變應(yīng)性鼻炎同位素標(biāo)記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究△

張健　趙煜　盧曉清　吳建

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變應(yīng)性鼻炎同位素標(biāo)記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究△

張健趙煜盧曉清吳建

目的研究變應(yīng)性鼻炎(AR)患者鼻黏膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，從蛋白質(zhì)水平探討AR的發(fā)病機(jī)制。方法采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)檢測正常成年人及AR患者中鼻道鼻腔黏膜中的蛋白表達(dá)譜，每組4例，篩選差異表達(dá)蛋白。結(jié)果在AR患者鼻黏膜與正常人鼻黏膜之間篩選出大量差異表達(dá)蛋白。上調(diào)蛋白60個(gè)，主要包括嗜酸性粒細(xì)胞溶血磷脂酶(CLC)、普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)蛋白7(PLEKHA7)等；下調(diào)蛋白160個(gè)，主要包括腦惡性腫瘤缺失基因(DMBT1)、S100鈣結(jié)合蛋白(S100A1)等。結(jié)論AR患者鼻黏膜與正常人鼻黏膜蛋白表達(dá)差異明顯，其中CLC的上調(diào)與 DMBT1的下調(diào)可能參與鼻黏膜的炎癥及免疫應(yīng)答反應(yīng)。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：309-312)

鼻炎，變應(yīng)性；蛋白質(zhì)組學(xué)；同位素標(biāo)記相對和絕對定量

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病和多發(fā)病，主要表現(xiàn)為鼻癢、打噴嚏等，臨床難以根治，多以控制鼻部癥狀為主。截至目前，其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究在前期應(yīng)用基因芯片研究AR發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上[1-2]，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究正常鼻黏膜組織與AR鼻黏膜組織之間的差異表達(dá)蛋白，并分析差異表達(dá)蛋白的功能，從蛋白質(zhì)水平探討AR的發(fā)病機(jī)制。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)組：AR患者中鼻道鼻腔黏膜組織；對照組：無鼻部疾病的正常成年人中鼻道鼻腔黏膜組織，每組4例。均為本科住院患者，年齡30～65歲，平均(41.00±3.12)歲；均為男性。取得標(biāo)本前均得到受試者同意并簽署知情同意書。所有患者無哮喘史及阿司匹林過敏史，皮膚過敏原試驗(yàn)呈陽性，術(shù)前2周未使用抗生素及類固醇激素。AR的診斷依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO) 標(biāo)準(zhǔn)、過敏史及經(jīng)皮膚過敏原試驗(yàn)(Lofarma, Milan, Italy)。術(shù)中取出標(biāo)本后，迅速用生理鹽水沖洗，去除血液及碎骨片；再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗，錫箔紙包裹嚴(yán)密，置于塑料凍存管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品裂解和蛋白質(zhì)定量標(biāo)本樣品解凍后進(jìn)行裂解。蛋白質(zhì)樣品定量采取對其氨基酸序列上的色氨酸進(jìn)行熒光光譜定量的方法。色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白質(zhì)樣品都用緩沖液(8 mol/L尿素+20 mmol/L Tris/HCl, pH=7.6)稀釋，并用熒光分光光度計(jì)(Varian, Palo Alto, CA)檢測其中色氨酸的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出樣品中色氨酸的濃度，除以1.3%后得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。然后進(jìn)行1D十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和膠圖銀染，對樣品選取，蛋白質(zhì)抽提和定量步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制。

1.2.2蛋白質(zhì)酶解100 μg樣品加入10 ×103超濾管，12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL UA 緩沖液(8 mol/L 尿素， 100 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷， pH=8.5)，12 000×g離心，棄去濾出液。加入終濃度為50 mmol/L 吲哚乙酸(使用UA 緩沖液溶解)，避光室溫反應(yīng)20 min。12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL UA 緩沖液，12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL 50 mmol/L 四乙基溴化氨，12 000×g離心，棄去濾出液。重復(fù)2遍。加入2 μg 質(zhì)譜測序級胰酶(Promega, V5113)，37 ℃酶解過夜。12 000×g離心，20 min后收集濾出液，冷凍干燥。 酶解后的肽段再次進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，對酶解步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制。

1.2.3同位素標(biāo)記相對和絕對定量和強(qiáng)陽離子肽段分級同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 的8叢試劑放置到室溫，使用50 μL 異丙醇溶解，加入到各個(gè)樣品中，室溫300 轉(zhuǎn)/min振蕩反應(yīng)2 h；各管加入50 μL 去離子水，室溫300 轉(zhuǎn)/min振蕩反應(yīng)30 min終止標(biāo)記反應(yīng)。合并各個(gè)樣品，充分振蕩混勻后分裝，20 μg/管，真空冷凍干燥保存。1.2.4LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定色譜柱為實(shí)驗(yàn)室自制的直徑 75 μm、長 15 cm 的 C18 反相毛細(xì)管色譜柱。流速為250 nL/min，全程分析時(shí)間為240 min/餾分。肽段洗脫梯度為流動(dòng)相 B(含 0.1%甲酸的乙腈)在 208 min內(nèi)從 6% 增加至 20%。208～228 min內(nèi)從20%增加至35%，其后2 min內(nèi)升至90%并維持至240 min。1.2.5數(shù)據(jù)庫搜索和定量信息提取質(zhì)譜產(chǎn)生的原始文件使用Proteome Discoverer(1.3版本，Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫搜索產(chǎn)生的結(jié)果用Proteomics Tool Suite(3.8.0版本)進(jìn)行譜圖篩選，校正同位素標(biāo)簽純度，定量數(shù)據(jù)整合。1.2.6篩選標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩兩比較用最小顯著差異(least significant difference, LSD)法。差異蛋白標(biāo)準(zhǔn)是fold<0.83 或 fold>1.2,且P<0.05。

2　結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)抽提產(chǎn)物1D SDS-PAGE各個(gè)樣品的蛋白質(zhì)抽提產(chǎn)物SDS-PAGE 總體分布模式在相同的樣品分組中比較類似，蛋白質(zhì)電泳行為正常，降解現(xiàn)象不明顯，蛋白質(zhì)定量比較一致，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究分析的要求(圖1)。

圖1.　蛋白質(zhì)抽提產(chǎn)物1D SDS-PAGE　A～H條帶表示每個(gè)樣本中總蛋白的凝膠結(jié)果

2.2蛋白質(zhì)組鑒定和定量控制肽段和蛋白質(zhì)假陽性率<0.01，總共得到14 694條非冗余肽段，對應(yīng)于2 463個(gè)蛋白質(zhì)組，在8個(gè)iTRAQ通道中都存在定量信息。iTRAQ各個(gè)通道的蛋白質(zhì)定量數(shù)值在整體上分布均一，所有通道內(nèi)蛋白分子量Log2對數(shù)值的上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)基本保持在同一水平(圖2)，未經(jīng)校正的原始數(shù)據(jù)總體分布的差異小。結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)iTRAQ定量標(biāo)記實(shí)驗(yàn)具有嚴(yán)格質(zhì)量控制和優(yōu)秀的質(zhì)譜定量能力。

圖2.　iTRAQ原始定量結(jié)果箱線圖分布　橫向1113～1121為各個(gè)樣本的iTRAQ穩(wěn)定同位素化學(xué)標(biāo)記通道，縱向?yàn)橥ǖ纼?nèi)蛋白相對分子質(zhì)量Log2對數(shù)值

2.3蛋白質(zhì)定量頻率分布進(jìn)一步對各個(gè)樣品考查蛋白質(zhì)定量頻率分布(圖3)。各個(gè)樣品的分布高度一致，峰值集中在20～23之間，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)良好的數(shù)據(jù)重復(fù)性和定量精確性。

圖3.　蛋白質(zhì)定量頻率分布　橫坐標(biāo)為各通道蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的Log2對數(shù)值，縱坐標(biāo)為相對應(yīng)的蛋白質(zhì)密度

2.4實(shí)驗(yàn)處理組兩兩相關(guān)性考查原始數(shù)據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組兩兩相關(guān)性(圖4)，數(shù)據(jù)的總體相關(guān)性非常優(yōu)秀，R2在0.97～1范圍內(nèi)分布。結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)iTRAQ定量結(jié)果數(shù)據(jù)具有良好的重復(fù)性和數(shù)據(jù)可信度。

2.5差異蛋白篩選結(jié)果AR患者鼻黏膜及正常人鼻黏膜之間篩選出220個(gè)差異表達(dá)蛋白。上調(diào)蛋白60個(gè)，其中上調(diào)2倍以上蛋白17個(gè)，包括嗜酸性粒細(xì)胞溶血磷脂酶 (eosinophil lysophospholipase，CLC)、 普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)蛋白7(pleckstrin homology domain containing family A member 7 ，PLEKHA7)等；下調(diào)蛋白160個(gè)，其中下調(diào)超過50%以上蛋白65個(gè)，主要包括腦惡性腫瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors 1 protein,DMBT1)、S100鈣結(jié)合蛋白(S100A1)等。這些蛋白涉及炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種生理過程。

圖4.　數(shù)據(jù)兩兩相關(guān)性　每2個(gè)通道之間兩兩比較，得出相似比R2

2.6差異蛋白功能分析選取差異最為明顯的4個(gè)蛋白質(zhì)對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，并對其應(yīng)用GO-MF(蛋白組數(shù)據(jù)自動(dòng)分析系統(tǒng))進(jìn)行功能分析(表1)。

表1　AR鼻黏膜差異蛋白質(zhì)GO-MF功能分析

3　討論

AR的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。我們課題組前期應(yīng)用基因芯片研究變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制，結(jié)果提示炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子對AR的發(fā)生可能起很重要的作用[1-2]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，檢測了AR患者中鼻道鼻腔黏膜與正常成年人中鼻道鼻腔黏膜蛋白表達(dá)譜，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)蛋白。其中差異最為明顯的有CLC、PLEKHA7、S100A1和DMBT1。

3.1CLCCLC廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，被認(rèn)為與磷脂代謝密切相關(guān)，在嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)蛋白中占有很大比例[3-4]。顆粒內(nèi)超微結(jié)構(gòu)分析表明，CLC主要與炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]，其主要生物學(xué)功能是將溶血卵磷脂水解成為甘油磷脂酰膽堿及少量游離脂肪酸。溶血磷脂是細(xì)胞骨架的重要組成部分，因此CLC在維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性方面具有重要作用，而AR的病理學(xué)特點(diǎn)正是嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CLC有大幅度上調(diào)，上調(diào)2倍以上，這與Ghafouri等[6]對AR患者鼻腔沖洗液進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果相符合。同時(shí)，Bryborn等[7]也據(jù)此進(jìn)行了基因驗(yàn)證，推測CLC的遺傳變異與AR相關(guān)。我們的研究結(jié)果認(rèn)為，可能的原因是CLC引起鼻黏膜細(xì)胞骨架破壞，導(dǎo)致鼻黏膜細(xì)胞壞死或者凋亡，釋放一系列細(xì)胞因子，觸發(fā)或者進(jìn)一步加重了鼻腔黏膜局部的變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致AR的發(fā)生。

3.2PLEKHA7PLEKHA7是一種附著鏈接蛋白，對維持黏膜上皮細(xì)胞穩(wěn)定性具有重要作用。PLEKHA7為黏附小帶的生發(fā)和形態(tài)、功能維持所必需，主要與閉角型青光眼有關(guān)[8]。目前關(guān)于PLEKHA7與AR之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AR患者中鼻道鼻腔黏膜與正常成年人中鼻道鼻腔黏膜蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，推測其在AR鼻黏膜中高表達(dá)，可能破壞了鼻黏膜上皮的穩(wěn)定性，引起局部鼻黏膜損傷，從而導(dǎo)致AR發(fā)作。

3.3S100A1S100A1為S100大家族中的一員，屬于鈣結(jié)合蛋白，具備細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)活性，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，其主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度，進(jìn)而影響蛋白磷酸化，最終可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞膜上離子通道及電生理過程的調(diào)控。王鑫等[9]在研究伴有AR的鼻息肉免疫相關(guān)基因表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組織較正常組織相比，S100A2表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中S100A1顯著下調(diào)，與本課題組前期的基因芯片研究結(jié)果及王鑫等[9]的結(jié)果接近，提示S100A1與AR有密切聯(lián)系，可能是調(diào)節(jié)鼻黏膜細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度，導(dǎo)致AR發(fā)生，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。3.4與前期基因芯片研究結(jié)果對比我們將本次蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果與本課題組前期的基因芯片研究結(jié)果對比[1-2]?；蛐酒芯拷Y(jié)果顯示：DMBT1表達(dá)明顯下調(diào)；本蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，DMBT1表達(dá)亦明顯下調(diào)。

DMBT1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因。Kang等[10]認(rèn)為，DMBT1與上皮發(fā)育有密切關(guān)系，DMBT1能將上皮重建的調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)聯(lián)系起來，在維持黏膜上皮局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。Reichhardt等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DMBT1在新生兒糞便及羊水中含量較高，尤其是在胎糞中更是占到所有蛋白總量的4%～10%，最終認(rèn)為DMBT1在新生兒的先天性免疫機(jī)制中有重要作用。同時(shí)，Ronellenfitsch等[12]也發(fā)現(xiàn)，如果新生兒出生時(shí)伴有感染性疾病，母乳中的DMBT1含量也會(huì)顯著提高，因此，DMBT1在母乳中可能與免疫球蛋白類似參與了先天性免疫防御。腸炎癥性疾病時(shí)，腸上皮細(xì)胞內(nèi)的白細(xì)胞介素27誘導(dǎo)的DMBT1表達(dá)上調(diào)。Diegelmann等[13]證實(shí)，DMBT1在抗炎、抗菌過程中有重要作用。本次實(shí)驗(yàn)中DMBT1表達(dá)明顯下調(diào)，這與國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道一致[14-15]，并與本課題組前期的基因芯片研究結(jié)果相吻合。我們認(rèn)為，DMBT1的下調(diào)可能破壞了鼻腔黏膜局部微環(huán)境的穩(wěn)定，鼻腔黏膜免疫應(yīng)答出現(xiàn)了問題，降低了黏膜的抗感染能力，最終導(dǎo)致AR的發(fā)生。

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(本文編輯楊美琴)

Isobaric tags for relative and absolute quantitation proteomic research of allergic rhinitis

ZHANGJian,ZHAOYu,LUXiao-qing,WUJian.

DepartmentofOtorhinolaryngology,ShanghaiChangzhengHospital,Shanghai200003,China

WU Jian, Email: jianwu2008@126.com

ObjectiveTo study the protein expression profiles of allergic rhinitis (AR) and to explore the pathogenic mechanisms of AR from the level of proteins. MethodsFour samples of AR mucosa and 4 samples of normal nasal mucosa were collected and the protein expression profiles of the samples were detected by means of isobaric tags for relative and absolute quantitation technique. The differentially expressed proteins were analyzed and discussed. ResultsThere were totally 220 differentially expressed proteins. Among them, 60 proteins including eosinophil lysophospholipase (CLC), pleckstrin homology domain containing family A member 7 (PLEKHA7), etc. were up-regulated and 160 proteins including detected in malignant brain tumors 1 protein (DMBT1), S100A1, etc. were down-regulated. ConclusionsThere were differences in protein expression profiles between AR and normal nasal mucosa. Differentially expressed proteins provide new cues for the study of pathogenesis of AR. Up-regulation of CLC and down-regulation of DMBT1 may be involved in inflammation, immune response of nasal mucosa. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:309-312)

Rhinitis, allergic; Proteomics; Isobaric tags for relative and absolute quantitation

上海市科委西醫(yī)引導(dǎo)重點(diǎn)科研項(xiàng)目(14411960400，14411960401)；上海市科委產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(14DZ1940103)

上海長征醫(yī)院耳鼻咽喉科上海200003

吳建(Email: jianwu2008@126.com)

張健和趙煜為共同第一作者

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.002

2015-11-11)