大鼠血漿中重組人鈣調(diào)磷酸酶B亞基的ELISA雙抗體夾心法測定及其藥動學(xué)研究Δ

韓克勝，謝學(xué)立，田樹紅，邢桂蘭，符 江，邢 俊，林春華，譚 鵬，邵繼平#（1.海口奇力制藥股份有限公司，?？?57016；.海南省藥物臨床前藥理毒理學(xué)研究重點實驗室，?？?571199）

大鼠血漿中重組人鈣調(diào)磷酸酶B亞基的ELISA雙抗體夾心法測定及其藥動學(xué)研究Δ

韓克勝1＊，謝學(xué)立2，田樹紅2，邢桂蘭2，符 江2，邢 俊2，林春華2，譚 鵬2，邵繼平2#（1.?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?，?？?570216；2.海南省藥物臨床前藥理毒理學(xué)研究重點實驗室，?？?571199）

目的：建立大鼠血漿中重組人鈣調(diào)磷酸酶B亞基（rhCNB）的測定方法，并研究其藥動學(xué)特征。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）雙抗體夾心法，將1μg/ml的rhCNB單克隆抗體mAb包板，加入待測樣品，再加入rhCNB多克隆抗體pAb（稀釋比例為1∶5 000）和辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記抗免疫球蛋白G（IgG）（稀釋比例為1∶10 000），以四甲基聯(lián)苯胺顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度（OD值）。測定6只大鼠iv 2.5 mg/kg rhCNB后2、15、30、60、120、240、480、720 min的血藥濃度，以BAPP 3.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：rhCNB檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.195～12.5 ng/ml（r2=0.995 0），定量下限為0.195 ng/ml，準(zhǔn)確度為97.300%～103.622%（RSD均小于7.5%，n=6）；批內(nèi)、批間和反復(fù)凍融3次的RSD均不大于8.5%（n=6、18、15）。該藥在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征符合二室模型，AUC0-720 min為173.038 mg·min/L、t1/2為94.62 min。結(jié)論：建立的方法特異性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度及精密度好，可用于生物樣品中rhCNB的定量檢測和藥動學(xué)研究。

rhCNB多肽；酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法；大鼠；定量檢測；藥動學(xué)

肝癌（Liver cancer）是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率僅次于胃癌和食道癌，嚴(yán)重威脅了人民的健康和生命，其晚期患者往往無有效藥物可用。目前臨床上大多數(shù)抗肝癌藥缺乏組織選擇性，在發(fā)揮療效的同時也產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，常見的有消化道反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)等。因此，尋找高效低毒的新型抗肝癌藥勢在必行。

鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CN）是目前唯一一種依賴鈣（Ca）/鈣調(diào)素（CaM）的蛋白磷酸酶，由A、B亞基以1∶1組成異二聚體，其中A亞基（CNA）是催化亞基，B亞基（CNB）是調(diào)節(jié)亞基。CNB作為該酶的調(diào)節(jié)亞基，能促進(jìn)CNA的活性，且相對分子質(zhì)量小、性質(zhì)穩(wěn)定。CN在免疫激活通路中發(fā)揮著重要作用，是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵酶。重組人CNB（rhCNB）能刺激T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞增殖、增強NK細(xì)胞的殺傷活性、增強巨噬細(xì)胞吞噬能力等，且對肝癌H22細(xì)胞有顯著的抑制作用，是高效低毒的新型抗腫瘤生物藥［1］。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是蛋白類生物技術(shù)藥物常用的分析方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點［2-4］。本文建立了測定大鼠血漿中rhCNB的ELISA雙抗體夾心法，并對其藥動學(xué)進(jìn)行了研究，以期為評價rhCNB用于肝癌治療的臨床療效提供檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

Tecan Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan有限公司）；Centrifuge 5810高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品（批號：20140807，純度：＞99%）和rhCNB單克隆抗體mAb（rhCNB mAb，批號：150310）均由?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰咎峁?；抗rhCNB多克隆抗體pAb（rhCNB pAb，批號：BM1694）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗免疫球蛋白G （IgG）（批號：BA1058）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液（批號：P0209）均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動物

SD大鼠6只，SPF級，♀♂各半，體質(zhì)量為200～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，合格證號為SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院藥物安全評價中心動物房。

2 方法與結(jié)果

2.1 血漿樣品的處理

從大鼠眼眶靜脈叢取血0.3 ml，置于1.5 ml肝素鈉抗凝管內(nèi)，靜置1 h后，以3 000 r/min（離心半徑為3 cm）離心20 min，分離后的血漿樣品保存于－20 冰箱備用。

2.2 ELISA雙抗體夾心法測定rhCNB濃度

將用pH9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋后的rhCNB mAb包板，4 過夜；次日棄孔內(nèi)液，用PBST［含0.5 ml/L聚山梨酯20的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7.4］洗板3次，拍干；再用0.1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，250μl/孔，37孵育2 h，洗板同上；然后向孔中分別加入待測樣品，37 孵育1 h，洗板同上。待rhCNB mAb與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，再分別加入rhCNB pAb和HRP標(biāo)記抗IgG，用TMB底物避光顯色5～15 min，顯色強度與rhCNB濃度成正比。終止反應(yīng)后，通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度（OD值）。℃℃℃℃

2.3 3種抗體最優(yōu)加入量的篩選

采用棋盤滴定法將rhCNB mAb、rhCNB pAb和HRP標(biāo)記抗IgG進(jìn)行一系列稀釋（rhCNB mAb質(zhì)量濃度為10、1、0.1 μg/ml；rhCNB pAb稀釋比例為1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000；HRP標(biāo)記抗IgG稀釋比例為1∶2 000、1∶3 000、1∶10 000），以rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品為待測樣品，按“2.2”項下方法測定OD值，根據(jù)rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用線性擬合方式計算各孔rhCNB的質(zhì)量濃度［5-6］。結(jié)果，當(dāng)rhCNB mAb為1μg/ml、rhCNB pAb稀釋比例為1∶5 000、HRP標(biāo)記抗IgG稀釋比例為1∶10 000時，陽性對照（rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品）平均OD值與陰性對照（不含rhCNB的樣品稀釋液）平均OD值之比（P/N值）最大，以此作為rhCNB mAb、rhCNB pAb和HRP標(biāo)記抗IgG的最優(yōu)加入量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

用藥動學(xué)軟件BAPP 3.0進(jìn)行線性擬合求回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 專屬性考察 將1 mg/ml rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行倍比稀釋，獲得12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；再用大鼠空白血漿將1 mg/ml rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋為12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿。取6個不同大鼠的空白血漿；再從6份大鼠空白血漿中取1 μl加入1.5 ml EP管中，加入999 μl樣品稀釋液（磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4）配成1 ml空白血漿稀釋液。按“2.2”項下方法，對rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品溶液、含標(biāo)準(zhǔn)品血漿、空白血漿和空白血漿稀釋液進(jìn)行ELISA測定。結(jié)果，rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品溶液與含標(biāo)準(zhǔn)品血漿的OD值接近，空白血漿與空白血漿稀釋液的OD值接近，表明空白血漿和空白血漿稀釋液均對rhCNB的測定無干擾，具體結(jié)果見表1。

表1 不同溶液的ELISA法檢測結(jié)果（OD值）Tab 1 Detection results of different solutions by ELISA（OD value）

2.5.2 線性范圍考察 按“2.5.1”項下方法，制備12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿，照“2.2”項下方法測定OD值。以rhCNB的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為y=8.88x+0.1（r2=0.995 0）。結(jié)果表明，rhCNB檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.195～12.5 ng/ml，符合試驗要求。

2.5.3 定量下限考察 以空白血漿溶液重復(fù)測定16次，計算其均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以與10倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限。結(jié)果顯示，本方法的定量下限為0.195 ng/ml，符合驗證要求。

2.5.4 準(zhǔn)確度試驗 按“2.5.1”項下方法，制備10、5、1 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿，每個質(zhì)量濃度制備6份，照“2.2”項下方法測定OD值，以測得值/加入量×100%計算準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab 2 Results of accuracy test

2.5.5 精密度試驗 按“2.5.1”項下方法，制備10、5、1 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿，每個質(zhì)量濃度制備6份，照“2.2”項下方法測定OD值，連續(xù)測定3 d，考察批內(nèi)、批間精密度。結(jié)果顯示，10、5、1 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿的批內(nèi)RSD分別為7.266%、4.629%、7.214%（n=6），批間RSD分別為5.7%、2.5%、4.6%（n=18）。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.5.1”項下方法，制備10、5、1 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿，每個質(zhì)量濃度制備5份，－20 下貯存，2～8 下緩慢融解，反復(fù)凍融3次后，照“2.2”項下方法測定OD值。結(jié)果顯示，10、5、1 ng/ml的含標(biāo)準(zhǔn)品血漿OD值的RSD分別為2.9%、6.1%、8.5%（n=15），表明反復(fù)凍融3次不會影響rhCNB的穩(wěn)定性?！妗?/p>

2.6 藥動學(xué)實驗

取6只SD大鼠，iv 2.5 mg/kg rhCNB后分別于2、15、30、60、120、240、480、720 min尾靜脈取0.1 ml全血，離心后分離血漿，4 保存，待測。按“2.1”項下方法處理后，照“2.2”項下方法測定OD值，代入回歸方程計算血藥濃度，繪制藥-時曲線，℃結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠體內(nèi)rhCNB的藥-時曲線Fig 1 The blood concentration-time curve of rhCNB in rats in vivo

結(jié)果表明，rhCNB在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征符合二室模型；以BAPP 3.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果AUC0-720 min為173.038 mg·min/L、t1/2為94.62 min。

3 討論

ELISA法是將酶催化的放大作用與特異性抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來的一種微量分析技術(shù)，是高通量篩選和定量檢測相結(jié)合的一種常用方法，適合于大批標(biāo)本的檢測，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領(lǐng)域。其原理是利用抗原抗體特異性反應(yīng)，檢測靈敏度高達(dá)納克甚至皮克級，具有特異性強、準(zhǔn)確性高、操作簡便、安全等優(yōu)點［7-9］。但ELISA法也存在一定的局限性，如重復(fù)性較差、易受自身抗體或內(nèi)源性酶等干擾。此外，影響因素多，尤其是溫度和時間等，都會對檢測結(jié)果帶來一定的誤差。因此，用ELISA法進(jìn)行定量分析時對方法的靈敏度、線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、回收率等都有嚴(yán)格的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

本文建立了定量測定SD大鼠血漿中的rhCNB多肽的ELISA雙抗體夾心法，以棋盤滴定法篩選出rhCNB mAb、rhCNB pAb和HRP標(biāo)記抗IgG的最優(yōu)加入量；以rhCNB mAb包被固相載體、抗原抗體特異性結(jié)合去除了雜蛋白的影響，提高了檢測的特異性。rhCNB pAb能同時識別rhCNB的多個抗原表位，HRP酶標(biāo)抗體又具有級聯(lián)放大作用，因此提高了檢測系統(tǒng)的靈敏度。本文結(jié)果表明，rhCNB mAb的最優(yōu)質(zhì)量濃度為1 μg/ml，rhCNB pAb和HRP標(biāo)記抗IgG的最優(yōu)稀釋比例分別為1∶5 000、1∶10 000。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本方法的特異性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、定量下限等均符合驗證可接受標(biāo)準(zhǔn)，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地對生物樣品中的rhCNB進(jìn)行定量檢測。

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Study on the ELISA Double-antibody Sandwich Method and Pharmacokinetics of Recombinant Human Calcineurin B Subunit in Rat Plasma

HAN Kesheng1，XIE Xueli2，TIAN Shuhong2，XING Guilan2，F(xiàn)U Jiang2，XING Jun2，LIN Chunhua2，TAN Peng2，SHAO Jiping2（1.Haikou Qili Pharmaceutical Co.，Ltd.，Haikou 570216，China；2.Key Laboratory of Preclinical Pharmacology and Toxicology of Hainan Province，Haikou 571199，China）

OBJECTIVE：To establish a method for determining recombinant human calmodulin B subunit（rhCNB）in rat plasma，and study its pharmacokinetics characteristics.METHODS：ELISA double-antibody sandwich method was adopted.1μg/ml rhCNB monoclonal antibody mAb was wrapped，added to the to-be-test sample，rhCNB polyclonal antibody pAb（dilution ratio of 1∶5 000）and HRP-labeled conjugate of anti-IgG（dilution ratio of 1∶10 000）were added.Using tetramethylbenzidine for developing，microplate reader was conducted in wavelength of 450 nm to determine the absorbance value（OD value）and plasma concentration of 6 rats after 2，15，30，60，120，240，480，720 min of iv 2.5 mg/kg rhCNB，and the pharmacokinetic parameters were calculated by BAPP 3.0 software.RESULTS：The linear range of rhCNB were 0.195-12.5 ng/ml（r2=0.995 0），lower limit of quantitation was 0.195 ng/ml，accuracy were 97.300%-103.622%（RSD＜7.5%，n=6）；RSDs of within-batch，inter-batch，freezing and thawing 3 times were no higher than 8.5%（n=6，18，15）.rhCNB pharmacokinetics characteristics in rat fitted to two-compartment model，AUC0-720 minwas 173.038 mg·min/L and t1/2was 94.62 min.CONCLUSIONS：The established method has high specificity and sensitivity，good accuracy and precision，which can be used for rhCNB quantitative detection and pharmacokinetics study in biological samples.

rhCNB polypeptide；ELISA-antibody sandwich method；Rat；Quantitative detection；Pharmacokinetics

R927.2

A

1001-0408（2016）25-3468-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.04

2016-01-11

2016-04-22）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81160408）

＊工程師。研究方向：藥物分析。電話：0898-66804181。E-mail：hanksh168@126.com

副教授，博士。研究方向：藥物安全性評價。電話：0898-66961101。E-mail：jpshaosl@163.com