大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2動(dòng)態(tài)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究△

王玲　楊麗萍　劉夢(mèng)迎　王大博

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大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2動(dòng)態(tài)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究△

王玲楊麗萍＊?jiǎng)?mèng)迎王大博

目的建立大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，觀察濾過(guò)泡形成及瘢痕化過(guò)程中結(jié)膜及結(jié)膜下組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討TGF-β1及TGF-β2在濾過(guò)泡瘢痕化中的作用。方法選用健康成年雄性SD大鼠64只，隨機(jī)選取8只作為正常對(duì)照組，其余56只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組。右眼成功建立球結(jié)膜濾過(guò)泡模型。將實(shí)驗(yàn)組平均隨機(jī)分為7組，每組8只，術(shù)后觀察濾過(guò)泡的形成情況，監(jiān)測(cè)眼壓波動(dòng)情況；并于術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)分別處死，分別采用免疫熒光組織化學(xué)及Western印跡法檢測(cè)術(shù)區(qū)TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)部位及動(dòng)態(tài)表達(dá)量的變化。結(jié)果①所觀察術(shù)眼在術(shù)后第1天均能形成不同程度隆起明顯的濾過(guò)泡。濾過(guò)泡生存時(shí)間為7～22 d，平均13 d。②所觀察術(shù)眼在術(shù)后眼壓均明顯下降，后緩慢上升。平均于術(shù)后7 d時(shí)回歸術(shù)前基線水平，保持至觀察期結(jié)束。③免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示在濾過(guò)泡結(jié)膜組織上皮層、固有層均可見(jiàn)到TGF-β1及TGF-β2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。④Western印跡法結(jié)果顯示TGF-β1在術(shù)后1 d開(kāi)始明顯增高，持續(xù)增高至術(shù)后5、7 d達(dá)峰值，隨后逐漸降低至術(shù)后28 d，但仍高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=431.918 ,P<0.01)。TGF-β2在術(shù)后1 d開(kāi)始明顯增高，持續(xù)增高至術(shù)后7 d達(dá)峰值，隨后逐漸降低至術(shù)后28 d，但仍高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 674.323,P<0.01)。結(jié)論前房引流管植入術(shù)可成功建立大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型。TGF-β1及TGF-β2參與了球結(jié)膜濾過(guò)泡的形成及瘢痕化進(jìn)程。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2016，16：313-318)

青光眼濾過(guò)性手術(shù)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2；瘢痕化；大鼠

青光眼是一組以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，病理性眼壓增高是其發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。青光眼濾過(guò)性手術(shù)是當(dāng)前公認(rèn)降低眼壓最理想的干預(yù)措施，但其失敗率依然達(dá)10%～30%[1]。目前研究[2]顯示，青光眼濾過(guò)區(qū)濾過(guò)泡消失主要是由于傷口周圍成纖維細(xì)胞大量增殖造成的。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是存在于細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)締組織，在病理情況下，ECM的原有平衡也會(huì)被打破，在炎癥反應(yīng)、新生血管生成、腫瘤局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病理進(jìn)程中起到重要作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)能夠特異性增加ECM的合成，刺激膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等分泌增加，同時(shí)抵制其降解酶的活化，減少ECM降解，促使ECM 沉積[3]。TGF-β通過(guò)對(duì)炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞強(qiáng)烈的趨化、吸引作用，使得這些細(xì)胞創(chuàng)傷局部大量聚集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。TGF-β還可以刺激成纖維細(xì)胞分泌纖維粘連蛋白，并增加它們?cè)贓CM 中積聚[4]。

為進(jìn)一步研究青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)泡形成及瘢痕化進(jìn)程中TGF-β發(fā)揮的作用，我們通過(guò)在大鼠前房?jī)?nèi)植入引流管成功建立球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，術(shù)后觀察濾過(guò)泡形成及眼部反應(yīng)，監(jiān)測(cè)眼壓波動(dòng)情況，采用Western印跡法觀察TGF-β1及TGF-β2在濾過(guò)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β1及TGF-β2在濾過(guò)區(qū)的表達(dá)部位。研究TGF-β1及TGF-β2在大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，為下一步青光眼術(shù)后瘢痕化的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，6～8周，重250～300 g。于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SPF級(jí))飼養(yǎng)。所有鼠眼術(shù)前均經(jīng)裂隙燈、直接檢眼鏡檢查，排除眼部疾患。從中隨機(jī)選取8只作為正常對(duì)照組，不做任何處理；其余56只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，并隨機(jī)平均分為7組，每組8只。隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)組大鼠，剪取大鼠濾過(guò)術(shù)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織進(jìn)行Western印跡法檢測(cè)；取另3只大鼠完整眼球做冷凍切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)眼行前房引流管植入術(shù)，成功建立大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型。

1.2球結(jié)膜濾過(guò)泡動(dòng)物模型的制備將10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射入大鼠體內(nèi)(推注不宜過(guò)快)，誘導(dǎo)其全身麻醉；眼部滴用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，0.25%氯霉素滴眼液沖洗Tenons囊2次；0.5%聚維酮碘(碘伏)消毒術(shù)眼，范圍為眼瞼以外2 cm，鋪無(wú)菌洞巾內(nèi)。參照Sherwood等[5]前房引流管植入法，大鼠眼球顳上方角膜緣后2～2.5 mm處以角膜緣為基底做長(zhǎng)2～3 mm的結(jié)膜瓣；剪開(kāi)球結(jié)膜，鈍性分離Tenons囊至鞏膜面，距角膜緣約0.5 mm處用24 G胰島素針針頭穿刺鞏膜進(jìn)入前房；并向前房?jī)?nèi)注入黏彈劑，以維持前房。取25 G長(zhǎng)3～4 mm的微管(硅膠管，北京醫(yī)用橡膠制品研究所)，將穿入前房端剪成斜面，末端為平面，保持斜面向上，沿鞏膜隧道穿刺入前房。因植管與鞏膜隧道連接相對(duì)緊密，不需要縫線等固定位置。植管后即可見(jiàn)管末端有液體流出。10-0絲線連續(xù)縫合球結(jié)膜及Tenons囊。術(shù)后結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。術(shù)后注意保溫，待大鼠麻醉完全蘇醒后，送回動(dòng)物房飼養(yǎng)。手術(shù)操作及術(shù)后觀察均由同一人完成。術(shù)后3 d內(nèi)常規(guī)雙眼滴用0.25%氯霉素滴眼液，2次/d，預(yù)防手術(shù)區(qū)感染。

1.3試劑和儀器立體顯微鏡(解剖顯微鏡)(OLYMUS MODEL SZ2-ILST，日本)；冷凍切片機(jī)(LEICA CM1950，德國(guó))；熒光顯微鏡(LEICA DFC480，德國(guó))；最佳切削溫度(optimal cutting temperature, OCT)包埋劑(美國(guó)櫻花)；電轉(zhuǎn)移裝置(Bio-Rad公司，美國(guó))；垂直板蛋白電泳槽(Bio-Rad公司，美國(guó))；24 G胰島素穿刺針(日本)；硅膠管(北京醫(yī)用橡膠制品研究所)；眼壓計(jì)(陜西達(dá)明生物科技有限公司)；免疫熒光一抗：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1( 美國(guó)Abcam公司，按1∶100稀釋成工作液)、小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2 ( 美國(guó)Abcam公司，按1∶500稀釋成工作液)；免疫熒光二抗：Cy3標(biāo)記的山羊抗兔抗體(中國(guó)康為世紀(jì)公司，按1∶100稀釋成工作液)；Western一抗：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1 ( 美國(guó)Abcam公司，按1∶400稀釋成工作液)，小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(美國(guó)Abcam公司，1∶5 000)；Western二抗：山羊抗兔抗體(中國(guó)康為世紀(jì)公司，按1∶5 000稀釋成工作液)；Western內(nèi)參：抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)鼠單克隆抗體(中國(guó)康為世紀(jì)公司,按1∶3 000稀釋成工作液)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(中國(guó)碧云天公司,按1∶4 000稀釋成工作液)。

1.4術(shù)后一般情況的觀察及處理手術(shù)后觀察大鼠的一般情況及在裂隙燈顯微鏡下的術(shù)眼反應(yīng)。術(shù)后1周內(nèi)每天觀察，手術(shù)1周后觀察頻率改為每2天1次。每次觀察后雙眼結(jié)膜囊內(nèi)均涂布適量紅霉素眼膏。

1.5正常及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的眼壓測(cè)量用Tonolab眼壓計(jì)測(cè)量正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的大鼠眼壓(選取用于Western印跡法檢測(cè)的5只大鼠眼球)。按0.3 mL/100 g體重的劑量對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛誘導(dǎo)全麻，眼角膜表面點(diǎn)用0.4%鹽酸奧布卡因表面麻醉藥。取Tonolab眼壓計(jì)，保持測(cè)量探頭水平，使其在距離角膜3～ 5 mm 的角膜頂點(diǎn)處與視軸的夾角在25°范圍內(nèi)[6]。每只觀察眼均測(cè)量6次，記錄所有數(shù)據(jù)。

1.6取材及標(biāo)本的處理對(duì)照組的8只大鼠在購(gòu)買后于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周處死。7個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠，各組隨機(jī)選取5只大鼠用于Western印跡法檢測(cè)，同時(shí)測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)大鼠眼壓；另3只大鼠用于免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)組56只大鼠于手術(shù)完成后1、3、5、7、14、21、28 d分別處死。對(duì)隨機(jī)選取的5只大鼠，剪取大鼠濾過(guò)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量曲線對(duì)樣本定量后行Western印跡法檢測(cè)；對(duì)另3只大鼠完整眼球，仔細(xì)解剖摘除后用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)沖凈血跡，OCT包埋，做冷凍切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色。

1.7Western印跡法測(cè)各樣本TGF-β1及TGF-β2表達(dá)各樣本使用等量總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白印跡轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。封閉液置室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液；兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(1∶400)或小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(1∶5 000)，室溫孵育2 h。PBS-T漂洗，每次10 min，共3次。再加入二抗；山羊抗兔抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。PBS-T漂洗，每次10 min，共3次。采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法顯跡，在柯達(dá)感光底片上曝光1 min，保存分析結(jié)果。每個(gè)標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)中至少重復(fù)檢測(cè)3次。將顯影后X線片掃描成圖片后，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰密度值讀數(shù)，數(shù)值以測(cè)得GAPDH的灰度掃描為基線水平。

1.8免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)各樣本MMP-2及TIMP-2表達(dá)摘除大鼠眼球，用PBS沖凈眼球上的血跡，用OCT 包埋后，置于冷凍切片機(jī)切片(6 μm)。4%多聚甲醛固定15 min，PBS-T緩沖液沖洗2次，阻斷液(5%BSA，PBS-T，0.5%TritonX-100)室溫封閉30 min；加入按說(shuō)明書(shū)說(shuō)明的以及根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果稀釋至適當(dāng)濃度一抗工作液：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(1∶100)、小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(1∶500)，4 ℃孵育(陰性對(duì)照一抗加PBS)過(guò)夜；PBS-T緩沖液漂洗3次；加入二抗：Cy3標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶100)，37 ℃恒溫箱孵育1 h(從二抗孵育開(kāi)始注意避光)；PBS-T緩沖液漂洗3次；DAPI(1∶4 000)染核5 min，緩沖液漂洗后用熒光顯微鏡觀察拍照。

2　結(jié)果

2.1術(shù)后大鼠全身一般情況和眼前節(jié)情況術(shù)后大鼠全身一般情況良好，飲食正常，精神尚佳，活動(dòng)靈活。眼前節(jié)情況：眼瞼無(wú)明顯紅腫，結(jié)膜囊干凈，球結(jié)膜切口對(duì)合好，縫線在位。濾過(guò)泡完整無(wú)滲漏，呈不同程度隆起。角膜透明，無(wú)明顯水腫及上皮缺損。前房深度正常，無(wú)出血，房水中可見(jiàn)不同程度的房水閃輝和房水細(xì)胞，均在術(shù)后2～4 d內(nèi)消失。瞳孔圓形居中，光反應(yīng)良好。晶狀體透明。

2.2結(jié)膜濾過(guò)泡形成情況以手術(shù)后有無(wú)形成結(jié)膜濾過(guò)泡作為判斷手術(shù)效果的標(biāo)準(zhǔn)[2]。觀察組術(shù)眼在術(shù)后第1天均能形成不同程度隆起明顯的濾過(guò)泡。濾過(guò)泡維持時(shí)間為7～22 d，平均生存時(shí)間是13 d。4～5 d濾過(guò)泡表面開(kāi)始出現(xiàn)血管化。

2.3正常及術(shù)后眼壓情況用Tonolab眼壓計(jì)測(cè)量正常組大鼠眼壓及實(shí)驗(yàn)組大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型制作術(shù)后的眼壓情況，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖1。利用SPSS17.0進(jìn)行各組間眼壓值單因素方差分析：F=4.382，P=0.007，各組間眼壓相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩相比：術(shù)后1、3、5 d眼壓低于正常組，術(shù)后1 d眼壓與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，術(shù)后3、5 d眼壓與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011、0.036)；術(shù)后7、14、21、28 d眼壓與正常組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.900、1.000、0.974、0.988)。

圖1.　正常及青光眼濾過(guò)泡模型制作術(shù)后各組眼壓情況

2.4Western印跡法檢測(cè)TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)情況(圖2)。

圖2.　Western印跡法TGF-β1及TGF-β2的水平表達(dá)

術(shù)后實(shí)驗(yàn)組中TGF-β1隨手術(shù)后時(shí)間變化呈明顯峰型變化，術(shù)后1 d即明顯增加，術(shù)后5、7 d表達(dá)量達(dá)到峰值，以后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但仍高于正常對(duì)照組(圖3)。各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=431.918，P=0.000)，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量與術(shù)前相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組濾過(guò)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較結(jié)果顯示，TGF-β1含量在術(shù)后1 d與術(shù)后28 d以及術(shù)后5 d和術(shù)后7 d間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.097、0.621)，其余兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3.　Western印跡法檢測(cè)大鼠濾過(guò)術(shù)區(qū)組織中TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量

術(shù)后實(shí)驗(yàn)組中TGF-β2隨手術(shù)后時(shí)間變化呈明顯峰型變化，術(shù)后1 d即明顯增加，術(shù)后7 d表達(dá)量達(dá)到峰值，以后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但仍高于正常對(duì)照組(圖4)。各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=674.323，P=0.000)。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)量與術(shù)前相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組濾過(guò)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較結(jié)果顯示，TGF-β2含量在術(shù)后1 d與術(shù)后28 d間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.779)，其余2個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4.　Western印跡法檢測(cè)大鼠濾過(guò)術(shù)區(qū)組織中TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.5免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)正常組織及濾過(guò)泡組織中TGF-β1的表達(dá)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組：在正常結(jié)膜組織中可觀察到TGF-β1在結(jié)膜上皮層有較弱陽(yáng)性表達(dá)，固有層基本無(wú)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組：術(shù)后7、28 d顯示TGF-β1在濾過(guò)泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見(jiàn)到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖5)。正常組織及濾過(guò)泡組織中TGF-β2的表達(dá)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組：TGF-β2正常組織結(jié)膜上皮層見(jiàn)較弱陽(yáng)性表達(dá)，固有層基本無(wú)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7、28 d顯示TGF-β2在濾過(guò)泡結(jié)膜組織上皮層、固有層可見(jiàn)到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖6)。

圖5.　正常組織及濾過(guò)泡組織中TGF-β1的表達(dá)(免疫熒光化學(xué)染色×100倍)　A為正常對(duì)照組：在正常結(jié)膜組織中可觀察到TGF-β1在結(jié)膜上皮層有較弱陽(yáng)性表達(dá)，固有層基本無(wú)表達(dá)；B為術(shù)后7 d，C為術(shù)后28 d：TGF-β1在濾過(guò)泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見(jiàn)到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；D為陰性對(duì)照組(術(shù)后7 d一抗用PBS代替)：無(wú)陽(yáng)性表達(dá)

圖6.　正常組織及濾過(guò)泡組織中TGF-β2的表達(dá)(免疫熒光化學(xué)染色×100倍)　A為正常對(duì)照組：TGF-β2正常組織結(jié)膜上皮層見(jiàn)較弱陽(yáng)性表達(dá)，固有層基本無(wú)表達(dá)；B為術(shù)后7 d, C為術(shù)后28 d：TGF-β2在濾過(guò)泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見(jiàn)到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；D為陰性對(duì)照組(術(shù)后7 d一抗用PBS代替)：無(wú)陽(yáng)性表達(dá)

3　討論

我們采用前房引流管植入術(shù)成功制作大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型。與正常組大鼠眼壓相比，大鼠濾過(guò)術(shù)后1 d眼壓明顯降低，后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，直至術(shù)后7 d時(shí)達(dá)到正常眼壓水平并一直保持穩(wěn)定。Sherwood等[5]在SD大鼠眼前房?jī)?nèi)植入30 G硅膠管將房水引流至結(jié)膜下，制作大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡瘢痕化模型，結(jié)果顯示濾過(guò)術(shù)后眼壓迅速下降，術(shù)后5～6 d時(shí)恢復(fù)至術(shù)前平均水平。本實(shí)驗(yàn)研究大鼠術(shù)后眼壓回歸術(shù)前基線水平長(zhǎng)于以上研究的原因：可能在于本實(shí)驗(yàn)所用硅膠管為24 G，略粗于30 G，因此濾過(guò)道較為粗大，濾過(guò)更為通暢，濾過(guò)道因周圍組織瘢痕化而完全閉合所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

本研究中采用免疫熒光組織化學(xué)觀察了正常大鼠及球結(jié)膜濾過(guò)泡模型中球結(jié)膜及結(jié)膜下組織中TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)部位。結(jié)果顯示，TGF-β1及TGF-β2表達(dá)部位基本一致，在正常結(jié)膜組織中只有結(jié)膜上皮層有弱陽(yáng)性表達(dá)，固有層基本無(wú)表達(dá)；而在濾過(guò)泡模型的結(jié)膜組織上皮層、固有層均可見(jiàn)到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后7 d球結(jié)膜濾過(guò)泡彌散隆起，結(jié)膜下組織疏松，可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)彌散分布；術(shù)后28 d球結(jié)膜濾過(guò)泡不明顯，結(jié)膜下致密結(jié)締組織也可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)。Western印跡法檢測(cè)TGF-β1及TGF-β2在濾過(guò)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，結(jié)果顯示兩者呈明顯峰型變化，術(shù)后1 d表達(dá)量顯著升高，術(shù)后7 d表達(dá)量最高，其后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，但仍高于正常對(duì)照組。手術(shù)操作本身可導(dǎo)致血-房水屏障的破壞，血漿及血小板分泌釋放TGF-β前體至傷口周圍，同時(shí)手術(shù)區(qū)局部組織亦可分泌TGF-β，因此出現(xiàn)術(shù)后1 d的TGF-β局部表達(dá)量明顯增加。濾過(guò)術(shù)區(qū)局部高濃度的TGF-β刺激濾過(guò)術(shù)區(qū)結(jié)膜囊成纖維細(xì)胞，使其分泌TGF-β的功能上調(diào)；然后濾過(guò)術(shù)區(qū)活化的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等開(kāi)始分泌TGF-β。因此創(chuàng)傷初期階段局部TGF-β濃度持續(xù)上升，至7 d時(shí)達(dá)峰值。

學(xué)者們?cè)噲D以TGF-β抗體來(lái)干預(yù)青光眼濾過(guò)術(shù)后瘢痕的形成，預(yù)期達(dá)到延長(zhǎng)濾過(guò)泡壽命的效果，做了相關(guān)研究[7-9]。在動(dòng)物模型研究中，應(yīng)用抗TGF-β2抗體時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)周圍組織也沒(méi)有產(chǎn)生明顯毒副作用，組織耐受性好[10-13]。Siriwardena等[9]將人TGF-β2單克隆抗體CAT-152用于臨床試驗(yàn)，在手術(shù)即刻的前后，手術(shù)后1、7 d結(jié)膜下分別注射CAT-152或安慰劑，經(jīng)過(guò)手術(shù)后12個(gè)月的隨訪，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組青光眼濾過(guò)泡形態(tài)彌散、濾過(guò)泡組織無(wú)囊變及無(wú)血管化；眼壓降低的程度在手術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月最為明顯；2組間手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率無(wú)顯著性差異，且實(shí)驗(yàn)組也沒(méi)有發(fā)生與CAT-152應(yīng)用相關(guān)的嚴(yán)重副作用。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，他們認(rèn)為CAT-152在青光眼濾過(guò)術(shù)后抗瘢痕化形成中能夠發(fā)揮全新、有效的作用，在臨床應(yīng)用中具有樂(lè)觀的發(fā)展空間。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果著實(shí)令人鼓舞，因此吸引了更多學(xué)者參與CAT-152的抗瘢痕化研究中，然而另有學(xué)者[14-15]所做CAT-152的Ⅲ期臨床試驗(yàn)并未得到人們所期待的結(jié)果，研究顯示CAT-152對(duì)青光眼患者濾過(guò)術(shù)后預(yù)防濾過(guò)術(shù)失敗并無(wú)明顯作用。分析既然TGF-β可促進(jìn)濾過(guò)泡的瘢痕形成，但抑制TGF-β后并沒(méi)有提高濾過(guò)手術(shù)的成功率，這可能與其復(fù)雜的生物學(xué)特性及多種細(xì)胞因子參與濾過(guò)泡的瘢痕形成有關(guān)。因此，有必要采用系列研究進(jìn)一步探討濾過(guò)泡的形成及瘢痕化進(jìn)程中結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β的動(dòng)態(tài)表達(dá)及濾過(guò)泡形態(tài)學(xué)改變的相關(guān)性。在前期研究中，我們采用前房引流管植入術(shù)成功制作大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周左右，濾過(guò)泡表現(xiàn)出活躍的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)；而在2周內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)中的瘢痕形成最為關(guān)鍵，成纖維細(xì)胞增生活躍，致使瘢痕化形成。在本研究濾過(guò)泡結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β的動(dòng)態(tài)表達(dá)中，我們也發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周左右，TGF-β1及TGF-β2的表達(dá)達(dá)高峰，與術(shù)區(qū)成纖維細(xì)胞的增生及膠原纖維的堆積密切相關(guān)且相一致。本研究從TGF-β的角度入手，尋求抑制青光眼濾過(guò)術(shù)后瘢痕形成的新治療手段或新干預(yù)藥物，提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯 諸靜英)

Dynamic expression of transforming growth factor β1 and transforming growth factor β2 in conjunctival filtering bleb of rats

WANGLing,YANGLi-ping＊,LIUMeng-ying,WANGDa-bo.

DepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China

WANG Ling, Email: tsingtaowl@hotmail.com

ObjectiveTo establish a model of conjunctival filtering bleb in rats and to observe the expression and discuss the effects of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and transforming growth factor β2(TGF-β2) in conjunctival and subconjunctival tissue in the filtering bleb formation and scarring. MethodsSixty-four healthy and adult male SD rats were included. Eight rats were randomly selected as the normal control group. The remaining 56 rats were chosen as the experimental group, whose right eyes were established conjunctival bleb model by anterior chamber drainage tube implantation.The experimental group was randomly divided into 7 subgroups. The formations of filtering bleb were observed, and the intraocular pressure fluctuations were monitored after the surgery. The expression and sites of TGF-β1 and -β2 were detected by semi-quantitative Western blot analysis and immunofluorescent staining . Results①Different extents and obviously bulgy filtering blebs can be formed in all the eyes of the rats on the first day after the surgery. All the filtering blebs maintained 7～22 days, with average of 13 days. ②All the intraocular pressures of the eyes declined obviously right after surgery, then slowly rose. The intraocular pressures returned to preoperative level on the 7th day after the surgery on average，and kept normal to the end of the observation period. ③The results of immunofluorescent staining showed that TGF-β1 and -β2 were found to be expressed in conjunctival epitheliumin and subconjunctival tissue in the conjunctival filtering bleb tissue. ④Results of Western blot showed that TGF-β1 began to rise on the first day after the surgery, and kept rising to the peak on the 5th day or 7th day after the surgery, then gradually reduced until 28 days after the surgery, but still higher than that in the control group. There was significant difference between the two groups (F=431.918 ,P<0.01). TGF-β2 began to rise on the first day after the surgery, and kept rising to the peak on the 7th day after the surgery, then gradually reduced until 28 days after surgery, but still higher than that in the control group. There was significant difference between the two groups (F= 674.323,P<0.01).ConclusionsThe rat model of conjunctival filtering bleb can be established by drainage tube implantation.TGF-β1 and -β2 participate in the process of conjunctival filtering bleb formation and scarring. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:313-318)

Glaucoma filtering surgery;Transforming growth factor β1; Transforming growth factor β2; Scarring; Rat

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目(BS2010SW008)

青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科青島266003；＊山東省青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院眼科青島266003

王玲(Email: tsingtaowl@hotmail.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.003

2015-10-29)