前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和eNOS表達(dá)的影響

王友俊，張玲美（萊蕪鋼鐵集團(tuán)有限公司醫(yī)院傳染科，山東萊蕪 271126）

前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和eNOS表達(dá)的影響

王友俊＊，張玲美（萊蕪鋼鐵集團(tuán)有限公司醫(yī)院傳染科，山東萊蕪 271126）

目的：研究前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMECs）中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表達(dá)的影響。方法：將HPMECs分為A組（正常培養(yǎng)）、B組（3%O2培養(yǎng)）、C組（3%O2培養(yǎng)+15 μg/L前列地爾）及D組（3%O2培養(yǎng)+45 μg/L前列地爾），相應(yīng)培養(yǎng)24 h。觀察各組細(xì)胞形態(tài)，MTT比色法檢測細(xì)胞活力（以吸光度計(jì)），流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測細(xì)胞中VEGF、eNOS相對表達(dá)量。結(jié)果：A、D組細(xì)胞密度較高，B、C組細(xì)胞密度較低。與A組比較，B、C、D組細(xì)胞活力降低、凋亡率升高、VEGF與eNOS表達(dá)增強(qiáng)、eNOS/VEGF減少（P＜0.05）。與B組比較，C、D組細(xì)胞活力增加、VEGF表達(dá)減弱（P＜0.05）；D組細(xì)胞凋亡率降低、eNOS表達(dá)減弱、eNOS/VEGF增加（P＜0.05）。與C組比較，D組細(xì)胞凋亡率降低、VEGF表達(dá)減弱、eNOS/VEGF增加（P＜0.05）。結(jié)論：前列地爾可能通過上調(diào)HPMECs的eNOS/VEGF發(fā)揮保護(hù)作用。

前列地爾；缺氧損傷；人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶

缺氧可以導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮功能障礙，引起肺血管強(qiáng)烈收縮及血管平滑肌細(xì)胞大量增生，促進(jìn)缺氧性肺動脈高壓的發(fā)生［1］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮增厚、動脈血壓升高；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）具有較強(qiáng)的心血管保護(hù)作用，可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及血管平滑肌遷移，防止肺動脈高壓進(jìn)展［2-3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾的擴(kuò)血管作用能降低慢性阻塞性肺病并肺動脈高壓患者的肺動脈壓力，但其機(jī)制尚未明確［4］。為此，本文從VEGF和eNOS角度研究前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMECs）的影響機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

CX41奧林巴斯顯微鏡（上海西努光學(xué)科技有限公司）；FC500 MCL/MPL流式細(xì)胞儀、Gallios流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；3-18R高速冷凍離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司，離心半徑：6 cm）；DG5033A酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；Image-Pro Insight圖像分析軟件（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

前列地爾原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：20140207，純度：95.00%）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：20140301）；胰蛋白酶（杭州沃森生物技術(shù)有限公司，批號：20140412）；Cellmax澳洲胎牛血清［賽澳美細(xì)胞技術(shù)（北京）有限公司，批號：20140811］；MTT（上海源葉生物科技有限公司，批號：20140207，純度：98.00%）；二甲基亞砜（DMSO，重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司，批號：20140315）；AnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素（FIFC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海睿時生物科技有限公司，批號：20131204）；小鼠抗人VEGF抗體（武漢艾美捷科技有限公司，批號：20140105）；小鼠抗人eNOS抗體（上海一研生物科技有限公司，批號：20140597）；小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體（北京中杉金橋公司，批號：20140307、20140102）。

1.3 細(xì)胞

HPMECs購自上海素爾生物科技有限公司。

2 方法

2.1 HPMECs細(xì)胞培養(yǎng)

將HPMECs及2 ml含10%胎牛血清的100 u/ml青霉素-0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次，直至細(xì)胞融合90%時進(jìn)行傳代，取3～5代細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2 缺氧損傷模型建立與分組

將HPMECs置于無血清培養(yǎng)基中處理12 h使細(xì)胞同步化，將細(xì)胞用0.25%培養(yǎng)基中消化2 min，棄上清，加入2 ml血清培養(yǎng)基后吹打至細(xì)胞分散后，1 500 r/min（離心半徑6 cm，下同）離心5 min，收集沉淀，加入含抗生素及血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1.5×102μl－1接種至96孔板，每孔200 μl。試驗(yàn)分為A、B、C、D組，各組細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。A組為正常對照，于常氧環(huán)境中培養(yǎng)；B、C、D組細(xì)胞于3%O2-5%CO2-92%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h制備缺氧損傷模型［5］。其中C、D組培養(yǎng)前加入前列地爾使其在培養(yǎng)液中質(zhì)量濃度為15、45 μg/L［6］，A、B組培養(yǎng)前加入無血清培養(yǎng)液，各孔中液體體積為（200±20）μl。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將96孔板直接置于倒置熒光顯微鏡（放大100倍）下觀察，比較各組細(xì)胞形態(tài)的變化，并拍照。

2.3.2 MTT比色法檢測細(xì)胞活力 各組細(xì)胞均棄去上清液，每組設(shè)12個復(fù)孔，設(shè)置空白對照孔（無細(xì)胞）調(diào)零，加入200 μl無血清培養(yǎng)液及20 μl的MTT+磷酸鹽緩沖液（PBS）（5 g/L），于37 ℃下孵育4 h并終止培養(yǎng)。棄上清后每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，分別用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定細(xì)胞培養(yǎng)0、6、12、24 h后的吸光度（A），繪制細(xì)胞生存曲線。

2.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 用胰蛋白酶分別消化及收集各組細(xì)胞，每個樣本調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×109～5×109個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用500 μl PBS重懸細(xì)胞。每個樣本中分別加入5 μl AnnexinⅤ-FIFC和10μl碘化丙啶（PI），避光搖勻后黑暗中室溫孵育5 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

2.3.4 Western blot法檢測細(xì)胞中VEGF及eNOS表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入裂解液，蛋白定量后采用Western blot法檢測VEGF及eNOS表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行：裂解細(xì)胞后獲取總蛋白，將蛋白定量后經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉、切膜后分別加入1∶500的小鼠抗人VEGF抗體及1∶500的小鼠抗人eNOS抗體和1∶2 000的小鼠抗人β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，室溫孵育1.5 h后洗膜，電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒曝光顯影。以目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin條帶的比值作為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)

A、D組細(xì)胞的密度較高，細(xì)胞生長接近亞融合狀態(tài)，呈短梭形生長，排列呈鋪路石狀；B組細(xì)胞密度較低，部分細(xì)胞呈空泡狀，表現(xiàn)出損傷；C組細(xì)胞密度較低，損傷不明顯。各組細(xì)胞的形態(tài)圖見圖1。

圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)圖（×100）Fig 1 Morphology of cells in each group（×100）

3.2 細(xì)胞活力與凋亡率

與A組比較，B、C、D組細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組細(xì)胞的生存曲線見圖2，培養(yǎng)24 h時的A值和凋亡率檢測結(jié)果見表1。

圖2 各組細(xì)胞的生存曲線Fig 2 Survival curves of cells in each group

表1 各組細(xì)胞的A值和凋亡率檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 1 Detection results of A value and apoptosis rate of cells in each group（±s，n=12）

表1 各組細(xì)胞的A值和凋亡率檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 1 Detection results of A value and apoptosis rate of cells in each group（±s，n=12）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，☆P＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，☆P＜0.05

凋亡率，% 13.09±1.17 17.92±1.42＊16.25±1.33＊15.09±1.27＊#☆11.021 ＜0.05組別A組B組C組D組A值F P 0.57±0.02 0.46±0.04＊0.51±0.03＊#0.52±0.02＊#8.814 ＜0.05

3.3 細(xì)胞中VEGF和eNOS表達(dá)

與A組比較，B、C、D組細(xì)胞中VEGF和eNOS的表達(dá)增強(qiáng)，eNOS/VEGF減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C組細(xì)胞中VEGF表達(dá)減弱，D組細(xì)胞中VEGF和eNOS的表達(dá)減弱、eNOS/VEGF增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與C組比較，D組細(xì)胞的eNOS/VEGF增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組細(xì)胞中VEGF、eNOS表達(dá)的電泳圖見圖3，檢測結(jié)果見表2。

圖3 各組細(xì)胞中VEGF、eNOS表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electropherogram of the expressions of VEGF and eNOS of cells in each group

表2 各組細(xì)胞中VEGF、eNOS表達(dá)及eNOS/VEGF的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 2 Detection results of expressions of VEGF and eNOS and eNOS/VEGF of cells in each group（±s，n=12）

表2 各組細(xì)胞中VEGF、eNOS表達(dá)及eNOS/VEGF的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 2 Detection results of expressions of VEGF and eNOS and eNOS/VEGF of cells in each group（±s，n=12）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，☆P＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，☆P＜0.05

eNOS/VEGF 0.92±0.38 0.53±0.19＊0.59±0.21＊0.73±0.27＊#☆10.264 ＜0.05組別A組B組C組D組F P VEGF/β-actin 0.08±0.02 0.59±0.11＊0.42±0.09＊#0.29±0.02＊#☆9.876 ＜0.05 eNOS/β-actin 0.07±0.04 0.31±0.12＊0.25±0.03＊0.22±0.04＊#11.021 ＜0.05

4 討論

缺氧可以引起肺血管強(qiáng)烈收縮及血管平滑肌細(xì)胞大量增生，促進(jìn)肺動脈高壓的發(fā)生。近些年研究發(fā)現(xiàn)，缺氧引起的多種血管活性物質(zhì)平衡失調(diào)在肺動脈高壓的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用［6-7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾注射液預(yù)處理對局部腦缺血模型的大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過下調(diào)大腦皮層的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）、上調(diào)eNOS有關(guān)［8-9］。肺是前列地爾代謝最強(qiáng)及作用最明顯的器官，研究認(rèn)為前列地爾主要通過緩解肺血管局限性狹窄、擴(kuò)張肺動脈、增加遠(yuǎn)端肺血流、改善肺通氣/血流比，從而達(dá)到降低肺動脈壓的作用［10］，但前列地爾對肺部微血管細(xì)胞的保護(hù)作用目前無明確研究。

本次研究參照陳小菊等［5］的方法，采用三氣培養(yǎng)箱，以3% O2-5%CO2-92%N2環(huán)境建立缺氧損傷模型，結(jié)果表明前列地爾對缺氧損傷HPMECs細(xì)胞具有保護(hù)作用。

VEGF與eNOS在缺氧導(dǎo)致的肺微血管損傷中發(fā)揮的作用不同：VEGF可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺動脈高壓的進(jìn)展；eNOS可以通過合成NO擴(kuò)張血管，抑制肺動脈高壓的進(jìn)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對VEGF的表達(dá)具有重要的意義，細(xì)胞缺氧培養(yǎng)幾小時內(nèi)VEGF的表達(dá)水平即可明顯增高；在體研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對心、腦、肝、腎等組織的VEGF表達(dá)具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用［11-12］。eNOS主要表達(dá)在大、中血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，故正常培養(yǎng)時，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS的表達(dá)水平較低；缺氧狀態(tài)下，組織的eNOS表達(dá)水平升高，小血管及微血管內(nèi)也可出現(xiàn)eNOS的表達(dá)［13］。故本次研究分別對eNOS、VEGF及二者比值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)前列地爾對缺氧損傷HPMECs中 VEGF、eNOS的過度表達(dá)具有抑制作用。其中eNOS的結(jié)果與既往的研究結(jié)果不相符，如包翠芳等［14］研究發(fā)現(xiàn)前列地爾可以下調(diào)缺氧大鼠大腦皮層的iNOS并上調(diào)eNOS，其原因可能是本次研究主要采用離體試驗(yàn)的方法，與在體實(shí)驗(yàn)存在差異。此外，缺氧可能主要通過改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導(dǎo)致eNOS表達(dá)反應(yīng)性升高［15］。

綜上所述，前列地爾可能通過上調(diào)HPMECs的eNOS/ VEGF發(fā)揮保護(hù)作用。

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Effects of Alprostadil on the Expression of VEGF and eNOS in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells with Hypoxia-induced Injury

WANG Youjun，ZHANG Lingmei（Dept.of Infectious，the Hospital Affiliated of Laiwu Iron and Steel Group Co.，Ltd.，Shandong Laiwu 271126，China）

OBJECTIVE：To study the effects of alprostadil on the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in human pulmonary microvascular endothelial cells（HPMECs）with hypoxia-induced injury.METHODS：HPMECs were divided into group A（normal cultural environment），group B（3%O2），group C（3% O2+15 μg/L alprostadil）and group D（3%O2+45 μg/L alprostadil）for 24 h culture.Cell morphology was observed；MTT method was conducted to detect cell activity（recorded by absorbance）；flow cytometry was adopted to detect apoptosis rate；Western blot was used to detect relative expressions of VEGF and eNOS in cells.RESULTS：Cell density in group A and D was relatively high，that in group B and C was low.Compared with group A，cell activities decreased and apoptosis rates increased in group B，C and D，expressions of VEGF and eNOS enhanced，eNOS/VEGF decreased（P＜0.05）.Compared with group B，cell activities increased in group C and D，VEGF expression decreased（P＜0.05）；apoptosis rate in group D decreased，eNOS expression decreased and eNOS/VEGF increased.Compared with group C，cell apoptosis rate was decreased in group D，VEGF expression decreased and eNOS/VEGF increased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Alprostadil maybe play effect on HPMECs with hypoxia-induced injury by up-regulating the expression level of eNOS/VEGF.

Alprostadil；Hypoxia-induced injury；Human pulmonary microvascular endothelial cells；Vascular endothelial growth factor；Endothelial nitric oxide synthase

R965

A

1001-0408（2016）25-3518-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.19

2016-03-07

2016-04-11）

＊副主任醫(yī)師。研究方向：傳染病的治療。E-mail：lgwangxinyan@126.com