共軛亞油酸-吉西他濱偶聯(lián)物的體外抗腫瘤活性研究

陶小妹，顧紅燕，李麗莉，陶巍巍（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 00038；2.大連醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧大連 6044）

共軛亞油酸-吉西他濱偶聯(lián)物的體外抗腫瘤活性研究

陶小妹1＊，顧紅燕1，李麗莉1，陶巍巍2#（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038；2.大連醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧大連 116044）

目的：研究共軛亞油酸-吉西他濱偶聯(lián)物（CLA-GEM）的體外抗腫瘤活性。方法：考察不同濃度（0.001～100 μmol/L）的CLA-GEM和吉西他濱（GEM）溶液分別與不同腫瘤細(xì)胞（乳腺癌MCF-7細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、肺腺癌A549細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞）共同孵育72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）和與MCF-7細(xì)胞共同孵育24、48、72 h的細(xì)胞存活率。將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體抑制劑NBMPR（100 μmol/L）和雙嘧達(dá)莫（4 μg/ml）分別作用于MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞，考察0.001～100 μmol/L的CLA-GEM和GEM對核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的依賴性（以IC50為指標(biāo)）?？疾?μmol/L的CLA-GEM和GEM與MCF-7細(xì)胞共同孵育24 h的細(xì)胞周期變化。結(jié)果：與GEM比較，CLA-GEM孵育后對MCF-7、MDA-MB-231、NCI-H446細(xì)胞的IC50更低（P＜0.01），對A549、C6細(xì)胞的IC50差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GEM孵育48 h后和CLA-GEM孵育24 h后MCF-7細(xì)胞存活率開始明顯降低，GEM孵育72 h后細(xì)胞存活率最低為21%，而CLA-GEM能完全殺死腫瘤細(xì)胞。與GEM或CLA-GEM單用比較，經(jīng)NBMPR、雙嘧達(dá)莫處理的GEM對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的IC50明顯升高（P＜0.01），而CLA-GEM對細(xì)胞的IC50差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與GEM比較，CLA-GEM可使MCF-7細(xì)胞的S期延長約6%（P＜0.01）。結(jié)論：CLA-GEM較GEM的抗腫瘤活性更強(qiáng)、起效更快，且不受核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的影響。

共軛亞油酸-吉西他濱偶聯(lián)物；抗腫瘤；核酸轉(zhuǎn)運(yùn)；細(xì)胞周期

注射用鹽酸吉西他濱（Gemcitabine hydrochloride for injection）是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌的一線用藥。吉西他濱（Gemcitabine，GEM）為新型嘧啶類脫氧核苷類似物，通過抗代謝作用來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。但由于其半衰期短、選擇性較差、容易產(chǎn)生耐藥性以及對骨髓和胃腸道等的副作用限制了其廣泛使用。不飽和脂肪酸對細(xì)胞及核酸具有良好的親和性，將不飽和脂肪酸骨架引入到藥物分子中，有利于藥物到達(dá)細(xì)胞組織內(nèi)而有效地發(fā)揮作用。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一種具有天然抗乳腺癌和抗乳腺癌新生血管活性的不飽和脂肪酸。為了降低GEM的毒副作用、提高藥效，本課題組設(shè)計(jì)并合成了不飽和脂肪酸CLA與GEM共價(jià)連接的CLA-GEM偶聯(lián)物，前期已對其合成、表征、理化性質(zhì)進(jìn)行了報(bào)道［1］，本文主要就其體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

TDL-5-A低速臺式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FACSan Flow Cytometer流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；TCS SP5激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；HC-2064高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；RF-5301熒光分光光度儀（日本Shimadzu公司）；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

CLA-GEM（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部合成，批號：20110522，純度：99%）；GEM（武漢市豐竹林化學(xué)醫(yī)藥有限公司，批號：20120911，純度：99%）；CLA（美國Sigma-Aldrich公司，批號：20121205，純度：99%）；硝基芐基硫代肌苷（NBMPR，德國Merck公司，批號：20121009，純度：99%）；雙嘧達(dá)莫原料藥（武漢英和制藥有限公司，批號：20111225，純度：99%）；MEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、青霉素、硫酸鏈霉素均購自北京邁晨科技有限公司；OPTI-MEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）；Hoechst 33258、磺基羅丹明B（SRB）、三氯乙酸（TCA）均購自美國Sigma公司；其他試劑均為色譜純。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞、鼠源腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞均購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制試驗(yàn)

2.1.1 不同細(xì)胞系的細(xì)胞抑制試驗(yàn) 將MCF-7、MDA-MB-231、A549、NCI-H446、C6細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 500個，設(shè)3個復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37 ℃、相對濕度95%的條件下孵育24 h，待細(xì)胞貼壁生長。然后將稀釋好的系列濃度的CLA-GEM、GEM分別加入到MCF-7（0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L）、MDA-MB-231（0.01、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L）、A549（0.01、0.1、0.25、0.75、1、5、10、50 μmol/L）、NCI-H446（0.01、0.1、0.5、2.5、7.5、10 μmol/ L）和C6細(xì)胞（0.001、0.01、0.025、0.075、0.1、0.25、0.5 μmol/L）中，以0.5%二甲基亞砜（DMSO）溶液為空白對照。孵育72 h后按照SRB比色分析法進(jìn)行處理，采用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測定吸光度（A），用SPSS 17.0計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。CLA-GEM和GEM與不同細(xì)胞共同孵育后的IC50檢測結(jié)果見表1。

表1 CLA-GEM和GEM與不同細(xì)胞共同孵育后的IC50檢測結(jié)果（±s，n=3，μmol/L）Tab 1 IC50of different cells after treated with CLA-GEM and GEM（±s，n=3，μmol/L）

表1 CLA-GEM和GEM與不同細(xì)胞共同孵育后的IC50檢測結(jié)果（±s，n=3，μmol/L）Tab 1 IC50of different cells after treated with CLA-GEM and GEM（±s，n=3，μmol/L）

注：與GEM比較，＊P＜0.01 Note：vs.GEM，＊P＜0.01

GEM 2.01±0.30 3.84±0.04 0.60±0.07 7.24±1.30 0.25±0.09細(xì)胞MCF-7 MDA-MB-231 A549 NCI-H446 C6 IC50CLA-GEM 0.58±0.03＊1.27±0.07＊1.11±0.31 1.98±0.97＊0.26±0.07

由表1可知，CLA-GEM對MCF-7、MDA-MB-231、NCIH446細(xì)胞的IC50遠(yuǎn)低于GEM（P＜0.01），說明對這3種細(xì)胞，CLA-GEM比GEM具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性；而對于A549、C6細(xì)胞，CLA-GEM與GEM對細(xì)胞的IC50相似。這說明對于上述5種腫瘤細(xì)胞，CLA-GEM比GEM的細(xì)胞生長抑制作用更強(qiáng)或者效果相當(dāng)。

2.1.2 不同孵育時(shí)間的細(xì)胞抑制試驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（24 h為10 000個/孔，48 h為5 000個/孔，72 h為2 500個/孔），設(shè)3個復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37 ℃、相對濕度95%的條件下孵育24 h，待細(xì)胞貼壁生長。然后將0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L的CLA-GEM、GEM加入到上述的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，以0.5%DMSO溶液為空白對照。分別孵育24、48、72 h后按照SRB比色分析法測定540 nm波長處的A，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率（%）=（藥物孵育后細(xì)胞的A540/空白對照細(xì)胞的A540）×100%。CLA-GEM和GEM孵育不同時(shí)間后MCF-7細(xì)胞的成活率曲線圖見圖1。

圖1 CLA-GEM和GEM孵育不同時(shí)間后MCF-7細(xì)胞的成活率曲線圖（n=3）Fig 1 Survival rate curve of MCF-7 cells after treated with CLA-GEM and GEM for different time（n=3）

由圖1可知，GEM只有在共同孵育48 h以上才有顯著的細(xì)胞毒作用，并且即使共同孵育72 h后，在100 μmol/L的高濃度GEM作用下仍然只能殺死79%的MCF-7細(xì)胞，即不能完全殺死腫瘤細(xì)胞。而CLA-GEM在共同孵育24 h后，5 μmol/L的CLAGEM（與GEM比較，P＜0.01）即有顯著的細(xì)胞抑制作用，50 μmol/L即可完全殺死MCF-7細(xì)胞。共同孵育48 h后，10 μmol/L 的CLA-GEM即可完全殺死MCF-7細(xì)胞。這說明相比于原藥GEM，CLA-GEM極大地增強(qiáng)了對MCF-7細(xì)胞的抑制作用。

2.2 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體抑制試驗(yàn)

將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中（5 000 個/孔）孵育24 h后，將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體抑制劑NBMPR（100 μmol/L）或者雙嘧達(dá)莫（4 μg/ml）加入細(xì)胞［2-3］。30 min后，將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體抑制劑吸出，加入0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L的CLA-GEM和GEM溶液。繼續(xù)孵育72 h，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測定并計(jì)算IC50。每個濃度重復(fù)3次。NBMPR和雙嘧達(dá)莫分別與GEM、CLA-GEM聯(lián)用后對MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的IC50檢測結(jié)果見表2。

表2 NBMPR和雙嘧達(dá)莫分別與GEM、CLA-GEM聯(lián)用后對MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的IC50檢測結(jié)果（±s，n= 3，μmol/L）Tab 2 IC50of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treated with NBMPR and dipyridamole combined with GEM or CLA-GEM（±s，n=3，μmol/L）

表2 NBMPR和雙嘧達(dá)莫分別與GEM、CLA-GEM聯(lián)用后對MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的IC50檢測結(jié)果（±s，n= 3，μmol/L）Tab 2 IC50of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treated with NBMPR and dipyridamole combined with GEM or CLA-GEM（±s，n=3，μmol/L）

注：與GEM比較，＊P＜0.01

藥物GEM GEM+雙嘧達(dá)莫GEM+NBMPR CLA-GEM CLA-GEM+雙嘧達(dá)莫CLA-GEM+NBMPR IC50MDA-MB-231 3.84±0.04 53.30±10.77＊89.53±1.05＊1.27±0.07 3.24±0.67 1.51±0.37 MCF-7 2.01±0.30 52.10±12.80＊79.13±4.21＊0.58±0.03 0.83±0.03 0.92±0.08

由表2可知，對MCF-7細(xì)胞，NBMPR和雙嘧達(dá)莫可以顯著降低GEM的敏感性（P＜0.01），分別使GEM的IC50增加了40倍和24倍；相比之下，CLA-GEM的IC50僅分別增加了1.6倍和1.4倍。在MDA-MB-231細(xì)胞上可以看到同樣的趨勢，NBMPR和雙嘧達(dá)莫顯著降低了GEM的細(xì)胞抑制作用（P＜0.01），分別使GEM的IC50增加了23倍和14倍，而僅使CLAGEM的IC50分別增加了1.2倍和2.6倍。這提示核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體抑制劑對GEM有明顯抑制作用，而對CLA-GEM基本沒有影響。這說明GEM依賴核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞，而CLA-GEM不依賴核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞周期試驗(yàn)

按照碘化吡啶DNA染色法［4］考察GEM和CLA-GEM對MCF-7細(xì)胞周期的影響。每次分析所用的細(xì)胞數(shù)不少于5×105個，收集的細(xì)胞數(shù)為10 000個。數(shù)據(jù)使用FCS Express V3軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞固定，用碘化吡啶染色，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測1μmol/L GEM和1μmol/L CLA-GEM對MCF-7細(xì)胞周期的影響，并設(shè)不加任何藥物的對照。GEM和CLA-GEM孵育MCF-7細(xì)胞后的細(xì)胞周期變化見表3。

表3 GEM和CLA-GEM孵育后MCF-7細(xì)胞的周期變化（±s，n=3，%%）Tab 3 Cell cycle of MCF-7 cells after treated with GEM and CLA-GEM（±s，n=3，%%）

表3 GEM和CLA-GEM孵育后MCF-7細(xì)胞的周期變化（±s，n=3，%%）Tab 3 Cell cycle of MCF-7 cells after treated with GEM and CLA-GEM（±s，n=3，%%）

注：與GEM比較，＊P＜0.01Note：vs.GEM，＊P＜0.01

G2/M 3.22±0.41 0.56±0.31 0.32±0.23藥物對照GEM CLA-GEM G1S 71.26±0.33 70.03±0.65 64.94±2.33 25.52±1.32 29.41±0.23 35.06±2.33＊

與對照比較，GEM和CLA-GEM可以阻滯MCF-7細(xì)胞周期在S期，分別提高了S期細(xì)胞比例約4%和10%；與GEM比較，CLA-GEM可使細(xì)胞周期的S期延長約6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

由于脂肪族基團(tuán)CLA的引入大大增加了GEM的脂溶性，CLA-GEM有利于通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)CLA對GEM的N4位氨基的保護(hù)作用使CLA-GEM在體外細(xì)胞抑制試驗(yàn)中顯示出比原藥GEM更好的抗腫瘤活性。

GEM是親水性核苷類似物，不能通過簡單擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞［5-6］，必須借助平衡型核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（hENT1）和濃聚型核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（hCNT1）才能進(jìn)入細(xì)胞。定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定非小細(xì)胞肺癌患者中的hENT1和脫氧胞苷激酶（dCK）表達(dá)量的結(jié)果表明，hENT1表達(dá)量增加，GEM敏感性增加；dCK表達(dá)量降低，GEM耐藥性增加［7］。Nakano Y等［8］研究表明，胰腺癌的獲得性耐藥與hENT1、dCK、核糖核苷酸還原酶M1（RRM1）、RRM2的表達(dá)量有關(guān)。Greenhalf W等［9］研究表明，經(jīng)免疫標(biāo)記法檢測，有hENT1的胰腺癌患者比沒有hENT1的患者生存期更長。另有報(bào)道，GEM與硬脂酸形成的偶聯(lián)物裝入納米粒中可以克服由于RRM1過量表達(dá)產(chǎn)生的耐藥性［10］。Guzmán-Gutiérrez E等［11］研究表明，耐藥腫瘤組織hENT1的表達(dá)量明顯低于正常組織，表達(dá)量降低，意味著依賴核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞的藥物吸收減少以及耐藥性的產(chǎn)生。耐藥性的產(chǎn)生主要是由于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體被破壞，MTT試驗(yàn)表明在耐藥型細(xì)胞系上SQGem（角鯊烯與GEM形成的偶聯(lián)物）的IC50顯著低于GEM［12］。這提示核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體對GEM造成了較大的作用局限性。

在GEM上引入脂溶性基團(tuán)可以改變藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式，如NEO6002，其為GEM與心磷脂形成的偶聯(lián)物。研究證明，NEO6002是通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不依賴核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體［13］。SQGem通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入細(xì)胞后主要集中在細(xì)胞膜以及以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主的細(xì)胞器中，接著SQGem被緩慢釋放到細(xì)胞漿內(nèi)，并降解成GEM，部分GEM會被核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體泵出細(xì)胞［14］。

GEM主要作用于S期和G1晚期，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。本研究中CLA-GEM可以顯著延長細(xì)胞S期；PEG與GEM形成的偶聯(lián)物（PEG-GEM）也可以有效延長細(xì)胞S期滯留時(shí)間。有研究用溴脫氧尿苷摻入法進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，即作用24 h后，GEM有18%的細(xì)胞處于S期，而PEG-GEM 有23.5%細(xì)胞處于S期［15］。

綜上，CLA-GEM具有良好的體外抗腫瘤活性。

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Study on in vitro Anticancer Activity of Conjugated Linoleic Acid-Gemcitabine Conjugate

TAO Xiaomei1，GU Hongyan1，LI Lili1，TAO Weiwei2（1.Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China；2.School of Nursing，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

OBJECTIVE：To study in vitro anticancer activity of conjugated linoleic acid-gemcitabine conjugate（CLA-GEM）.METHODS：IC50of different tumor cells（breast cancer MCF-7 cell，breast cancer MDA-MB-231 cell，lung cancer A549 cell，small cell lung cancer NCI-H446 cell，glioma C6 cell）were investigated after treated with different concentrations（0.001-100 μmol/L）of CLA-GEM and gemcitabine（GEM）for 72 h；survival rates of MCF-7 cell were investigated after treated with above solution for 24，48 and 72 h.The dependence of 0.001-100 μmol/L CLA-GEM and GEM to nucleoside transporter was investigated （by IC50）through MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells treated with nucleoside transporter inhibitors（NBMPR，100 μmol/L）and dipyridamole（4 μg/ml）.The change of MCF-7 cell cycle was investigated after treated with 1μmol/L CLA-GEM and GEM for 24 h.RESULTS：Compared with GEM，IC50of MCF-7，MDA-MB-231 and NCI-H446 cells became lower after treated with CLAGEM（P＜0.01），there were no statistical significances in IC50between A549 and C6 cells（P＞0.05）.Survival rate of MCF-7 cells decreased significantly after treated with GEM for 48 h and CLA-GEM for 24 h.Survival rate of MCF-7 cells was the lowest，being 21%after treated with GEM for 72 h，while tumor cells were sacrificed by CLA-GEM completely.Compared with GEM or CLA-GEM，IC50of MCF-7 and MDA-MB-231 cells increased significantly after treated with NBMPR，dipyridamole combined with GEM（P＜0.01）；there were no statistical significance in IC50after treated with NBMPR，dipyridamole combined with CLAGEM（P＞0.05）.Compared with GEM，CLA-GEM could prolong 6%of S stage of MCF-7 cells（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Compared with GEM，CLA-GEM exhibits significant antitumor activity and rapid action，and it isn’t influenced by nucleic acid transportation.

Conjugated linoleic acid-gemcitabine conjugate；Anticancer；Nucleic acid transportation；Cell cycle

R965

A

1001-0408（2016）25-3521-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.20

2015-11-06

2016-02-25）

·民族醫(yī)藥·

＊主管藥師，博士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、分子藥劑學(xué)。E-mail：yaoketaoxiaomei@163.com

講師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、分子藥劑學(xué)。E-mail：taoweiwei2003@163.com