二次響應(yīng)面回歸模型為Y=4.46+0.28A+0.56B+0.18C+0.29AB－0.5A2－0.53B2（R2=0.949 3）。由R2值表明該方程擬合性良好，可以用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)進(jìn)行分析。各因素的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6軟件的ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，回歸方程中各自變量對(duì)響應(yīng)值的顯著性由F檢驗(yàn)來判定。模型項(xiàng)P＜0.01，說明Y與A、B、C回歸方程的關(guān)系是顯著的；失擬項(xiàng)P＞0.05，說明方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，可以通過該模型預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。各因素對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響由大到小依次為液料比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（C）。

2.3.3 效應(yīng)面分析 由“2.3.2”項(xiàng)分析可知，交互項(xiàng)只有AB項(xiàng)具有顯著性。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析可以得出A、B因素交互影響超聲提取總皂苷的響應(yīng)曲面和等高線圖，直觀地反映AB因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)總皂苷提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig 2 Response surface and contour plots for the effects of ethanol volume fraction and solvent-solid ratio on the extraction rate of total saponins

由圖2可知，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，總皂苷提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的升高均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)約為85%、液料比約為18∶1時(shí)，達(dá)到最大值。

2.3.4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸模型預(yù)測(cè)的通關(guān)藤總皂苷提取的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)84.82%、液料比18.31∶1、提取溫度80 ℃；通關(guān)藤總皂苷提取率理論值為4.89%。實(shí)際試驗(yàn)中對(duì)上述工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、液料比18.5∶1、提取溫度為80 ℃ 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

準(zhǔn)確稱取通關(guān)藤粉末3份，每份100 g，置于3 000 ml燒杯中，按照上述修正的最優(yōu)工藝進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，驗(yàn)證通關(guān)藤總皂苷的提取工藝。結(jié)果測(cè)得通關(guān)藤總皂苷提取率平均值為4.80%（RSD=1.06%，n=3），與預(yù)測(cè)值相比偏差為1.84%，二者比較接近，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠。

2.4 純化工藝的優(yōu)選

2.4.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇D101大孔吸附樹脂。稱取D101大孔吸附樹脂30 g（干質(zhì)量），95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱（26 cm×2.8 cm），用95%乙醇洗至流出液與水（1∶3）混合無白色混濁現(xiàn)象，再用蒸餾水反復(fù)洗脫至洗脫液無明顯乙醇?xì)馕恫⑶覙渲辉傧陆禃r(shí)即可。

2.4.2 洗脫溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱取100 g通關(guān)藤藥材，按最優(yōu)提取工藝提取3次；合并提取液并濃縮到一定量，加至預(yù)先處理好的D101柱預(yù)吸附1 h，用蒸餾水洗至流出液不顯Molish反應(yīng)，棄去水洗脫液；然后依次用30%、45%、60%、75%、90%、95%的乙醇梯度洗脫，控制流速為1倍柱體積（BV）/h左右，每個(gè)體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫5 BV。每1 BV收集1次洗脫液，共收集30份。將每份樣品液制成干浸膏稱量，并測(cè)定通關(guān)藤總皂苷的含量，繪制洗脫曲線，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的洗脫效果，結(jié)果見表4和圖3（圖中乙醇體積分?jǐn)?shù)：1～5號(hào)為30%，6～10號(hào)為45%，11～15號(hào)為60%，16～20號(hào)為75%，21～25號(hào)為90%，26～30號(hào)為95%）。

表4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的洗脫效率Tab 4 Elution effects of different volume fraction of ethanol

圖3 梯度洗脫曲線Fig 3 Gradient elution curve

從表4和圖3可以看出，通關(guān)藤總皂苷主要集中在60%、75%和90%乙醇洗脫液中，占全部洗脫液中通關(guān)藤總皂苷的80%以上。為了得到含量較高的通關(guān)藤總皂苷，可以選擇用45%乙醇洗去雜質(zhì)，然后再用90%乙醇洗脫進(jìn)行純化。

2.4.3 精制皂苷的含量測(cè)定 精確稱取100 g通關(guān)藤藥材3份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法提取操作后上D101柱，用5 BV的45%乙醇洗脫后，用90%乙醇洗脫5 BV。收集90%乙醇洗脫液，回收溶劑，蒸干可得純化的通關(guān)藤總皂苷。經(jīng)測(cè)定，純化后的皂苷含量平均值為62.45%（RSD=0.88%，n=3），說明純化工藝可制得純度較高的通關(guān)藤總皂苷，且工藝操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性良好。

綜上所述，本研究得出通關(guān)藤總皂苷的最優(yōu)超聲提取工藝：提取溶劑為85%乙醇，液料比為18.5∶1，提取溫度為80 ℃ 。最優(yōu)純化工藝：提取液濃縮后上D101柱，用45%乙醇洗脫除雜后，再用90%乙醇洗脫進(jìn)行純化。在此條件下可制得含量較高的通關(guān)藤總皂苷，且方法簡(jiǎn)單易行，可擴(kuò)大生產(chǎn)。

3 討論

本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定了超聲提取通關(guān)藤總皂苷3個(gè)因素的主次關(guān)系并得到了提取效果最優(yōu)的理論工藝條件。通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明通關(guān)藤總皂苷提取率實(shí)測(cè)值與理論值基本吻合，提取率較高，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

預(yù)試驗(yàn)中通過比較不同種類大孔吸附樹脂，發(fā)現(xiàn)D101型大孔吸附樹脂吸附快、吸附量大、洗脫率高、洗脫速度較快、洗脫時(shí)間短，對(duì)通關(guān)藤總皂苷有較好的富集純化效果，且價(jià)格便宜，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

使用D101型大孔吸附樹脂以45%乙醇洗去雜質(zhì)，再用90%乙醇純化可得到含量較高的通關(guān)藤總皂苷。目前以通關(guān)藤原料制備而成的中藥制劑有消癌平片、消癌平糖漿、消癌平膠囊和消癌平注射液，臨床廣泛用于治療肝癌、胃癌、肺癌等各種晚期惡性腫瘤［11-13］，然而這些制劑多為通關(guān)藤藥材的水提物。在本試驗(yàn)進(jìn)行過程中，筆者發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤藥材的主要活性物質(zhì)皂苷類極性較小、水溶性較差，水提物中的皂苷含量很低；而以本試驗(yàn)方法得到的皂苷含量較高。后期可通過臨床前研究對(duì)其藥理活性進(jìn)行進(jìn)一步深入探索，研究其作為原料藥用于抗腫瘤藥物開發(fā)的可能性。下一步擬以消癌平口服液為陽性對(duì)照，研究通關(guān)藤總皂苷對(duì)Lewis肺癌裸鼠的腫瘤抑制作用，為開發(fā)研究以通關(guān)藤總皂苷為原料藥的抗癌新藥提供科學(xué)依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：296.

［2］張貴君.現(xiàn)代中藥材商品通鑒［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)出版社，2001：1 200.

［3］周海鈞，曾育麟.中國(guó)民族藥志［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1984：29.

［4］于紹帥，陳明蒼，李志雄，等.通關(guān)藤的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（21）：279.

［5］Zhang H，Tan A，Zhang A，et al.Five new C21 steroidal glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima［J］.Steroids，2010，75（2）：176.

［6］錢軍，華海清，秦叔逵.通關(guān)藤制劑抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34（1）：11.

［7］魏文靜，劉同祥.民族藥烏骨藤抗腫瘤藥理活性及機(jī)制研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（7）：1 717.

［8］楊安平，柯俊東.響應(yīng)曲面法優(yōu)選糞箕篤總皂苷的提取工藝［J］.天津藥學(xué)，2015，27（2）：5.

［9］韋麗文，陳振建.響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取桑椹多酚條件［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2015，24 （10）：25.

［10］楊小軍，丁永輝.響應(yīng)面法優(yōu)化藏藥綠蘿花總黃酮的超聲波輔助提取工藝［J］.中國(guó)藥房，2015，26（25）：3 566.

［11］李延芳，廖文斌，馬麗芳，等.通光散化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（7）：1 761.

［12］周艷艷，李玉云，李良，等.烏骨藤提取物抑制裸小鼠胃癌模型腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29 （5）：13.

［13］姚小燕.消癌平注射液治療晚期惡性腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（18）：41.

Optimization of Ultrasonic Extraction of Total Saponins from Marsdenia tenacissima by Box-Behnken Response Surface Method and Its Purification Technology

XU Dongwei1，WANG Shaohui2，LIU Tongxiang2（1.Dept.of Pharmacy，Hospital of Minzu University of China，Beijing 100081，China；2.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing 100081，China）

OBJECTIVE：To optimize the ultrasonic extraction and purification technology of total saponins from Marsdenia tenacissima，and to prepare purified total saponins from M.tenacissima.METHODS：Using the extraction rate of total saponins from M.tenacissima as index，ethanol volume fraction，solvent-solid ratio and extraction temperature as factors，ultrasonic extraction technology of total saponins from M.tenacissima was optimized by single factor test and Box-Behnken response surface design.Using the content of total saponins in elution，the effects of ethanol elution volume fraction on purification technology of total saponins by D101 type macroporous adsorption resin was investigated.RESULTS：The optimal ultrasonic extraction technology was as follows as ethanol volume fraction of 85%，solvent-solid ratio of 18.5∶1（ml/g），extraction temperature of 80 ℃.In verification test，the average extraction rate of total saponins from M.tenacissima was 4.80%（RSD=1.06%，n=3）；it was close to predicted value 4.89%，and the deviation was 1.84%.The optimal purification technology was as follows as 45%ethanol as eluant，90% ethanol for purification.Verification test showed that the average content of total saponins from M.tenacissima was 62.45%（RSD= 0.88%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized technology can be used for the extraction and purification of total saponins from M.tenacissima.The technology is stable and reliable.

Marsdenia tenacissima；Total saponins；Extraction technology；Box-Behnken response surface method；Macroporous adsorption resin；Purification

R285.2

A

1001-0408（2016）25-3535-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.24

2016-02-16

2016-03-27）（編輯：劉 萍）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.81073151）

＊主管藥師，博士研究生。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、天然藥物研發(fā)。電話：010-68932277。E-mail：xudongwei@muc.edu.cn

研究員，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：民族醫(yī)藥研發(fā)。電話：010-68933254。E-mail：binghe6665_cn@sina.com