心脈通片對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的防治作用及其機(jī)制研究

曹 杰，王巧黎，趙 宏，王 珍（1.青島市市立醫(yī)院藥劑科，山東青島 66000；.青島市中心醫(yī)療集團(tuán)藥劑科，山東青島 6604；3.青島市市立醫(yī)院中醫(yī)科，山東青島 66000）

心脈通片對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的防治作用及其機(jī)制研究

曹 杰1＊，王巧黎2，趙 宏2，王 珍3#（1.青島市市立醫(yī)院藥劑科，山東青島 266000；2.青島市中心醫(yī)療集團(tuán)藥劑科，山東青島 266042；3.青島市市立醫(yī)院中醫(yī)科，山東青島 266000）

目的：研究心脈通片對動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型大鼠的防治作用及其機(jī)制。方法：將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組（辛伐他汀片，2 mg/kg）和心脈通片高、中、低劑量組（500、250、125 mg/kg），每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均給予高脂飼料+ip維生素D3復(fù)制AS模型；造模同時(shí)各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)10周。檢測血清中膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）含量，光鏡下觀察主動(dòng)脈組織的病理變化，并測定主動(dòng)脈粥樣斑塊面積、內(nèi)膜厚度。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、ET-1含量及主動(dòng)脈粥樣斑塊面積、內(nèi)膜厚度均顯著增加，NO含量顯著降低（P＜0.01）；主動(dòng)脈有明顯粥樣硬化斑塊形成。與模型組比較，除心脈通片低劑量組大鼠血清中TC降低不顯著外，其余各給藥組大鼠上述指標(biāo)均明顯改善（P＜0.05或P＜0.01），并與劑量呈正相關(guān)；各給藥組大鼠主動(dòng)脈病變均有改善。結(jié)論：心脈通片對AS模型大鼠有一定的防治作用，其機(jī)制可能與減少脂質(zhì)沉積、減小動(dòng)脈粥樣斑塊形成的面積、改善NO/ET平衡、減輕內(nèi)皮損傷有關(guān)。

心脈通片；動(dòng)脈粥樣硬化；大鼠；內(nèi)皮損傷；機(jī)制

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是危害人類健康最嚴(yán)重的心血管疾病，其形成機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率和病死率均較高［1-2］。研制治療AS的有效藥物一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。心脈通片是由當(dāng)歸、丹參、葛根、毛冬青、夏枯草、牛膝、決明子、三七等10味中藥材經(jīng)提取后制成的薄膜包衣片，具有降壓、降脂的作用，臨床上多用于高血壓、高血脂的治療［3］。方中的當(dāng)歸、丹參、毛冬青、三七可疏導(dǎo)絡(luò)脈、活血化瘀，牛膝則通利血脈，葛根可使血活氣行、血運(yùn)暢通，決明子、夏枯草、槐花、鉤藤清熱息風(fēng)、平肝潛陽、解郁降壓、寧清竅、祛眩暈，故心脈通片具有改善血液循環(huán)、疏經(jīng)通絡(luò)和養(yǎng)護(hù)心臟等作用。有關(guān)研究已證實(shí)了該藥能夠有效調(diào)節(jié)血脂代謝、升高血清中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平［4-5］。但目前關(guān)于心脈通片對AS作用的研究報(bào)道較少，故本文擬以血清中膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）為指標(biāo)，并結(jié)合主動(dòng)脈病理變化，考察心脈通片對AS模型大鼠的防治作用及其可能的作用機(jī)制，為其用于AS的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AU5400型全自動(dòng)生化分析儀、BX43型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）；80-2型離心沉淀機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；Biomias2001型圖像分析系統(tǒng)（四川大學(xué)圖像圖形研究所）；臺式離心機(jī)（德國Hettich公司）。

1.2 藥品與試劑

心脈通片（廣州邦民制藥廠有限公司，批號：150102304，規(guī)格：0.3 g/片）；辛伐他汀片（廣州南新制藥有限公司，批號：3138930，規(guī)格：20 mg/片）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150102）；ET-1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國RD公司進(jìn)口分裝）；水為生理鹽水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級健康SD大鼠，48只，♂，體質(zhì)量200～240 g，由青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供［許可證號：SCXK（魯）2015-0022］。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組（辛伐他汀片，2 mg/kg，為成人臨床用量的等效劑量）和心脈通片高、中、低劑量組（500、250、125 mg/kg，分別由成人臨床用量的2、1、0.5倍劑量換算而得），每組8只。正常組大鼠每天給予普通飼料，其余各組大鼠每天給予高脂飼料（3%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、10%豬油、5%白糖、81.3%基礎(chǔ)飼料），并一次性ip維生素D3（60萬u/kg）復(fù)制AS模型［6］。造模同時(shí)，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物（以生理鹽水為溶劑），正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)10周。

2.2 血清中TC、TG、NO、ET-1含量測定

末次給藥后，各組大鼠禁食12 h（期間自由飲水），然后麻醉取血，將血液靜置2 h，以離心半徑為4.9 cm、3 000 r/min離心10 min，分離血清，－80 ℃冰箱保存，備用。采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中TC、TG含量；分別采用硝酸還原酶法和ELISA法測定血清中NO、ET-1含量，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 主動(dòng)脈組織病理形態(tài)變化觀察

取血完成后，股動(dòng)脈放血處死各組大鼠，取主動(dòng)脈，剝離主動(dòng)脈根部至弓部的動(dòng)脈，置于10%福爾馬林溶液中固定，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（4 μm厚），行蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)變化。

2.4 主動(dòng)脈粥樣斑塊面積、內(nèi)膜厚度測量

切取1～2 cm動(dòng)脈組織置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，再按常規(guī)蘇丹紅Ⅳ染色方法處理。在有脂質(zhì)浸潤的斑塊處主動(dòng)脈內(nèi)膜呈橘紅或鮮紅著色，以紅染部位面積占動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比表示動(dòng)脈粥樣斑塊形成程度，定性觀察大體標(biāo)本中AS斑塊形成的情況。用Biomias 2001圖像分析系統(tǒng)定量測定主動(dòng)脈粥樣斑塊面積大小，并計(jì)算病變斑塊面積占總面積的百分比（以面積比進(jìn)行結(jié)果分析），測量斑塊的厚度（最大厚度）［7］，從每張切片上隨機(jī)選取5個(gè)視野，測定內(nèi)膜厚度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中TC、TG、NO、ET-1含量測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、ET-1含量明顯增加，NO含量明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，除心脈通片低劑量組大鼠血清中TC含量減少不明顯外，其余各給藥組大鼠血清中TC、TG、ET-1含量明顯減少，NO含量明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠血清中TC、TG、NO、ET-1含量測定結(jié)果見表1。

ET-1，ng/L 49.09±2.19 109.4±10.30＊88.03±6.29#60.86±8.04##53.03±2.24##52.76±1.64##組別正常組模型組心脈通片低劑量組心脈通片中劑量組心脈通片高劑量組陽性組劑量，mg/kg 125 250 500 2 TC，mmol/L 1.24±0.44 12.96±4.12＊11.19±2.53 7.65±1.08#5.82±1.62##4.24±1.58##TG，mmol/L 0.72±0.18 5.33±1.44＊3.99±0.80#2.54±1.11#1.57±0.73##1.08±0.33##NO，μmol/L 20.62±8.21 8.12±1.95＊12.25±1.28##13.25±1.16#16.68±1.43#20.00±3.77##

3.2 各組大鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察結(jié)果

3.2.1 肉眼觀察結(jié)果 正常組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，未見任何斑點(diǎn)和條紋；模型組大鼠主動(dòng)脈管壁有大量黃白色脂樣物，形成片狀或脂質(zhì)條紋；心脈通片高、中、低劑量組大鼠主動(dòng)脈管壁有局限性的斑塊隆起，動(dòng)脈內(nèi)皮下仍有泡沫細(xì)胞形成，但病變較模型組減輕，且呈一定的劑量依賴性；陽性組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑度明顯好轉(zhuǎn)，內(nèi)膜未見增厚，中膜平滑肌排列整齊，但仍可見小的AS斑塊。

3.2.2 光鏡下觀察結(jié)果 正常組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)、完整而光滑，中膜平滑肌以及彈性纖維完整；模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，充滿大量吞噬脂質(zhì)的泡沫樣細(xì)胞，泡沫細(xì)胞部分區(qū)域突入管腔，形成纖維增生性斑塊；心脈通片高、中、低劑量組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮下僅有少量泡沫細(xì)胞沉著，病變程度較模型組明顯減輕；陽性組大鼠血管內(nèi)膜光滑、未見增厚，中膜平滑肌排列整齊，僅見局部內(nèi)皮粗糙，病變較心脈通片高劑量組略輕。各組大鼠主動(dòng)脈病理切片見圖1。

3.3 各組大鼠主動(dòng)脈斑塊面積、內(nèi)膜厚度測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈斑塊面積、內(nèi)膜厚度明顯增大（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和心脈通片各劑量組大鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積、內(nèi)膜厚度減?。≒＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積、內(nèi)膜厚度測定結(jié)果見表2。

內(nèi)膜厚度，μm 0.031±0.031 1.469±0.197＊1.162±0.245#0.660±0.055##0.240±0.078##0.135±0.040##組別正常組模型組心脈通片低劑量組心脈通片中劑量組心脈通片高劑量組陽性組劑量，mg/kg 125 250 500 2主動(dòng)脈粥樣斑塊面積，% 0.60±0.19 47.87±3.27＊39.25±5.25#26.50±6.27##12.62±2.66##10.75±4.62##

4 討論

AS是動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)及纖維成分沉積、平滑肌細(xì)胞及纖維增生并伴有壞死及鈣化的慢性進(jìn)行性疾?。?］。多種因素（包括血液湍流、切變壓、高脂血癥、高血壓、糖尿病等）均可引起內(nèi)皮損傷［9］。多數(shù)AS模型是建立在高脂飲食基礎(chǔ)上。此外，維生素D可損傷血管內(nèi)皮，使血漿脂蛋白易沉積在內(nèi)皮下層，增加脂質(zhì)對內(nèi)皮的損傷作用，故在本實(shí)驗(yàn)中作者采用高脂飲食輔以ip維生素D3的方法復(fù)制AS模型。他汀類藥物具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮的炎性反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊、改善血管內(nèi)皮功能、延緩AS進(jìn)程、保護(hù)神經(jīng)和抗血栓等作用［10］。辛伐他汀片長期使用不但可以調(diào)節(jié)血脂，還可以顯著阻滯AS的病變進(jìn)展，減少心血管事件和不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生［11］，療效確切，因此筆者選其為陽性藥物。

內(nèi)皮功能障礙是炎癥和血栓形成過程中所伴隨的血管反應(yīng)性損傷，在AS病程中具有非常重要的作用［12］。ET-1在內(nèi)皮功能障礙發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用；NO有非常重要的抗AS作用，其功能包括控制血管緊張度、抑制血小板聚集、抑制白細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖等［13］。血管內(nèi)皮損傷后，ET釋放增加，血管收縮增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生，引起粥樣斑塊形成和擴(kuò)大。NO生物學(xué)活性降低會(huì)導(dǎo)致ET相對增多，從而引起血管收縮、血管重塑和機(jī)能障礙［14］，故維持NO/ET平衡對維持內(nèi)皮功能正常有重要作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對AS的治療主要從抗凝、擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)血脂、溶栓、抗氧化等方面著手［15］。而心脈通片中當(dāng)歸、三七等成分均有活血化瘀的功效，能有效地抑制AS的形成。本研究結(jié)果顯示，給予心脈通片后大鼠血清中TC、TG、ET-1含量減少，NO含量增加，并呈一定的劑量依賴性。同時(shí)，大鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積約減少了26%～81%，光鏡下心脈通片高劑量組的病理改變與陽性組相似，這說明心脈通片對AS模型大鼠具有一定的保護(hù)作用。

綜上，心脈通片對模型大鼠的AS具有一定的防治作用，其機(jī)制可能與減少脂質(zhì)沉積、減小動(dòng)脈斑塊形成的面積、改善NO/ET平衡、減輕內(nèi)皮損傷有關(guān)。但由于本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，該藥確切的作用機(jī)制需要長期的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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Study on the Preventive and Therapeutic Effects of Xinmaitong Tablets on Model Rats with Atherosclerosis and Corresponding Mechanism

CAO Jie1，WANG Qiaoli2，ZHAO Hong2，WANG Zhen3（1.Department of Pharmacy，Qingdao Municipal Hospital，Shandong Qingdao 266000，China；2.Department of Pharmacy，Qingdao Center Medical Group，Shandong Qingdao 266042，China；3.Department of TCM，Qingdao Municipal Hospital，Shandong Qingdao 266000，China）

OBJECTIVE：To study the preventive and therapeutic effects of Xinmaitong tablets on model rats with atherosclerosis（AS）and corresponding mechanism.METHODS：48 rats were randomized into normal group，model group，positive group （simvastatin tablets，2 mg/kg）and the groups of high，medium and low-dose（500，250，125 mg/kg）Xingmaitong tablets，with 8 rats in each group.The rats in all groups except for the normal group were fed high fat diets and given vitamin D3ip for the establishment of AS model.Meanwhile，the rats in the drug administration groups were given corresponding drugs ig，while those in the normal group and the model group were given normal saline ig，once a day，for 10 consecutive weeks.The levels of cholesterol （TC），triacylglycerol（TG），nitric oxide（NO）and endothelin 1（ET-1）in serum were determined.The pathological change of the aorta tissue was observed under the light microscope，and the size of the aortic atherosclerotic plaque and intima thickness were measured.RESULTS：Compared to the normal group，the rats in the model group had significantly higher levels of TC，TG and ET-1 in serum，a markedly larger aortic atherosclerotic plaque，remarkably thicker intima and much lower level of NO（P＜0.01）；and obvious aortic atherosclerotic plaque formation was found.Compared to the model group，the above-mentioned indexes of the rats in all drug groups all improved obviously（P＜0.05 or P＜0.01），except that the decrease in TC in serum of the rats in the group of low-dose Xinmaitong tablets was not significant，which were positively correlated with dose；and the aortic lesion in drug groups was found to be improved.CONCLUSIONS：Xinmaitong tablets have certain preventive and therapeutic effect on the model rats with AS by a mechanism which may be related to the reduction in lipid deposition and the size of an atherosclerotic plaque，the improvement in NO/ET balance and the alleviation of an endothelial injury.

Xinmaitong tablets；Atherosclerosis；Rats；Endothelial injury；Mechanism

R285

A

1001-0408（2016）25-3499-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.13

2016-02-23

2016-06-15）（編輯：林 靜）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥理學(xué)。電話：0532-66981530。E-mail：1016160703@qq.com

副主任醫(yī)師，博士。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科。E-mail：37773887@qq.com