參麥注射液活性成分在正常和心肌缺血Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究Δ

唐 思，楊 瑞，張世良，董曉茜，李國信#，夏素霞，朱婉玲（.遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實驗室，沈陽 0034；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 003）

參麥注射液活性成分在正常和心肌缺血Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究Δ

唐 思1＊，楊 瑞1，張世良1，董曉茜1，李國信1#，夏素霞1，朱婉玲2（1.遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實驗室，沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110032）

目的：研究參麥注射液活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re在正常和心肌缺血Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)。方法：取6只Beagle犬sc鹽酸異丙腎上腺素（1.1 mg/kg）以復(fù)制心肌缺血模型（模型組），另取6只犬sc等體積生理鹽水（2.2 ml/kg）作為對照組。兩組犬分別于第1天上午8：00、下午13：00和第2天上午8：00給藥。第2天給藥后1 h，各組犬iv參麥注射液（1.6 ml/kg），在1 h左右滴注完成。各組犬于iv開始后0、0.25、0.5、0.75、1（iv結(jié)束）、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h取血。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的血藥濃度，WinNonlin 6.3軟件計算藥動學(xué)參數(shù)并進(jìn)行比較。結(jié)果：人參皂苷Re在模型組犬體內(nèi)的t1/2為（2.69±1.12）h，AUC0-24 h為（2 060.78±812.18）h·μg/L，Vz為（46.16±20.98）ml，CL為（9.02±4.45）ml/h；與正常組比較，AUC0-24 h顯著升高，Vz、CL顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而兩組犬人參皂苷Rg1的藥動學(xué)參數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論：心肌缺血會影響B(tài)eagle犬體內(nèi)人參皂苷Re的消除，對人參皂苷Rg1藥動學(xué)過程無明顯影響。

參麥注射液；心肌缺血模型；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；Beagle犬；藥動學(xué)

參麥注射液的主要成分為紅參、麥冬，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈之功效，臨床廣泛用于氣陰兩虛型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒細(xì)胞減少癥等疾病的治療［1-3］。參麥注射液中紅參為君藥，主要成分為人參皂苷，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re含量穩(wěn)定，是參麥注射液的標(biāo)志性成分之一。目前，多項研究報道了參麥制劑的藥動學(xué)研究［4-6］，但對不同模型下參麥注射液的藥動學(xué)比較的研究尚未見文獻(xiàn)報道。因此，在本研究中筆者探討了參麥注射液活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re在正常和心肌缺血Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)過程，旨在為其臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

6410型三重四級桿串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）儀，包括電噴霧離子源、Quantitative Analysis B.01.04數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SIGMA3-18k低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水機(jī)（德國默克公司）；DW-86L836超低溫保存箱（青島海爾公司）；MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：1308261，規(guī)格：10 ml/支；1 ml參脈注射液中含人參皂苷Rg1184.86 μg、人參皂苷Re 105.59 μg）；鹽酸異丙腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：131001，規(guī)格：2 ml∶1 mg）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1209124，規(guī)格：1 ml/支）。人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201128）、人參皂苷Re對照品（批號：110754-201324）、內(nèi)標(biāo)地西泮對照品（批號：171225-200302）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純）均購自德國默克公司。

1.3 動物

普通級Beagle犬12只，♂♀各半，體質(zhì)量（8～10）kg，由北京市沙河通利試驗動物養(yǎng)殖場提供，許可證號：SCXY（京）2010-0004。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18Synergi POLAR-RP柱（30 mm×2.16 mm，3.5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15%B→30%B；5～18 min，30%B；18～23 min，30% B→100%B；23～25 min，100%B）；流速為0.3 ml/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；氣體流量為9 L/min；氣體溫度為350 ℃；霧化壓力為276 kPa；毛細(xì)管電壓為4 000 V；掃描方式為選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子方式檢測；用于定量的離子m/z分別為823.5→643.5（人參皂苷Rg1）、969.5→789.5（人參皂苷Re），碎裂電壓分別為350、320 V，碰撞能量（CE）分別為40 V、45 V；內(nèi)標(biāo)m/z為285.0→193.0，碎裂電壓為165 V，CE為30 V；掃描時間均為200 ms。

2.2 貯備液的制備

準(zhǔn)確稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和內(nèi)標(biāo)對照品各10 mg，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得1 mg/ml的貯備液，4 ℃保存，使用時用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度即可。

2.3 分組、造模與給藥

采用分層隨機(jī)法，將12只Beagle犬分為心肌缺血模型組和正常組，每組6只，♂♀各半。心肌缺血模型組犬sc鹽酸異丙腎上腺素（1.1 mg/kg，劑量選擇依據(jù)文獻(xiàn)［7-9］），正常組犬sc等體積生理鹽水（2.2 ml/kg）作為對照。兩組犬分別于第1天上午8：00、下午13：00和第2天上午8：00給藥。第1次給藥前16 h各組犬禁食不禁水，第2天給藥后1 h，各組犬iv參麥注射液（1.6 ml/kg，劑量選擇依據(jù)文獻(xiàn)［10］），在1 h左右滴注完成。各組犬于iv開始后0、0.25、0.5、0.75、1（iv結(jié)束）、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h靜脈采血5 ml于肝素化離心試管中，以離心半徑為8 cm、3 500 r/min離心10 min分離血漿，于－70 ℃冰箱保存，備用。

2.4 血漿樣品處理

精密吸取血漿200 μl，置于2 ml空白離心管中，加入內(nèi)標(biāo)貯備液10 μl，渦旋混勻30 s；加入乙腈400 μl，渦旋混勻3 min；以離心半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min。取上清液于2 ml空白離心管中，在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑偌尤肓鲃酉?00 μl復(fù)溶，渦旋2 min，以離心半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液10 μl進(jìn)樣分析。

2.5 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re測定的方法學(xué)考察

按照相關(guān)方法考察人參皂苷Rg1、人參皂苷Re測定方法的回歸方程與線性范圍、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用WinNonlin 6.3藥動學(xué)軟件對犬體內(nèi)的藥-時曲線進(jìn)行非房室模型擬合，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對兩組犬的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 專屬性考察結(jié)果 檢測方法為課題組前期研究的方法［5］。取“2.2”～“2.4”項下溶液按“2.1”項下方法進(jìn)樣測定，結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在選定的色譜和質(zhì)譜條件下專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 LC-MS/MS色譜圖Fig 1 LC-MS/MS chromatogram

3.1.2 線性范圍、回收率、精密度及基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re線性范圍分別為0.64～509.00 μg/L（r= 0.996 7）、0.62～501.00 μg/L（r=0.997 8），定量限（信噪比為10）分別為0.64、0.62 μg/L；日間和日內(nèi)精密度均小于15% （n=18）；提取回收率均大于85%（RSD＜15%，n=9）；基質(zhì)效應(yīng)在90%～110%之間（RSD＜15%，n=18），結(jié)果見表1。

3.1.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果 將含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的血漿樣品分別進(jìn)行室溫（25 ℃）放置6 h、反復(fù)凍融、長期冷凍60 d考察。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re在上述條件下均能保持穩(wěn)定，RSD均小于15%（n=18）。

3.2 藥動學(xué)研究

兩組犬分別于各時間點測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re血藥濃度，平均藥-時曲線見圖2。采用WinNonlin 6.3軟件，按非房室模型進(jìn)行處理，計算藥動學(xué)參數(shù)，見表2。

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果（±s）Tab 1 Results of precision and recovery tests（±s）

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果（±s）Tab 1 Results of precision and recovery tests（±s）

組分人參皂苷Rg1人參皂苷Re加入量，μg/L 1.28 50.90 407.20 1.24 50.10 400.80日內(nèi)精密度測得量，μg/L 1.00±0.04 52.18±3.03 368.49±32.79 1.05±0.05 49.36±2.65 402.20±11.84 RSD，% 4.48 5.80 8.90 5.10 5.36 2.95日間精密度測得量，μg/L 1.03±0.07 51.99±2.50 401.59±36.49 1.00±0.07 51.98±3.36 398.91±21.55 RSD，% 6.85 4.80 9.09 6.79 6.46 5.40提取回收率，% 86.63±8.23 100.24±2.27 95.27±6.98 96.22±3.60 94.54±7.86 100.97±6.21基質(zhì)效應(yīng)，% 103.67±5.96 104.06±6.31 101.49±4.05 108.11±3.84 94.16±3.84 99.91±5.12

圖2 兩組犬人參皂苷Rg1、人參皂苷Re平均藥-時曲線Fig 2 Mean drug concentration-time curves of ginsenoside Rg1and ginsenoside Re of dogs in 2groups

表2 兩組犬人參皂苷Rg1、人參皂苷Re藥動學(xué)參數(shù)比較（x± s，n=6）Tab 2 Comparison of the pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1and ginsenoside Re of dogs between 2groups（±s，n=6）

表2 兩組犬人參皂苷Rg1、人參皂苷Re藥動學(xué)參數(shù)比較（x± s，n=6）Tab 2 Comparison of the pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1and ginsenoside Re of dogs between 2groups（±s，n=6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05Note：vs.the normal group，＊P＜0.05

模型組2.69±1.12 2.00±1.10 2 060.78±812.18＊2 098.23±855.41＊46.16±20.98＊9.02±4.45＊4.50±1.23 4.66±1.21參數(shù)t1/2，h tmax，h AUC0-24，h·μg/L AUC0-∞，h·μg/L Vz，ml CL，ml/h MRT0-24 h，h MRT0-∞，h人參皂苷Rg1正常組2.41±2.21 0.83±0.29 437.45±206.63 443.91±206.48 178.56±225.53 42.49±17.42 0.95±0.31 1.20±0.61模型組1.04±0.55 1.16±0.41 363.58±138.82 372.74±138.02 76.03±57.83 49.39±21.84 1.31±0.35 1.47±0.42人參皂苷Re正常組2.44±0.98 0.81±0.31 460.79±173.51 471.51±174.42 142.55±87.86 38.73±15.96 1.69±0.46 2.02±0.66

結(jié)果，正常組與模型組Beagle犬在iv參麥注射液后，人參皂苷Rg1的主要藥動學(xué)參數(shù)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而模型組犬人參皂苷Re的t1/2為（2.69±1.12）h，AUC0-24 h為（2 060.78±812.18）h·μg/L，Vz為（46.16±20.98）ml，CL為（9.02±4.45）ml/h；與正常組比較，模型組犬人參皂苷Re的AUC0-24 h顯著升高，Vz、CL顯著降低（P＜0.05）。

4 討論

相關(guān)研究報道，大劑量注射異丙腎上腺素可致心肌收縮過快、收縮力過大、冠脈充盈不足、心肌耗氧量大大超過供氧量，導(dǎo)致心肌缺血［7-9］。筆者前期進(jìn)行了預(yù)實驗，篩選異丙腎上腺素制備心肌缺血模型的用量，最終確定sc鹽酸異丙腎上腺素1.1 mg/kg復(fù)制心肌缺血模型。另外，根據(jù)參麥注射液臨床用藥的劑量，按單位體質(zhì)量計算劑量［10］，經(jīng)換算后給予Beagle犬參麥注射液劑量確定為1.6 ml/kg。

本研究首次對參麥注射液在心肌缺血與正常Beagle犬中的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果，人參皂苷Rg1在模型組犬體內(nèi)藥動學(xué)無顯著變化。但相關(guān)研究報道，人參皂苷Rg1對心肌缺血有一定治療作用［11-12］，提示后續(xù)研究可結(jié)合藥效研究、擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1治療心肌缺血的療效與機(jī)制。

相關(guān)研究報道，人參皂苷Re可以抑制急性缺血再灌流誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［13-14］。本研究表明人參皂苷Re在模型組犬體內(nèi)的Vz、CL顯著低于正常組，使血藥濃度、AUC0-24 h和AUC0-∞顯著高于正常組，這可能是造模后Beagle犬的組織分布、代謝酶等發(fā)生了病理變化原因?qū)е碌模膊慌懦怯捎趯嶒炗肂eagle犬?dāng)?shù)量少或是個體差異造成的。

綜上所述，心肌缺血會影響B(tài)eagle犬體內(nèi)人參皂苷Re的消除；對人參皂苷Rg1藥動學(xué)過程無明顯影響。后續(xù)研究應(yīng)盡可能找出與之相關(guān)活性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，并結(jié)合藥理、藥效進(jìn)行更全面的研究。

［1］余健，辛艷飛，宣堯仙.參麥注射液藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（4）：662.

［2］徐成恒.參麥注射液的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2011，32（6）：839.

［3］曹旭東，丁志山，陳建真.參麥注射液藥理及臨床研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（3）：104.

［4］李國信，唐思，夏素霞，等.生脈拆方系列注射液中人參皂苷Rg1和Re藥代動力學(xué)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（11）：2 310.

［5］夏素霞，李國信，姜春梅，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定生脈注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和五味子醇甲在健康人血漿的濃度［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27 （10）：789.

［6］李國信，姜春梅，夏素霞，等.生脈注射液與參麥注射液在健康人體的藥代動力學(xué)［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（6）：432.

［7］孫波，高海成，黃秀英，等.冠脈結(jié)扎法與給藥法制作大鼠心肌缺血模型的比較［J］.實驗動物科學(xué)，2010，27（5）：16.

［8］楊勇，容蓉，陳明強(qiáng)，等.異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠急性心肌缺血模型的方法比較［J］.中藥藥理與臨床，2010，26（5）：153.

［9］李晶華，肖鐵卉，馬靜，等.芪丹通脈片對犬慢性心肌缺血預(yù)防作用及其機(jī)制［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29 （4）：52.

［10］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（9）：1 069.

［11］來方遠(yuǎn)，潘永明，艾秀鋒，等.人參皂苷Rg1對急性心肌缺血豚鼠心電圖的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（17）：2 529.

［12］來方遠(yuǎn)，潘永明，艾秀鋒，等.人參皂苷Rg1對豚鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22 （4）：390.

［13］高瑩，楊積武，王艷春，等.人參皂苷Re對大鼠心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡及Caspase-3的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13（2）：124.

［14］石楸鳴.人參皂苷的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2010，21（31）：2 967.

Pharmacokinetics Study of the Active Ingredients of Shenmai Injection in Normal Beagle Dogs and Those with Myocardial Ischemia

TANG Si1，YANG Rui1，ZHANG Shiliang1，DONG Xiaoqian1，LI Guoxin1，XIA Suxia1，ZHU Wanling2（1.Laboratory of Clinical Pharmacology，Liaoning Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110034，China；2.College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics of the active ingredients of Shenmai injection，including ginsenoside Rg1and ginsenoside Re，in normal Beagle dogs and those with myocardial ischemia.METHODS：6 Beagle dogs were given isoproterenol hydrochloride（1.1 mg/kg）sc to establish the model of myocardial ischemia（model group）.Another 6 Beagle dogs were given isometric normal saline（2.2 ml/kg）sc as controls group.The two groups of dogs respectively received corresponding drugs sc at 8：00 am and 13：00 pm on day 1 and at 8：00 am on day 2.Each group of dogs were given Shenmai injection（1.6 ml/kg）iv 1 h after administration on day 2，and such intravenous drip lasted for about 1 h.Blood was collected from each group 0，0.25，0.5，0.75，1（the end of iv），1.5，2，3，4，6，8，12 and 24 h from the start of iv.Liquid chromatography-mass spectrometry was adopted to determine the concentrations of ginsenoside Rg1and ginsenoside Re in blood，and WinNonlin 6.3 was used to calculate pharmacokinetic parameters for comparison.RESULTS：For ginsenoside Re in the dogs of the model group，t1/2was（2.69±1.12）h，AUC0-24 hwas（2 060.78±812.18）h·μg/L，Vzwas（46.16±20.98）ml and CL was（9.02±4.45）ml/h；compared to the normal control group，AUC0-24 hwas much greater and Vzand CL were significantly lower，showing a statistically significant difference（P＜0.05）.No significant difference in the pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1was shown between 2 groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Myocardial ischemia may affect the removal of ginsenoside Re in Beagle dogs，but has no effect on the pharmacokinetic process of ginsenoside Rg1.

Shenmai injection；Myocardial ischemia model；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Beagle dogs；Pharmacokinetics

R284.1；R917

A

1001-0408（2016）25-3475-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.06

2015-11-04

2016-07-18）

（編輯：劉明偉）

國家科技重大專項課題（No.2012ZX09303017）；臨床重點?？平ㄔO(shè)項目資助（2013年）；國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點學(xué)科（2009年）；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者青藍(lán)工程（2013年）

＊副研究員，碩士。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：024-86803043。E-mail：tangsi81@163.com

主任醫(yī)師，博士。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：024-86803043。E-mail：syyljdlgx024@126.com