三葉蟲茶不同極性部位對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的改善作用研究Δ

章 瑩，黃 杰，肖 榕，嚴(yán) 婧，肖美鳳，文禮章，吳 萍，#（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 4008；.湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術(shù)研究中心，長沙 4008；.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲研究所，長沙408）

三葉蟲茶不同極性部位對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的改善作用研究Δ

章 瑩1＊，黃 杰2，肖 榕2，嚴(yán) 婧1，肖美鳳1，文禮章3，吳 萍1，2#（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2.湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術(shù)研究中心，長沙 410208；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲研究所，長沙410128）

目的：考察三葉蟲茶不同極性部位對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型大鼠的改善作用。方法：80%乙醇提取三葉蟲茶得到總浸膏，用水分散后依次用三氯甲烷、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，揮干得相應(yīng)部位浸膏。將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組（柳氮磺吡啶腸溶片，312.5 mg/kg）、三氯甲烷部位組（70 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（35 mg/kg）和水部位組（320 mg/kg）。除正常組外，其余各組大鼠均采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法復(fù)制UC模型。24 h后，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。觀察大鼠結(jié)腸組織病理變化，對結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）進(jìn)行評分；測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠發(fā)生明顯UC樣病變，CMDI評分升高；血清中SOD活性降低、MDA含量增加（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠病變程度減輕或好轉(zhuǎn)，CMDI評分降低，其中乙酸乙酯部位組、陽性組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；除三氯甲烷部位組外，其余各給藥組大鼠血清中SOD活性均升高、MDA含量均減少，其中乙酸乙酯部位組SOD活性以及陽性組SOD活性、MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：三葉蟲茶乙酸乙酯部位可減輕結(jié)腸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對TNBS致UC模型大鼠有明顯的改善作用。

三葉蟲茶；醇提物；潰瘍性結(jié)腸炎；超氧化物歧化酶；丙二醛；不同極性部位；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerativecolitis，UC）是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸慢性非特異性、炎癥性疾病，其病變局限于大腸黏膜及其下層、乙狀結(jié)腸和直腸，也可至降結(jié)腸，甚至整個結(jié)腸，癥狀有腹痛、血便、里急后重、嘔吐等，病程長且反復(fù)發(fā)作［1］。臨床多采用藥物治療（常用藥物為氨基水楊酸類、類固醇激素類和免疫抑制劑等）［2］和手術(shù)治療兩種方式?；瘜W(xué)藥治療副作用大，不適合長期治療，頻繁手術(shù)又會增加患者痛苦。而中醫(yī)藥治療UC旨在改善結(jié)腸部位的炎癥狀態(tài)，調(diào)理胃、脾、腎功能，提高免疫力［3］，療效顯著且副作用小，具有較大的開發(fā)應(yīng)用價值。

三葉蟲茶由米縞螟（Aglossa dimidiata Haworth）幼蟲食取三葉海棠植物后的排泄糞粒經(jīng)加工后制得，作為一種傳統(tǒng)民間飲品和中藥，集食用安全、營養(yǎng)、保健、藥用于一體，具有健脾胃、促消化、抗氧化、降血糖、降血壓、抗炎、抑菌等藥理作用［4-5］。已有研究表明，三葉蟲茶水提物和三葉蟲茶中黃酮類化合物白楊素苷能明顯減少炎性細(xì)胞浸潤，對UC大鼠有明顯改善作用［6-8］。在本實驗中筆者擬復(fù)制UC大鼠模型，采用80%乙醇提取三葉蟲茶制備浸膏，再用不同極性溶劑進(jìn)行萃取得到三葉蟲茶不同極性部位，以大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量為評價指標(biāo)，并結(jié)合大鼠結(jié)腸病理變化，考察三葉蟲茶醇提物不同極性部位對UC大鼠的改善作用。

1 材料

1.1 儀器

ELx800酶標(biāo)儀（美國Bio Tex公司）；AE200S電子分析天平［瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；TD25-WS低速自動平衡離心機（上海巴玖實業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

三葉蟲茶（由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲研究所所長文禮章教授提供并鑒定，批號：201312）；5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，上海源葉生物科技有限公司，批號：2508-19-2）；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP，上海中西三維藥業(yè)有限公司，批號：H31020450，規(guī)格：0.25 g/片）；總SOD活性檢測、MDA含量檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0101、S0131）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SD大鼠60只，♀♂各半，鼠齡6～7周，體質(zhì)量（200± 20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司［動物使用合格證號：SCXK（湘）2011-0003］。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水、飲食。

2 方法

2.1 三葉蟲茶不同極性部位的提取

取三葉蟲茶2 kg，以8倍量80%乙醇提取3次，提取溫度為80 ℃，每次1 h，合并3次提取液，回收乙醇，將提取液體積濃縮至2.5 L，50 ℃水浴揮干，得總浸膏，冷凍保存。取浸膏用適量水溶解后，依次用三氯甲烷（V三氯甲烷∶V水溶液=1∶1）和乙酸乙酯（V乙酸乙酯∶V水溶液=1∶1）分別萃取3次，依次回收有機試劑和水提取物，50 ℃水浴揮干，得相應(yīng)部位浸膏。分別稱質(zhì)量，得三氯甲烷部位干浸膏14.5 g，得率為0.725%；乙酸乙酯部位干浸膏6.9 g，得率為0.345%；水部位干浸膏191.2 g，得率為9.56%。

2.2 分組、造模與給藥

將60只大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、陽性組（SASP，312.5 mg/kg）、三氯甲烷部位組（70 mg/kg，以干浸膏計，下同）、乙酸乙酯部位組（35 mg/kg）和水部位組（320 mg/kg），每組10只。造模前禁食不禁水24 h，正常組大鼠給予生理鹽水（0.8 ml/只），其余各組大鼠給予2.5%TNBS溶液+50%乙醇（0.8 m/只）復(fù)制UC模型。大鼠出現(xiàn)行為活動遲緩、食欲不佳、血便或糞便稀軟則提示造模成功［9］。造模后第2天開始，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，其余各給藥組ig相應(yīng)藥物（均以生理鹽水為溶劑），給藥體積均為5 ml/kg，連續(xù)14 d。每天給藥時記錄大鼠一般情況。本實驗中SASP給藥劑量為成人臨床給藥劑量的6.25倍，三葉蟲茶不同部位給藥劑量按生藥量計均為10 g/kg［7］。

2.3 取材與病理變化觀察

末次給藥后禁食不禁水24 h，各組大鼠均ip 2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉［10］，使用10 ml促凝真空采血管腹主動脈取血，以離心半徑為3 cm、4 000 r/min離心5 min，分離血清，置于EP管中，－80 ℃凍存。大鼠取血后固定、切開腹腔，從肛門以上2 cm處，向上截取結(jié)腸8 cm，4 ℃生理鹽水灌注清洗干凈，濾紙吸干。肉眼觀察結(jié)腸病理變化，并記錄結(jié)果。將結(jié)腸分成兩段，一段置于－80 ℃冰箱冷凍保存；另一段用4%多聚甲醛液固定，48 h后常規(guī)方法制備石蠟切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)腸病理變化。

2.4 大鼠結(jié)腸黏膜損傷評價

參照文獻(xiàn)［11］中評分標(biāo)準(zhǔn)并加以調(diào)整，按照有無潰瘍及潰瘍長度（無潰瘍記為0分；潰瘍長度＜3 mm記為1分；潰瘍長度＞3 mm記為2分）、炎癥程度（無炎癥：結(jié)腸組織腸管光滑、顏色紅潤、無明顯充血，記為0分；輕度炎癥：結(jié)腸組織局部充血、呈鮮紅色，記為1分；中度炎癥：結(jié)腸組織出現(xiàn)水腫、病變處腫脹變粗、呈透明狀，記為2分；嚴(yán)重炎癥：結(jié)腸組織有滲出物、黏膜增生、腸腔狹窄、病變處與周圍結(jié)腸組織粘連，記為3分）、損害深度（無損傷記為0分；至黏膜下層記為1分；至肌層記為2分；至漿膜層記為3分）這3項指標(biāo)對大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）進(jìn)行評分分析，最終得分為3項得分的總和。

2.5 大鼠血清中SOD活性和MDA含量測定

每組隨機抽取6只大鼠的血清樣本，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，測定血清中SOD活性和MDA含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

正常組大鼠活潑，毛發(fā)柔順、潔白且緊密，飲食、排泄均正常。造模后，各組大鼠均有排血便、拉稀、精神萎靡的現(xiàn)象，并且進(jìn)食減少。給藥3～8 d后，造模大鼠毛發(fā)變黃、稀疏，糞便稀軟，此期間體質(zhì)量較造模前有所下降。給藥10 d后，模型組大鼠毛發(fā)枯黃、稀疏，糞便稀軟；陽性組大鼠毛發(fā)最先變亮，糞便呈顆粒狀；其次為乙酸乙酯部位組，大鼠毛色日漸變亮，糞便開始結(jié)成顆粒；水部位組和三氯甲烷部位組改善情況不如乙酸乙酯部位組理想，其中三氯甲烷部位組大鼠有出現(xiàn)行動緩慢、腹部突出、排泄困難的情況。

3.2 病理觀察結(jié)果

3.2.1 肉眼觀察結(jié)果 正常組大鼠結(jié)腸無潰瘍形成；模型組大鼠腸管水腫，腸壁薄，腸壁外有粘連，局部壞死脫落，有潰瘍形成；乙酸乙酯部位和陽性組大鼠腸管黏膜皺襞紋理清晰、潰瘍少，有好轉(zhuǎn)趨勢或未見潰瘍處；三氯甲烷部位和水部位組大鼠結(jié)腸大部分膨脹，腸壁變薄，腸外壁粘連，水腫明顯。

3.2.2 顯微鏡下觀察結(jié)果 正常組大鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰完整，黏膜較為完整，無明顯潰瘍；模型組、三氯甲烷部位組與水部位組大鼠結(jié)腸上皮黏膜脫落、杯狀細(xì)胞減少，固有層中淋巴細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞浸潤、有水腫，黏膜脫落形成的潰瘍壞死、腺體空泡樣；乙酸乙酯部位組大鼠結(jié)腸上皮黏膜有輕度脫落，整體較為完整，杯狀細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞開始減少，浸潤現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，腺體增生，有修復(fù)跡象；陽性組大鼠結(jié)腸上皮基本完整，出現(xiàn)纖維變，腺體逐漸修復(fù)，淋巴組織有輕微增生現(xiàn)象。各組大鼠結(jié)腸病理切片觀察結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸病理切片觀察結(jié)果（HE染色，×200）Fig 1 The colonic pathological sections of rats in all groups （HE staining，×200）

3.2.3 大鼠CMDI評分結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠CMDI評分顯著升高（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，各給藥組大鼠CMDI評分降低，其中陽性組、乙酸乙酯部位組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明三葉蟲茶不同部位對UC大鼠結(jié)腸黏膜病變有一定的改善，且以乙酸乙酯部位最為明顯。各組大鼠CMDI評分結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠CMDI評分結(jié)果（±s，n=10）Tab 1 The CMDI score of rats in all groups（±s，n=10）

表1 各組大鼠CMDI評分結(jié)果（±s，n=10）Tab 1 The CMDI score of rats in all groups（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

CMDI評分0.0±0.0 8.2±1.6＊＊2.9±1.0##6.2±1.1 4.1±1.3##6.1±1.7組別正常組模型組陽性組三氯甲烷部位組乙酸乙酯部位組水部位組劑量，mg/kg 312.5 70 35 320

3.3 大鼠血清中SOD活性和MDA含量測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低、MDA含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，除三氯甲烷部位組外其余各給藥組大鼠血清中SOD活性均有不同程度升高、MDA含量均有不同程度減少，其中陽性組大鼠血清中SOD活性和MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），乙酸乙酯部位組大鼠血清中SOD活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量測定結(jié)果見表2。

4 討論

目前認(rèn)為UC的發(fā)病機制可能與遺傳、環(huán)境、免疫、微生物等因素有關(guān)［12］，而UC的發(fā)生發(fā)展主要是由免疫因素引起，自由基損傷是主要的研究方向［13］。自由基包括氧自由基（Oxygen free radicals，OFR）和一氧化氮（NO）自由基。OFR是一類能引起脂質(zhì)過氧化從而損傷細(xì)胞和組織的含氧基團(tuán)，氧化作用強。正常情況下機體產(chǎn)生的SOD酶系能及時、有效地清理少量OFR，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，從而發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用［14］，此時氧化與抗氧化狀態(tài)平衡。當(dāng)免疫功能異常、發(fā)生非特性炎癥時，OFR和NO等自由基大量產(chǎn)生，同時內(nèi)源性SOD耗竭速度大于自由基生成速度，造成SOD活性下降，因此常以SOD活性反映細(xì)胞功能和機體炎癥情況。MDA是脂質(zhì)過氧化代謝終產(chǎn)物，臨床上因直接測定OFR含量十分困難，遂以MDA含量間接反映炎癥時的OFR水平，評定脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強弱程度，MDA含量越高，表明炎癥越嚴(yán)重。

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量測定結(jié)果（x± s，n=6）Tab 2 The activities of SOD and the content of MDA in serum of rats in all groups（±s，n=6）

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量測定結(jié)果（x± s，n=6）Tab 2 The activities of SOD and the content of MDA in serum of rats in all groups（±s，n=6）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

MDA，μmol/mg 22.93±8.40 48.41±5.33＊＊26.71±8.87##49.16±9.00 40.82±3.34 46.69±6.23組別正常組模型組陽性組三氯甲烷部位組乙酸乙酯部位組水部位組SOD，U/mg 95.00±6.31 44.69±5.50＊＊62.41±8.64##43.27±9.58 50.94±3.50#45.93±4.82

本研究結(jié)果顯示，各給藥組大鼠CMDI評分較模型組均有不同程度降低，其中三葉蟲茶乙酸乙酯部位組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明乙酸乙酯部位組大鼠的潰瘍損傷較小。除三氯甲烷部位組外，其余各給藥組大鼠血清中SOD活性較模型組均有不同程度升高，其中乙酸乙酯部位組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但是乙酸乙酯部位組大鼠血清中MDA含量較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能與該部位有效成分含量以及用藥時間長短有關(guān)。從大鼠一般情況看，三葉蟲茶乙酸乙酯部位作用后UC大鼠受到的損傷（如毛色、糞便、潰瘍程度及糜爛程度等）也得到改善。

綜上所述，三葉蟲茶乙醇提取物的乙酸乙酯部位可減輕結(jié)腸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對UC大鼠有明顯改善作用。但該部位具體是何種成分起效，還有待進(jìn)一步研究證實。

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Study on the Improvement Effects of Different Polar Parts of Sanye Chongcha on Model Rats with Ulcerative Colitis

ZHANG Ying1，HUANG Jie2，XIAO Rong2，YAN Jing1，XIAO Meifeng1，WEN Lizhang3，WU Ping1，2（1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.Hunan Research Center of Engineering Technology for Rapid Test and Removal of Toxic and Harmful Substances in Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.Institute of Entomology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

OBJECTIVE：To explore the improvement effect of different polar parts of Sanye Chongcha on models rat with ulcerative colitis（UC）.METHODS：The total extract was obtained from Sanye Chongcha by extraction with 80%ethanol，and dispersed in water，from which the extracts of corresponding parts were obtained after extraction successively with trichloromethane and ethyl acetate and drying.60 rats were randomized into normal group，model group，positive group（sulfasalazine enteric-coated tablets，312.5 mg/kg），trichloromethane extraction part group（70 mg/kg），ethyl acetate extraction part group（35 mg/kg）and water extraction part group（320 mg/kg）.The rats except for normal group received 2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution（TNBS）to establish UC model.24 h later，the rats in the drug administration groups were given corresponding drugs ig，while those in normal group and model group were given normal saline ig，once a day，for 14 consecutive days.For the rats，the pathological change of the colon tissue was observed，and the colon mucosa damage index（CMDI）was scored；the activity of superoxide dismutase（SOD）and the content of malondialdehyde（MDA）in serum were determined.RESULTS：Compared to normal group，the rats in model group had obvious UC-like lesion，higher CMDI，lower activity of SOD and higher content of MDA in serum（P＜0.01）.Compared to model group，the rats in the drug administration groups had the lesion which became less serious or improved and had lower CMDI score，among which those of the ethyl acetate extraction part group and the positive group demonstrated a statistically significant difference（P＜0.01）；and the rats in the drug administration groups except for trichloromethane extraction part group had higher activity of SOD and lower content of MDA in serum，among which the activity of SOD of the ethyl acetate extraction part group and the activity of SOD and content of MDA of the positive group demonstrated a statistically significant difference（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：The ethyl acetate extraction part of Sanye Chongcha can reduce colonic lipid peroxi-dation and thus has obvious improvement effect on the rats with UC caused by TNBS.

Sanye Chongcha；Alcohol extract；Ulcerative colitis；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Different polar parts；Rats

R285

A

1001-0408（2016）25-3481-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.08

2015-12-07

2016-05-26）

（編輯：林 靜）

湖南省科技廳科研條件創(chuàng)新專項（No.2012TT2012）；湖南省教育廳重點項目（No.14A109）；湖南省2013年科技基本建設(shè)項目（No.湘發(fā)改高技〔2013〕1199號）；湖南省教學(xué)改革研究項目（No.2012-202）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師基金項目（No.99820001134）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（No.CX2015B336）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目（No.2015CX19）

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析。E-mail：zhangyingagnes@ 163.com

副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥物分析。E-mail：545371528@qq.com