AFT024-SCF細(xì)胞系的構(gòu)建及其生物學(xué)功能鑒定*

李　陳，　陸　英，　楊　丹，　汪　穎，　薛　淼，　張祥忠△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510630； 2安徽大學(xué)，安徽 合肥 230000)

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AFT024-SCF細(xì)胞系的構(gòu)建及其生物學(xué)功能鑒定*

李陳1，陸英1，楊丹1，汪穎2，薛淼1，張祥忠1△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2安徽大學(xué)，安徽 合肥 230000)

目的： 構(gòu)建AFT024-SCF和HPC-Lhx2細(xì)胞系，并用HPC-Lhx2細(xì)胞系鑒定AFT024-SCF細(xì)胞系的生物學(xué)功能。方法: 采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法構(gòu)建干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)依賴的永生化造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HPC)-Lhx2細(xì)胞系和小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)FT024-SCF及其不含目的基因的對(duì)照組細(xì)胞系A(chǔ)FT024-GFP。采用real-time PCR法及Western blot法鑒定此AFT024-SCF細(xì)胞系中SCF的表達(dá)。ELISA法鑒定AFT024-SCF上清液中SCF的表達(dá)。收集AFT024-SCF及AFT024-GFP細(xì)胞培養(yǎng)上清液并以1∶10與IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合備用。以AFT024-SCF組上清液為實(shí)驗(yàn)組，AFT024-GFP組上清液為內(nèi)源性陰性對(duì)照組，無(wú)任何添加的IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為外源性陰性對(duì)照組，添加重組SCF的IMDM培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組，分別與HPC-Lhx2 細(xì)胞系共培養(yǎng)72 h。MTT法檢測(cè)各組HPC-Lhx2細(xì)胞增殖活性，集落形成實(shí)驗(yàn)鑒定HPC-Lhx2細(xì)胞系擴(kuò)增后的細(xì)胞干性。結(jié)果: 構(gòu)建的AFT024-SCF細(xì)胞系表達(dá)SCF;HPC-Lhx2細(xì)胞系體外培養(yǎng)72 h后，外源性及內(nèi)源性陰性對(duì)照組未能維持HPC-Lhx2細(xì)胞增殖;而陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均可促進(jìn)HPC-Lhx2細(xì)胞增殖;陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均有集落形成單位，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照組無(wú)集落形成單位。結(jié)論: 成功構(gòu)建表達(dá)SCF的AFT024-SCF細(xì)胞系，其培養(yǎng)上清液能夠替代重組SCF用于HPC-Lhx2細(xì)胞系的體外擴(kuò)增。

AFT024-SCF細(xì)胞系; 干細(xì)胞因子； 造血干/祖細(xì)胞； HPC-Lhx2細(xì)胞系

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)是一群具有自我更新和定向分化潛能的多能干細(xì)胞，HSC移植已被廣泛地應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤、骨髓衰竭性疾病及一些先天性疾病等的臨床治療[1]。進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)HSC是目前重要的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)之一[2]。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HPC)的體外擴(kuò)增主要依賴細(xì)胞因子[3]。而在這些細(xì)胞因子中，干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)起著至關(guān)重要的作用。目前體外培養(yǎng)HSC的所有細(xì)胞因子組合幾乎都包含SCF[4]。SCF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用于HSC最早期階段的細(xì)胞因子。SCF能通過(guò)與c-Kit結(jié)合向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，啟動(dòng)早期HPC的分裂和增殖，使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，開(kāi)始擴(kuò)增[5]。另外，SCF還可以與其它細(xì)胞因子協(xié)同作用促進(jìn)造血各系前體細(xì)胞的增殖與分化[6]。因此，研究?jī)?yōu)化HSC體外擴(kuò)增體系,細(xì)胞因子SCF必不可少。

AFT024是一種來(lái)源于小鼠胎肝的基質(zhì)細(xì)胞系，與HSC共培養(yǎng)時(shí)能夠在體外較長(zhǎng)時(shí)間維持HSC干性[7]，說(shuō)明其在HSC的體外干性維持中發(fā)揮著一定的作用。AFT024能夠體外維持小鼠HSC干性達(dá) 4～7周之久，并且此體外培養(yǎng)的HSC在移植后能夠重建受體小鼠的造血系統(tǒng)，與未經(jīng)體外培養(yǎng)的新鮮HSC移植效果相似[8]?；谝陨侠碚?，我們利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，以小鼠細(xì)胞系為模型，將小鼠SCF基因?qū)階FT024中，構(gòu)建出可分泌SCF的AFT024-SCF細(xì)胞系。Lhx2基因?yàn)長(zhǎng)IM同源框基因家族的一員，在小鼠多能干細(xì)胞或骨髓中過(guò)表達(dá)Lhx2基因可建立SCF依賴的永生化細(xì)胞系HPC-Lhx2， HPC-Lhx2細(xì)胞系生物學(xué)特性與HSC十分相似，是體外研究HSC生物學(xué)特性較理想的細(xì)胞模型[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們建立HPC-Lhx2細(xì)胞系，并收集AFT024-SCF細(xì)胞系上清液用于培養(yǎng)HPC-Lhx2，觀察后者擴(kuò)增情況，以評(píng)估新構(gòu)建的AFT024-SCF細(xì)胞系生物學(xué)功能。并為后續(xù)建立和優(yōu)化體外擴(kuò)增HSC的體系奠定基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1細(xì)胞系及主要試劑

1.1動(dòng)物C57BL/6小鼠，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華公司。

1.2細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒AFT024細(xì)胞系購(gòu)自ATCC；兔抗小鼠多克隆抗體、羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz；ExTaq熱啟動(dòng)DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa；連接酶和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Reverse Transciptase、TRIzol試劑均購(gòu)自Invitrogen；重組小鼠SCF、IL-6均購(gòu)自PeproTech；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、2-巰基乙醇(MTG)購(gòu)自Gibco；高糖DMEM、IMDM、含丙酮酸鈉的高糖DMEM、MTG、青/鏈霉素(P/S)混合液、胰酶均購(gòu)自Life Technologies。小鼠集落形成單位(colony forming unit, CFU)半固體培養(yǎng)基購(gòu)自Stem Cell。MTT試劑盒購(gòu)自碧云天公司。SCF/MGF ELISA試劑盒購(gòu)自CUSABIO。

2方法

2.1pMYs-Lhx2-GFP、pMYs-SCF-GFP載體的構(gòu)建由于小鼠SCF、Lhx2分別高表達(dá)于小鼠肺、胚胎組織中。故我們分離出小鼠肺、胚胎組織，以TRIzol法提取其RNA并逆轉(zhuǎn)錄后獲得SCF及Lhx2的cDNA模板。PCR擴(kuò)增獲得帶有酶切序列的目的基因片段，將PCR產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMYs-IRES-GFP分別雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.2AFT024-SCF細(xì)胞系構(gòu)建Plat-E細(xì)胞包裝病毒，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AFT024細(xì)胞，按每孔3.5×104個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h進(jìn)行病毒感染。感染后繼續(xù)培養(yǎng)12 h更換新鮮培養(yǎng)基。24 h后進(jìn)行二次感染。

2.3Real-time PCR檢測(cè)SCF mRNA的表達(dá)水平細(xì)胞二次感染48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例。收集106個(gè)AFT024-GFP及AFT024-SCF細(xì)胞分別置于TRIzol中裂解并提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR檢測(cè)SCF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。依據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算出SCF的相對(duì)表達(dá)量，其中GAPDH作為內(nèi)參照。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列

2.4Western blot檢測(cè)SCF蛋白表達(dá)水平收集AFT024-GFP及AFT024-SCF細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中裂解并提取上清液，加SDS上樣緩沖液98 ℃煮樣變性以制備蛋白。上樣后經(jīng)SDS-PAGE分離，接著轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將目的條帶置于含5%BSA的TBST溶液中室溫封閉1 h。棄去封閉液后分別加入SCF(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)Ⅰ抗， 4 ℃孵育12 h。TBST溶液洗滌3次，加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育90 min，TBST溶液洗滌3次后，X光片壓片、顯影、定影。最后分光光度儀分析蛋白含量。

2.5ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定AFT024-SCF上清中SCF濃度收集AFT024-SCF及AFT024細(xì)胞約80%～90% 密度時(shí)的上清液，準(zhǔn)備未曾使用的新鮮AFT024培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。分別設(shè)空白對(duì)照組(AFT024培養(yǎng)基稀釋1×104倍)，陰性對(duì)照組(AFT024上清液稀釋1×104倍)，陽(yáng)性對(duì)照組(添加1 mg/L SCF 的AFT024培養(yǎng)基稀釋1×104倍),實(shí)驗(yàn)組(AFT024-SCF上清液稀釋1×104倍)。按CUASIBIO SCF/MGF ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，最終分別測(cè)定各組在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，從而獲得各組的SCF濃度。

2.6建立HPC-Lhx2細(xì)胞系方法參照Pinto等[10]實(shí)驗(yàn)中HPC-Lhx2細(xì)胞系的構(gòu)建方法。將5-氟尿嘧啶注入C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)，富集小鼠骨髓HPC。3 d后處死小鼠，收集HPC按每孔5×106個(gè)接種于6孔板，使用IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(IMDM+10% FBS+1.5×10-4mol/L MTG )+100 μg/L SCF+10 μg/L IL-6預(yù)刺激24 h。Plat-E細(xì)胞包裝病毒，獲得Lhx2組及GFP對(duì)照組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清。將細(xì)胞按每孔2×106個(gè)加入6孔板進(jìn)行病毒感染，后吸去病毒上清并添加新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基(IMDM +5% FBS+1.5×10-4mol/L MTG +100 μg/L SCF)接著培養(yǎng)24 h，重復(fù)感染1次。二次感染后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6 周。

2.7不同培養(yǎng)基培養(yǎng)HPC-Lhx2細(xì)胞系將AFT024-SCF及AFT024-GFP接種于100 mm盤(pán)，待細(xì)胞密度至80%～90% 時(shí)收集上清液。將所得上清液分別與IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1∶10混合。收集培養(yǎng)的HPC-Lhx2細(xì)胞，以1×108/L分別重懸于4組培養(yǎng)基培養(yǎng)(IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+100 μg/L SCF、IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ AFT024-GFP上清、IDMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ AFT024-SCF上清)。將4組細(xì)胞混懸液分別置于96 孔板和24 孔板培養(yǎng)。96 孔板每組5 個(gè)重復(fù)孔，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，即每孔2×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后評(píng)估細(xì)胞增殖活性。24孔板每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入2 mL細(xì)胞混懸液，即每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.8MTT法評(píng)估細(xì)胞增殖活性96孔板細(xì)胞體外培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后離心棄上清液。接著每孔加入200 μL DMSO，后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的A值。

2.9集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估擴(kuò)增HPC-Lhx2細(xì)胞干性24孔板細(xì)胞收集計(jì)數(shù)后以3×107/L重懸。重懸后細(xì)胞每孔用1 mL注射器取100 μL，即約3 000個(gè)細(xì)胞置于1 mL CFU半固體培養(yǎng)基中，渦旋振蕩器振蕩混勻后置于35 mm盤(pán)中培養(yǎng)7～14 d后觀察集落形成情況，進(jìn)行總集落的計(jì)數(shù)及各系集落計(jì)數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0及GraphPad 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1pMYs-SCF-IRES-GFP和pMYs-Lhx2-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

pMYs-SCF-IRES-GFP載體經(jīng)EcoR I和XhoI酶切，pMYs-Lhx2-IRES-GFP載體經(jīng)EcoR I和BamH I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中重組目的片段被分離，且片段大小與基因大小符合。SCF大小為822 bp，Lhx2大小為1 098 bp，見(jiàn)圖1。挑選質(zhì)粒測(cè)序完全匹配，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建成功。

Figure 1.Constructed retrovirus vectors identified by double enzyme digestion. 1: marker (2 000 bp); 2: pMYs-SCF-IRES-EGFP plasmid was digested byEcoR I andXhoI; 3: pMYs-Lhx2-IRES-GFP plasmid was digested byEcoR I andBamH I.

圖1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的雙酶切鑒定

2AFT024-SCF細(xì)胞系建立及其上清液中SCF檢測(cè)

pMYs-SCF-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有綠色熒光報(bào)告基因GFP，可用以觀察、評(píng)估感染效率。熒光倒置顯微鏡觀察感染24 h后的細(xì)胞，可以觀察到綠色熒光。感染48 h時(shí)GFP表達(dá)最理想，為100%。帶有目的基因載體組和空載對(duì)照組GFP感染率沒(méi)有明顯差異。以real-time PCR法檢測(cè)SCF在AFT024細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)，結(jié)果表明AFT024-SCF中SCF的表達(dá)量明顯比對(duì)照組AT024-GFP組高(P<0.01)。以Western blot法檢測(cè)SCF在AFT024-SCF細(xì)胞系中的蛋白表達(dá), 結(jié)果顯示只在AFT024-SCF細(xì)胞中檢測(cè)到SCF。以ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AFT024-SCF上清中SCF的蛋白表達(dá)，減去空白孔A值后可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組A值接近，陰性對(duì)照組A值極低，可忽略不計(jì)。測(cè)得陽(yáng)性對(duì)照組SCF濃度約為(99.49±6.93) ng/L， 實(shí)驗(yàn)組SCF濃度約為(101.50±6.18) ng/L，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AFT024-SCF能夠分泌SCF至上清液中，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Construction and identification of AFT024-SCF cell line(×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsAFT024-GFP group.

圖2AFT024-SCF細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定

3HPC-Lhx2細(xì)胞系的建立

pMYs-Lhx2-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體同樣含有GFP，感染細(xì)胞48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)綠色熒光。Lhx2組和GFP對(duì)照組的GFP感染率沒(méi)有明顯差異。經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)6 周，GFP對(duì)照組只有貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)，HPC-Lhx2組仍然有大量懸浮生長(zhǎng)的血細(xì)胞，表明HPC-Lhx2細(xì)胞系建立成功，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Construction of SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line (×100). A: enriched bone marrow (BM) cells infected with GFP (white light); B: enriched BM cells infected with GFP (green light); C: enriched BM cells infected with Lhx2 (white light); D: enriched BM cells infected with Lhx2 (green light); E: BM-GFP cells were failed cultured for 6 weeksinvitro(white light); F: HPC-Lhx2 cells were successfully cultured for 6 weeksinvitro(white light).

圖3構(gòu)建依賴SCF的HPC-Lhx2細(xì)胞系

4MTT法測(cè)定體外培養(yǎng)HPC-Lhx2的細(xì)胞增殖活力，集落形成實(shí)驗(yàn)鑒定所擴(kuò)增HPC-Lhx2細(xì)胞的干性

陽(yáng)性對(duì)照組及AFT024-SCF上清培養(yǎng)組與IMDM對(duì)照組的MTT結(jié)果比較均有差異(P<0.05)，而AFT024-GFP上清培養(yǎng)組與IMDM對(duì)照組的MTT結(jié)果比較無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖4。陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h的HPC-Lhx2均能形成克隆，陽(yáng)性對(duì)照組共約90個(gè)，實(shí)驗(yàn)組共約86個(gè),以粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落占大多數(shù)，且2組各系集落數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組陰性對(duì)照均無(wú)克隆形成,見(jiàn)圖5、表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以1∶10稀釋AFT024-SCF上清配制的培養(yǎng)基完全可以代替IMDM添加100 μg/L SCF的培養(yǎng)基。

討　　論

1構(gòu)建的AFT024-SCF細(xì)胞系能夠表達(dá)SCF

在小鼠造血發(fā)育過(guò)程中，造血生成的位置是不斷變化的，由最初的卵黃囊(yolk sac, YS)造血，到主動(dòng)脈-中腎-性腺區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region，

Figure 4.The proliferation of HPC-Lhx2 cells in different medium. Negative control: IMDM basic medium; positive control: IMDM basic medium with 100 μg/L SCF; AFT024-GFP(1∶10): IMDM basic medium with 10% AFT024-GFP supernatant; AFT024-SCF(1∶10): IMDM basic medium with 10% AFT024-SCF supernatant.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control).

圖4HPC-Lhx2細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的增殖情況

AGM)造血，再到胎肝造血以及出生后的骨髓造血[11]。胎肝中的HSC大量擴(kuò)增以提供足夠數(shù)量的HSC儲(chǔ)備。但在此時(shí)期之前的AGM區(qū)及之后的骨髓中HSC通常情況下均處于一個(gè)休眠狀態(tài)。因此要研究HSC擴(kuò)增，我們聚焦于胎肝期HSC。胎肝期HSC的擴(kuò)增可能受兩方面因素影響，即HSC本身的細(xì)胞自主機(jī)制及胎肝微環(huán)境細(xì)胞的非自主機(jī)制。而研究表明促進(jìn)其自我更新及擴(kuò)增的分子信號(hào)主要可能源于胎肝微環(huán)境[12]。有學(xué)者將胎肝微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞分離出來(lái)建立成基質(zhì)細(xì)胞系并進(jìn)行體外擴(kuò)增HSC實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離出的200多種基質(zhì)細(xì)胞系中，命名為AFT024的細(xì)胞系體外維持小鼠HSC的能力最強(qiáng)。其能夠體外維持HSC達(dá) 4～7 周之久，在移植后其仍然能夠重建受體造血系統(tǒng)，并且與未經(jīng)培養(yǎng)的新鮮HSC移植效果相似[8]。目前研究表明，AFT024細(xì)胞系用于體外擴(kuò)增HSC主要有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠?yàn)镠SC的自我更新和定向分化提供均衡的細(xì)胞微環(huán)境；(2)在不依賴其它微環(huán)境因素情況下，來(lái)自AFT024的單獨(dú)信號(hào)已經(jīng)足以體外維持HSC干性一段時(shí)間；(3)這種維持HSC干性的機(jī)制具有進(jìn)化保守性，不僅可以體外維持鼠的HSC干性較長(zhǎng)時(shí)間，還能體外維持人的HSC干性[13-14]。綜上所述，AFT024是體內(nèi)外擴(kuò)增HSC微環(huán)境中一個(gè)重要的細(xì)胞組成部分，目前，對(duì)于HSC維持其干細(xì)胞特性的機(jī)制以及造血微環(huán)境對(duì)HSC的影響仍有待進(jìn)一步研究，而小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞AFT024細(xì)胞系正是研究后者比較理想的實(shí)驗(yàn)材料之一。據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道，將SCF導(dǎo)入小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，可在骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其上清液中檢測(cè)到SCF表達(dá)，且其上清液可協(xié)同GM-CSF刺激骨髓細(xì)胞集落生長(zhǎng)，證明其具有生物學(xué)活性。目前并未有將SCF導(dǎo)入AFT024細(xì)胞系的報(bào)道，而AFT024作為具有相似于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系，構(gòu)建AFT024-SCF對(duì)于體外培養(yǎng)HSC有著一定意義。因此，本實(shí)驗(yàn)以上述文獻(xiàn)報(bào)道為理論基礎(chǔ)，將SCF導(dǎo)入AFT024，構(gòu)建成為新的AFT024-SCF細(xì)胞系。用real-time PCR和Western blot分別在mRNA及蛋白水平證明此細(xì)胞系可表達(dá)SCF基因。并用ELISA實(shí)驗(yàn)證明AFT024-SCF可分泌SCF至上清液中。為今后進(jìn)一步研究基質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞因子對(duì)于HSC體外干性維持的作用提供了較好的實(shí)驗(yàn)材料，避免了長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)外源性添加SCF所造成的SCF濃度的較大幅度波動(dòng)。

Figure 5.The morphology of CFU of HPC-Lhx2 cells in different medium(×50). A: granulocyte colony of AFT024-SCF group; B: macrophage colony of AFT024-SCF group ; C: granulocyte-macrophage colony of AFT024-SCF group; D: granulocyte colony of control group; E: macrophage colony of control group ; F: granulocyte-macrophage colony of control group.

圖5不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的HPC-Lhx2形成的CFU形態(tài)無(wú)明顯差異

表2培養(yǎng)后的HPC-Lhx2在CFU實(shí)驗(yàn)中形成的克隆數(shù)

Table 2.Colony numbers formed by cultured HPC-Lhx2 cells in colony forming experiment (Mean±SD.n=3)

GroupGMGMPositivecontrol3.33±0.336.33±0.3377.33±3.18AFT024-SCF(1∶10)3.67±0.336.00±0.5778.00±2.08AFT024-GFP(1∶10)000Negativecontrol000

G: granulocyte colony; M: macrophage colony; GM: granulocyte-macrophage colony.

2采用HPC-Lhx2細(xì)胞系證明了AFT024-SCF所分泌上清液中含有生物活性的SCF

HPC-Lhx2是一種SCF依賴的造血干/祖細(xì)胞系，生物學(xué)特性與正常的HSC相似。HPC-Lhx2細(xì)胞系能夠在SCF存在的情況下持續(xù)擴(kuò)增，并且培養(yǎng)7 個(gè)月以上不發(fā)生明顯分化。在基質(zhì)細(xì)胞的支持下可形成鵝卵石區(qū)域，具有長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(long-term culture-initiating cells，LTC-IC)的特點(diǎn)[10]。研究表明使用特定細(xì)胞因子及細(xì)胞因子組合的體外培養(yǎng)體系培養(yǎng)HPC-Lhx2細(xì)胞系與培養(yǎng)HSC效果相似[16]。鑒于它易于獲得及培養(yǎng)，可以作為HSC的細(xì)胞模型用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。我們利用構(gòu)建的HPC-Lhx2細(xì)胞系鑒定AFT024-SCF的上清液中是否具有類似SCF作用的生物活性物質(zhì)。收集AFT024-SCF及AFT024-GFP細(xì)胞培養(yǎng)上清液并以1∶10與IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合備用。以AFT024-SCF組上清液為實(shí)驗(yàn)組，AFT024-GFP組上清液為內(nèi)源性陰性對(duì)照組，無(wú)任何添加的IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為外源性陰性對(duì)照組，添加重組SCF的IMDM培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組，分別與HPC-Lhx2 細(xì)胞系培養(yǎng)72 h。結(jié)果顯示：外源性及內(nèi)源性陰性對(duì)照組未能維持HPC-Lhx2細(xì)胞增殖，而陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均可促進(jìn)HPC-Lhx2細(xì)胞增殖。且集落形成實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)72 h的實(shí)驗(yàn)組HPC-Lhx2所形成的各系克隆數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而2組陰性對(duì)照均無(wú)克隆形成。由此我們認(rèn)為AFT024-SCF上清液可以替代昂貴的商業(yè)化基因工程重組SCF。這為體外擴(kuò)增HSC、研究其功能及調(diào)控機(jī)制提供了非常好的實(shí)驗(yàn)支持材料。另外，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較陽(yáng)性對(duì)照組擴(kuò)增效果稍優(yōu),而我們陽(yáng)性對(duì)照組所添加的SCF濃度100 μg/L是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道所使用的擴(kuò)增HPC-Lhx2較為理想的濃度[9],這可能是其中SCF濃度更為合適，或者是AFT024-SCF細(xì)胞生成的其它物質(zhì)與SCF產(chǎn)生了協(xié)同作用。現(xiàn)在已有實(shí)驗(yàn)提示AFT024細(xì)胞的Dlk/pref-1基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)維持?jǐn)U增HSC具有重要影響[17]。后續(xù)我們將檢測(cè)AFT024-SCF上清液的SCF蛋白含量及分析其它細(xì)胞因子組成以進(jìn)一步闡明其維持?jǐn)U增HSC的機(jī)制，并可進(jìn)行AFT024-SCF與HSC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察基質(zhì)細(xì)胞系與細(xì)胞因子共同作用是否更有利于HSC的體外培養(yǎng)。

綜上所述，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)，成功建立了小鼠HPC-Lhx2細(xì)胞系和AFT024-SCF細(xì)胞系。以HPC-Lhx2細(xì)胞系作為HSC細(xì)胞模型，我們證實(shí)了AFT024-SCF細(xì)胞系不僅能夠表達(dá)SCF，而且還可能分泌釋放有生物學(xué)活性的SCF到培養(yǎng)上清液中。這為后續(xù)體外擴(kuò)增HSC及HSC功能和調(diào)控機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

AFT024-SCF construction and functional identification

LI Chen1, LU Ying1, YANG Dan1, WANG Ying2, XUE Miao1, ZHANG Xiang-zhong1

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2AnhuiUniversity,Hefei230000,China.E-mail:bradzxz@126.com)

AIM: To construct AFT024-SCF cell line and HPC-Lhx2 cell line for confirming the biological function of AFT024-SCF.METHODS: The HPC-Lhx2 cell line, AFT024-SCF cell line and AFT024-GFP cell line were constructed by retro-viral infection. The expression of stem cell factor(SCF) in AFT024-SCF cells was detected by real-time PCR and Western blot. SCF in the supernatant of AFT024-SCF was detected with ELISA. The supernatant of AFT024-SCF and AFT024-GFP were collected and then diluted (1∶10) with basic IMDM medium. So we made 4 culture medium: AFT024-SCF medium was used for experiment group, AFT024-GFP medium was used for endogenous negative control, IMDM basic medium was used for exogenous negative control, and IMDM basic medium with SCF was used for positive control. SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line was cultured in these 4 different medium for 72 h. According to MTT method and colony forming experiment, the biological function of AFT024-SCF was confirmed by the proliferation ability of SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line.RESULTS: SCF was highly expressed in AFT024-SCF cells. After cultured for 72 h, neither IMDM basic medium nor GFP-AFT024 medium support HPC-Lhx2 cell line proliferation. However, AFT024-SCF medium supported HPC-Lhx2 cell line expansion as well as the positive control medium.CONCLUSION: AFT024-SCF cells express SCF successfully and recombinant SCF can be replaced by the supernatant of AFT024-SCF culture medium for expanding HPC-Lhx2 cell lineinvitro.

AFT024-SCF cell line; Stem cell factor; Hematopoietic stem/progenitor cells; HPC-Lhx2 cell line

1000- 4718(2016)04- 0745- 07

2015- 06- 30

2016- 02- 04

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2013010016559； No.2014A030313138)

Tel:020-82179779; E-mail:bradzxz@126.com

R551

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.027

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