HIL-6和HGF雙基因重組腺病毒增強對慢加急性肝衰竭大鼠的治療效果*

高丹丹，　付　佳，　秦　波，　黃文祥，　楊　春，　賈　蓓

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶 400016)

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HIL-6和HGF雙基因重組腺病毒增強對慢加急性肝衰竭大鼠的治療效果*

高丹丹，付佳，秦波，黃文祥，楊春△，賈蓓△

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶 400016)

目的： 比較超級白細胞介素6(HIL-6)和肝細胞生長因子(HGF)雙基因重組腺病毒(Ad-HGF-HIL-6)與HIL-6或HGF重組腺病毒(Ad-HIL-6或Ad-HGF)對慢加急性肝衰竭(ACLF)大鼠的治療效果。方法: 將ACLF大鼠隨機分為：未感染(model)組、空載體(Ad0)組、Ad-HGF組、Ad-HIL-6組和Ad-HGF-HIL-6組。收集血清及肝組織進行生物化學、病理學及分子生物學檢測。結果: Ad-HGF、Ad-HIL-6或Ad-HGF-HIL-6組與Ad0組比較，凝血酶原時間(PT)、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、凋亡指數(shù)及Bax蛋白明顯降低且肝組織病變減輕，Bcl-2和Ki67蛋白的表達明顯增高；以上各項變化均以Ad-HGF-HIL-6組更顯著。結論: Ad-HGF-HIL-6比Ad-HGF或Ad-HIL-6對ACLF大鼠有更顯著的治療效果且無明顯毒副作用。

慢加急性肝衰竭； 超級白細胞介素6； 肝細胞生長因子； 重組腺病毒； 細胞凋亡

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是指慢性肝病基礎上短期內(nèi)發(fā)生的肝功能失代償，我國肝衰竭病例中慢加急/亞急性肝衰竭占90%以上，目前尚缺乏特效治療方法，如何促進肝細胞的再生是提高肝衰竭患者生存率的關鍵。肝細胞的再生是多細胞和多因子共同參與調(diào)控的一個復雜過程，而靜止期肝細胞進入細胞周期(啟動)及越過G1期是其中的2個關鍵步驟。目前認為肝再生啟動受腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)的控制，而細胞周期則受我們熟知的促肝細胞增殖的細胞因子肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的控制[1]。超級白細胞介素6(hyper-IL-6，HIL-6)是將IL-6與截短形式的可溶性白細胞介素6受體(soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R)通過基因操作共價連接的一種細胞因子。它是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)或體外的生物學活性比IL-6/sIL-6R可溶性絡合物高10～1 000倍[2]。Ohira等[3]報道IL-6皮下注射能促進大鼠肝細胞增殖，并發(fā)現(xiàn)注射IL-6后1 d血及肝組織中的HGF增高，說明IL-6的促肝細胞增殖作用是由IL-6引發(fā)的HGF增高所介導的。對鼠門靜脈進行分支結扎實驗顯示，單用HGF或IL-6處理，未結扎肝葉的凈重量明顯增加，HGF和IL-6聯(lián)用組肝凈重量顯著高于單用HGF或IL-6組[4]?；谝陨系难芯砍晒瑸榱诉M一步開拓細胞因子和基因治療肝衰竭的前景，為臨床應用奠定實驗基礎，我們構建了HIL-6聯(lián)合HGF雙基因重組腺病毒，觀察這2個基因協(xié)同對實驗性肝衰竭的治療作用。

材　料　和　方　法

1材料

腺病毒表達載體GV314及輔助包裝質(zhì)粒(pBHG lox ΔE1, 3 Cre)均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；質(zhì)粒抽提試劑盒和無RNA酶污染的DNA酶RQ1(Promega);限制性內(nèi)切酶(NEB)；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑和RNA抽提試劑盒(Invitrogen)；人腎胚細胞HEK293細胞購自ATCC；大腸桿菌菌株DH5α由重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室保存；人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)購自Octapharma；D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)均購自Sigma；TNF-α和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ) ELISA試劑盒(eBioscience)；高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1) ELISA試劑盒(Westang);Ki67單克隆抗體(Roche Ventana)；TUNEL試劑盒(Roche)；PrimeScript RT試劑盒、引物和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)；Bcl-2和Bax單克隆抗體(CST)。

2主要方法

2.1重組腺病毒根據(jù)Genbank中HGF基因的mRNA序列(NM_000601)及文獻[5]中HIL-6基因序列分別設計HGF、HIL-6及HGF-IRES-HIL-6(IRES為連接HGF和HIL-6基因的短鏈，重組腺病毒在體內(nèi)表達時IRES斷裂)的相關引物(由上海吉凱基因化學技術有限公司合成)，分別進行目的基因的PCR擴增，并行電泳鑒定。將獲得的目的基因同源重組分別轉入表達載體(線性化的GV314)，后轉化入DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)鑒定后，接種陽性克隆，保種，分裝100 μL進行DNA測序(由上海吉凱基因化學技術有限公司完成)。轉染前2 h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。按照等摩爾比條件配置病毒質(zhì)粒的復合物，配置穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA和Lipofectamine 2000稀釋液轉染復合體，將復合體移入HEK293細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。10～15 d出現(xiàn)病毒空斑。收獲后得到HGF重組腺病毒、HIL-6重組腺病毒及HGF和HIL-6雙基因重組腺病毒(即Ad-HGF、Ad-HIL-6及Ad-HGF-HIL-6)，在HEK293細胞中進行大量擴增后用氯化銫密度梯度離心法進行純化，以吸光度(A)測定估算病毒濃度(濃度約5×1015VP/L，VP即病毒顆粒)。采用終點稀釋法進行腺病毒滴度測定。

2.2慢加急性肝衰竭模型的建立參照文獻[6]方法制備大鼠慢加急性肝衰竭模型：SD大鼠用HSA致敏后予尾靜脈攻擊注射HSA 2.5～4 mg，每周2次，共6周后腹腔注射D-GalN 400 mg/kg+LPS 100 μg/kg，于給藥后3 h隨機分為未感染組(model組，8只)、Ad0組、Ad-HGF組、Ad-HIL-6組和Ad-HGF-HIL-6組(感染腺病毒組每組各21只)，另取8只同周齡正常大鼠作為對照(control)組。分組后各組每只大鼠立即分別給予尾靜脈注射100 μL相應的腺病毒1×1010VP或等體積生理鹽水，24 h后隨機麻醉(0.6%戊巴比妥30 mg/kg)采血后處死所有大鼠，取各組大鼠肝右葉部分組織置于4%中性甲醛固定，其余新鮮肝組織盡量除盡殘留血液后切成(1～5) mm×1 mm×1 mm小塊，用凍存管裝好，于液氮中保存。

2.3生化指標及細胞因子動態(tài)變化制備枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝血漿用于凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定；剩余血液離心取部分血清檢測丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)，余血清存放-80 ℃冰箱待測細胞因子。TNF-α、IFN-γ和HMGB1應用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法進行檢測，每份標本加2復孔，檢測結果取兩者均值。

2.4病理學檢查取右肝葉組織，石蠟包埋固定后切片，作常規(guī)HE染色，光鏡下觀察；Ki67免疫組織化學染色：石蠟切片脫蠟，以0.3% H2O2-甲醇溶液處理后，滴加Ki67單克隆抗體4 ℃過夜，經(jīng)生物素標記的第 II 抗體及辣根酶標記鏈霉卵白素各孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染。每只大鼠3張切片，每張切片隨機選取5個視野(×200)進行細胞計數(shù)，計算Ki67陽性細胞百分比(%)=同一視野下陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2.5原位細胞凋亡檢測(TUNEL法)石蠟切片脫蠟、水化，按TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進行。DAB顯色，蘇木素復染。每只大鼠5張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)進行細胞計數(shù)，計算凋亡細胞百分比，即凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

2.6RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR肝組織總RNA提取按照TRIzol試劑使用說明進行?？俁NA經(jīng)RQ1處理去除可能的基因組DNA污染。使用隨機引物進行反轉錄，反應實驗步驟嚴格按照PrimeScript RT試劑盒說明書進行。所得cDNA運用特異性引物(表1)及SYBR Premix Ex TaqTM進行實時定量PCR擴增，反應條件為95 ℃10 min;94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；94 ℃ 15 s。以β-actin作為內(nèi)參照，各組的目的基因相對值使用2-ΔΔCt方法[7]測定。

表1　實時熒光定量PCR的引物序列

2.7Western blot實驗取100 mg肝組織置于1 mL RIPA裂解液，充分勻漿并裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取其上清。蛋白樣品經(jīng)15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，300 mA恒壓半干轉膜70 min，以5%脫脂奶粉TTBS封閉，室溫振蕩1 h，Bcl-2(1∶700)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000) I 抗4 ℃孵育過夜，再以HRP偶聯(lián)的第II抗體(1∶2 500)作用，室溫振蕩1 h。ECL顯色。結果用軟件對條帶的灰度值進行分析。各目標蛋白的條帶灰度值與相應的GAPDH條帶灰度值的比值來反映該蛋白的相對表達量。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，各組大鼠間AI和Ki67陽性細胞百分比的比較運用Kruskal-Wallis檢驗，其余各數(shù)據(jù)多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey HSD檢驗法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1生化檢測結果及細胞因子含量測定

與control組相比，model組的血漿PT和血清ALT、TNF-α、IFN-γ及HMGB1水平在檢測時點顯著升高，而Ad0組與model組相比差異沒有統(tǒng)計學顯著性。與Ad0組相比，ALT、PT、TNF-α、IFN-γ及HMGB1水平在Ad-HGF組、Ad-HIL-6組及Ad-HGF-HIL-6組呈明顯下降趨勢，其中ALT、PT、IFN-γ及HMGB1水平以Ad-HGF-HIL-6組下降最為顯著。Ad-HGF-HIL-6組的血清TNF-α水平與Ad-HIL-6組相比下降趨勢更為明顯，而Ad-HGF-HIL-6組與Ad-HGF組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見表2。

表2　各組大鼠生化指標及血清細胞因子含量的檢測結果

**P<0.01vscontrol;×P<0.05vsAd0;ΨP<0.05vsAd-HIL-6;ΩP<0.05vsAd-HGF.

2肝組織學變化

光鏡下，model組及Ad0組均見肝組織壞死嚴重，肝索解離，小葉結構不能辨認， 肝細胞大片壞死，殘存少量肝細胞，凋亡細胞易見，匯管區(qū)可見大量淋巴細胞及中性粒細胞等炎性細胞浸潤。Ad-HGF組及Ad-HIL-6組肝組織病變稍輕，肝索部分解離，肝組織呈片狀或小灶狀壞死，肝竇擴張，炎細胞浸潤仍明顯可見。Ad-HGF-HIL-6組肝小葉結構基本正常，肝竇輕度擴張，肝細胞以變性為主，小葉內(nèi)仍可見少量點狀壞死及散在的炎性細胞，見圖1。

Figure 1.The histopathological changes of liver tissues in the rats with different treatments (HE staining,×100).

圖1各組大鼠肝臟組織學改變

3Ki67免疫組織化學染色結果的比較

Ki67定位于細胞核呈棕黃色，在model組及Ad0組有少量表達，散在分布于肝小葉內(nèi)。Ad-HGF組、Ad-HIL-6組及Ad-HGF-HIL-6組的陽性細胞顯著增多，在肝小葉內(nèi)呈彌漫性分布，其強度與肝臟增殖程度一致，其中以Ad-HGF-HIL-6組的表達最為強烈；而Ad0組與model組間的表達差異沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖2、表3。

Figure 2.Ki67 antigen expression in the liver tissues of the rats with different treatments (immunohistochemistry，×200).

圖2各組大鼠肝臟Ki67抗原的表達

4肝組織TUNEL檢測結果的比較

光鏡下，control組大鼠肝臟切片偶見肝細胞凋亡，model組及Ad0組陽性著色的凋亡肝細胞明顯增多，胞核呈均勻棕褐色，部分陽性著色肝細胞仍可見胞漿。凋亡的肝細胞散在于結節(jié)內(nèi)無分布規(guī)律，大小不完全相等。Ad-HGF組、Ad-HIL-6組及Ad-HGF-HIL-6組的陽性著色凋亡肝細胞較Ad0組明顯減少，以Ad-HGF-HIL-6組的變化最為顯著；而Ad0組與model組相比差異沒有統(tǒng)計學顯著性見圖3、表3。

Figure 3.TUNEL positive staining was showed in the liver tissues of the rats with different treatments (×400).

圖3各組大鼠肝臟的TUNEL檢測

表3不同處理對大鼠凋亡指數(shù)及Ki67+肝細胞百分比的影響

Table 3.Comparison of apoptotic index (AI) and percentage of Ki67+hepatocytes in the liver tissues of the rats with different treatments (Mean±SD.n=8)

Treatment AI(%)Ki67+hepatocytes(%)Control0.14±0.0110.37±5.24Model16.83±3.80**0.13±0.06**Ad015.97±3.530.17±0.07Ad-HIL-66.88±2.37×5.94±2.19×Ad-HGF7.60±1.99×6.27±2.40×Ad-HGF-HIL-62.18±0.86×ΨΩ11.95±3.38×ΨΩ

**P<0.01vscontrol;×P<0.05vsAd0;ΨP<0.05vsAd-HIL-6;ΩP<0.05vsAd-HGF.

5實時熒光定量PCR的結果

與Ad0組相比，Ad-HIL-6組及Ad-HGF-HIL-6組大鼠肝組織HIL-6的mRNA相對表達量顯著升高；Ad0組與model組或Ad-HGF組比較組間差異無統(tǒng)計學顯著性。與Ad0組相比，Ad-HGF組及Ad-HGF-HIL-6組大鼠肝組織HGF的mRNA相對表達量顯著升高，Ad0組與model組或Ad-HIL-6組相比，組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見表4。

6Western blot結果

Model組的Bcl-2蛋白的相對表達量比control組明顯降低；Ad-HGF組、Ad-HIL-6組、Ad-HGF-HIL-6組的Bcl-2比Ad0組明顯升高，且以Ad-HGF-HIL-6組升高最為顯著；model組的Bax相比control組明顯升高；Ad-HGF組、Ad-HIL-6組和Ad-HGF-HIL-6組的Bax相比Ad0組明顯降低，且以Ad-HGF-HIL-6組降低最為顯著；以上2種凋亡相關蛋白在Ad0組與mo-del組間比較，差異均無統(tǒng)計學顯著性，見圖4、表4。

Figure 4.The protein levels of Bcl-2 and Bax detected by Western blot.

圖4Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平

表4實時熒光定量PCR和Western blot表達相對值

Table 4.Protein levels of Bcl-2 and Bax detected by Western blot and mRNA levels of HIL-6 and HGF detected by real-time PCR (Mean±SD.n=6)

GroupmRNAProteinHIL-6HGFBcl-2Baxcontrol1.02±0.271.01±0.211.85±0.400.97±0.20model0.64±0.280.57±0.040.24±0.03**1.23±0.23**Ad01.08±0.150.64±0.170.24±0.051.22±0.20Ad-HIL-64.27±3.69×0.63±0.250.54±0.19×1.18±0.21×Ad-HGF0.49±0.011.68±5.13×0.81±0.20×1.12±0.27×Ad-HGF-HIL-64.92±1.34×2.46±7.79×0.93±0.41×ωЖ1.02±0.12×ωЖ

**P<0.01vscontrol;×P<0.05vsAd0;ωP<0.05vsAd-HIL-6;ЖP<0.05vsAd-HGF.

討　　論

HIL-6能顯著增強肝細胞的再生能力。Zvibel等[8]用一種重組分子IL-6c (即HIL-6)刺激培養(yǎng)的E14大鼠胎肝細胞，發(fā)現(xiàn)它能刺激胎肝細胞增殖且呈劑量依賴性效應，并影響相關基因的表達。Peters等[9]發(fā)現(xiàn)給予HIL-6能使用缺乏膽堿而添加乙硫氨酸(choline-deficient ethionine-supplemented，CDE)的飲食處理小鼠的受損肝臟卵圓細胞數(shù)目顯著增加，表明HIL-6可通過增加潛能肝細胞的增殖而影響肝細胞再生。HGF是最有效的肝絲裂原，對肝切除或化學損傷后的肝再生起著重要作用[10-11]。本實驗采用腺病毒載體將Hyper IL-6和HGF同時轉染大鼠ACLF模型，使兩者同時在模型大鼠體內(nèi)發(fā)揮積極作用而不相互干擾，避免了因增加腺病毒載體的劑量而可能產(chǎn)生的毒副作用。

肝組織病理學檢查及TUNEL染色結果表明Ad-HGF-HIL-6相比Ad-HIL-6或Ad-HGF能更好地促進肝細胞再生、減少凋亡及抑制炎癥反應。在ACLF發(fā)生發(fā)展過程中，系統(tǒng)性的炎癥反應與疾病的轉歸和預后息息相關[12]。TNF-α及IFN-γ是我們所熟知的炎癥細胞因子，先前的研究表明高表達的HMGB1在肝衰竭的發(fā)病機理中起著重要作用[13]，阻斷HMGB1能對ACLF模型大鼠產(chǎn)生保護作用[14]。本實驗中Ad-HGF-HIL-6組大鼠的血清ALT、IFN-γ及HMGB1和血漿PT水平明顯低于Ad-HIL-6或Ad-HGF組，血清TNF-α水平顯著低于Ad-HIL-6組，說明Ad-HGF-HIL-6相比Ad-HIL-6或Ad-HGF具有更強的抗炎和逆轉凝血障礙的能力。Western blot結果中Ad-HGF-HIL-6相比Ad-HIL-6或Ad-HGF能更有效地提高抗凋亡蛋白Bcl-2和降低促凋亡蛋白Bax水平，這些結果都為Ad-HGF-HIL-6相比Ad-HIL-6或Ad-HGF能更有效地抑制凋亡提供了證據(jù)。Real-time PCR檢測結果證明Ad-HGF-HIL-6、Ad-HIL-6和Ad-HGF這3種重組腺病毒構建成功并能在ACLF模型大鼠的肝臟組織中靶向表達，而HIL-6和HGF這2種基因的表達并沒有產(chǎn)生相互干擾。

基因治療是目前醫(yī)學研究的重要內(nèi)容，如何建立一個安全、高效、實用及可重復的基因轉移系統(tǒng)是基因治療用于臨床所面臨的重大問題。腺病毒載體由于它的嗜肝性而成為治療肝臟疾病的一種理想載體[15]。本實驗通過把HIL-6和HGF雙基因同時整合到重組腺病毒載體而證實了它們的相互協(xié)同作用，表明Ad-HGF-HIL-6比Ad-HIL-6或Ad-HGF能更好地促進慢加急性肝衰竭大鼠肝細胞的再生、減少凋亡及抑制炎癥反應而并不增加毒副作用。本實驗進一步開拓了基因治療促進肝再生和治療肝衰竭的前景，為慢加急性肝衰竭的基因治療提供了可靠的實驗室依據(jù)，其作用機制可能與炎癥因子及凋亡蛋白等相關，具體的信號通路還需要我們在以后的研究中進一步深入探討。Ad-HGF-HIL-6具有潛在的臨床應用前景，有望成為治療慢加急性肝衰竭的一種新型基因藥物。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Recombinant adenovirus containing hyper-interleukin-6 and hepatocyte growth factor enhances therapeutic efficacy on acute-on-chronic liver fai-lure in rats

GAO Dan-dan, FU Jia, QIN Bo, HUANG Wen-xiang, YANG Chun, JIA Bei

(DepartmentofInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,ChongqingKeyLaboratoryofInfectiousDiseasesandParasiticDiseases,Chongqing400016,China.E-mail:beijia7410@163.com)

AIM: To determine the therapeutic efficacy of recombinant adenovirus containing hyper-interleukin-6 (HIL-6) and hepatocyte growth factor (HGF) (Ad-HGF-HIL-6) on acute-on-chronic liver failure (ACLF) in rats using that of recombinant adenovirusHIL-6 orHGF(Ad-HIL-6 or Ad-HGF) for comparison. METHODS: The rat model of ACLF was established and the model rats were randomly divided into model group, Ad0 group, Ad-HGF group, Ad-HIL-6 group and Ad-HGF-HIL-6 group. The sera and liver tissues were collected for biochemical, pathological and molecular biological examinations.RESULTS: Compared with Ad0 group, prothrombin time (PT) and the serum levels of alanine aminotransferase (ALT), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) and high-mobility group box-1 (HMGB1) were markedly reduced in the ACLF rats treated with Ad-HGF, Ad-HIL-6 and Ad-HGF-HIL-6, and similarly, reduced hepatic damages and apoptotic activity, reduced Bax at protein level, and increased expression of Ki67 and Bcl-2 at protein levels were observed. Among them, treatment with Ad-HGF-HIL-6 showed the most significant therapeutic efficacy without obvious side effects.CONCLUSION: The therapeutic efficacy of Ad-HGF-HIL-6 is more potent than that of Ad-HGF or Ad-HIL-6 alone on ACLF rats with no significant side effects.

Acute-on-chronic liver failure; Hyper-interleukin-6; Hepatocyte growth factor; Recombinant adenovirus; Apoptosis

1000- 4718(2016)04- 0707- 06

2015- 11- 04

2016- 03- 02

重慶市自然科學基金資助項目(No. cstc2012jjA10052)；重慶市中青年醫(yī)學高端后備人才培養(yǎng)計劃

Tel: 023-89012427; E-mail: beijia7410@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.021

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