絲素蛋白和絲膠蛋白中氨基酸的測定

毛艷玲，王麗仙，呂婭潔，陶冬飛，謝　昆

（紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199）

絲素蛋白和絲膠蛋白中氨基酸的測定

毛艷玲，王麗仙，呂婭潔，陶冬飛，謝昆

（紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199）

以經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶（Bombyx mori L.）為研究對象，對家蠶（Bombyx mori L.）蠶繭中提取分離的絲素蛋白和絲膠蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法分別測定兩種蛋白含量，然后通過薄層層析法分離鑒定兩種蛋白中氨基酸種類。結(jié)果表明絲素蛋白和絲膠蛋白中均含有甘氨酸、丙氨酸和精氨酸。進(jìn)一步用茚三酮法測定脯氨酸含量，為分析絲素蛋白和絲膠蛋白中氨基酸組成和含量奠定基礎(chǔ)。

絲素蛋白；絲膠蛋白；氨基酸；脯氨酸

蠶桑業(yè)是我國重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一，全國有1000多個(gè)縣，2000萬戶農(nóng)民栽桑養(yǎng)蠶，蠶繭年產(chǎn)量為78.2萬噸，占世界總產(chǎn)量的78%。蠶桑業(yè)的工業(yè)產(chǎn)值達(dá)1670億，絲綢產(chǎn)品年出口額達(dá)89億美金，在農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易中位居前列［1］.云南省是蠶桑業(yè)發(fā)展第四大省，紅河州地處滇東南，是養(yǎng)蠶大州，大力發(fā)展養(yǎng)蠶業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.蠶絲蛋白是蠶繭的主要成分，主要由兩條絲素蛋白和周轉(zhuǎn)覆蓋的絲膠蛋白兩部分組成，絲素和絲膠蛋白中都含有人體所必需的八種必需氨基酸，具有保暖、保濕、防曬、美白祛斑、護(hù)發(fā)等重要功能［2-4］.因此，對絲素和絲膠蛋白的研究有助于我們進(jìn)一步了解蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)與功能.本研究以家蠶（品種為青松×皓月）為研究對象，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)含量，再用薄層層析法測定兩種蛋白中氨基酸種類，并用茚三酮染色法測定其中的脯氨酸含量，為人們進(jìn)一步了解蠶絲蛋白組成和功能奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

絲素和絲膠蛋白由生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取和純化.

1.2試劑

牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、茚三酮、脯氨酸.

1.3蛋白質(zhì)含量測定

取6支試管，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，可見分光光度計(jì)于595nm波長下測定吸光度.以吸光度為橫坐標(biāo)，以牛血清蛋白含量（μg）為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.取絲膠和絲素蛋白各1g，加入2mL蒸餾水溶解即得絲膠和絲素蛋白溶液，取2支試管，分別依次加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5mL、 0.8mL蒸餾水、0.2mL絲膠和絲素蛋白溶液，充分混合，放置2min后595nm波長測定吸光度，然后根據(jù)公式：樣品蛋白質(zhì)含量（μg /g樣品）=查得的蛋白質(zhì)含量（μg）×樣品提取液總體積（6mL）/［樣品鮮重（1g）×測定時(shí)取用提取液的體積（0.2mL）］，計(jì)算得出每克絲素和絲膠中蛋白質(zhì)含量.

1.4薄層層析

制備薄層層析板，稱取絲膠和絲素蛋白各1g，加入2mL95%乙醇溶解，將制備好的絲素、絲膠蛋白溶液、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液和綠豆芽蛋白溶液（對照）分別在薄層層析板上點(diǎn)樣，然后放入有展層劑的層析缸進(jìn)行展層，展層結(jié)束將茚三酮溶液噴灑在薄板上顯色，計(jì)算絲素和絲膠蛋白中氨基酸遷移率（原點(diǎn)到茚三酮選色點(diǎn)中央）和判斷兩種蛋白中含有哪些氨基酸.

1.5脯氨酸含量測定

取6支試管，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液，混勻后沸水水浴5min，冷卻后，在515nm波長下測定吸光度.以吸光度為橫坐標(biāo)，以脯氨酸含量（μg）為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.取絲膠和絲素蛋白各1g，冰醋酸2mL、茚三酮2mL，充分溶解混合，沸水水浴加熱10min，冷卻，在515nm波長下測定吸光度，然后根據(jù)公式：樣品中脯氨酸含量（μg /g樣品）=查得的脯氨酸含量（μg）×樣品提取液總體積（20mL）/［樣品鮮重（1g）×測定時(shí)取用提取液的體積（2mL）］，計(jì)算出絲膠和絲素中的脯氨酸含量.

2　結(jié)果與分析

2.1絲素和絲膠蛋白含量

從圖1可以看出，相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)0.9995，絲素蛋白和絲膠蛋白在595nm波長下測得的吸光度平均值分別為0.83和0.75，將它們分別帶入圖1中公式計(jì)算得出絲素和絲膠溶液中蛋白質(zhì)含量為120.96μg和109.39μg，經(jīng)計(jì)算后得出每克絲素和絲膠中蛋白質(zhì)含量分別為3620.7μg 和3281.7μg.

圖1　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2絲素和絲膠蛋白中氨基酸組分刪除

絲素和絲膠蛋白經(jīng)薄層層析后，茚三酮顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次（圖2），除脯氨酸外其余氨基酸均呈紫紅色，從圖中可以判斷，絲素蛋白和絲膠蛋白中均含有與標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸、丙氨酸和精氨酸相似的遷移率，說明兩種蛋白中含有甘氨酸、丙氨酸和精氨酸.

圖2　薄層層析法鑒定絲素和絲膠蛋白中氨基酸

2.3絲素和絲膠蛋白中脯氨酸含量的測定

從圖3可以看出，相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)0.9982，絲素蛋白和絲膠蛋白溶液在515nm波長下測得的吸光度平均值分別為0.701和0.682，將它們分別帶入圖3公式，得出絲素和絲膠蛋白溶液中脯氨酸含量為1.25μg和1.22μg，經(jīng)計(jì)算后得出每克絲素和絲膠中脯氨酸含量分別為7.01μg 和6.82μg.

圖3　脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3　討論

絲素和絲膠蛋白是蠶繭的主要成分，含有豐富的氨基酸［5-6］.本研究以蠶繭中提取的家蠶絲素和絲膠蛋白為研究對象，通過考馬斯亮藍(lán)法測定兩種蛋白含量，茚三酮法鑒定兩種蛋白中氨基酸種類及脯氨酸含量，為絲素和絲膠蛋白的氨基酸種類和含量鑒定奠定基礎(chǔ)［7］.在鑒定氨基酸種類的實(shí)驗(yàn)中，由于我們只選用了甘氨酸、丙氨酸和精氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)薄層層析實(shí)驗(yàn)鑒定的絲素和絲膠蛋白中氨基酸種類也只能根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸做出判斷，而蠶絲蛋白中是否還含有其余17種氨基酸，有待于我們進(jìn)一步鑒定.脯氨酸與生物逆境機(jī)理有關(guān) ，動植物在遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時(shí)，游離脯氨酸大量積累，并且積累指數(shù)與生物的抗逆性有關(guān)，測定脯氨酸含量可反映生物的受危害程度和對逆境的抵抗力，但在家蠶品種中，脯氨酸含量高低與家蠶抗逆境能力強(qiáng)弱的文獻(xiàn)還少有報(bào)道，本研究采用茚三酮法測定家蠶絲素蛋白和絲膠蛋白中脯氨酸含量，為分析絲素蛋白和絲膠蛋白中氨基酸組成和含量奠定基礎(chǔ).

［1］李國榮，張華峰，李建科.蠶蛋白質(zhì)資源的研究現(xiàn)狀及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（5）：396-401.

［2］陶俊逸，邵駿驊，張海萍.蠶絲蛋白制備方法的研究［J］.蠶桑通報(bào)，2012，43（3）：18-21.

［3］梁列峰，翁杰，盧娟.蠶絲蛋白的生物活性研究［J］.絲綢，2009：19-23.

［4］董雪，盛家鏞，邢鐵玲.絲膠蛋白的研究與應(yīng)用綜述［J］.絲綢，2011，48（12）：16-21.

［5］徐廣濤，林天送，周新妹.絲素蛋白的相關(guān)生物學(xué)性能研究［J］.天津醫(yī)藥，2010，38（9）：790-793.

［6］李景奎.蠶絲的分子結(jié)構(gòu)［J］.生物學(xué)通報(bào)，1998，33（12）：21.

［7］李光榮，李天駿，馮建成.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011.

［責(zé)任編輯 魯海菊］

Determination of Amino Acid From Silk Fibroin and Sericin Protein of Silkworm Cocoon

MAO Yan-ling，WANG Li-xian，LV Ya-jie，TAO Dong-fei，XIE Kun
（College of life Science and Technology，Honghe University，Mengzi，Yunnan 661100，China）

Bombyx mori L.is a kind of economic insect as the research object，silk fibroin and sericin protein are extracted from from silkworm cocoon，and contents of two proteins are detected by coomassie brilliant blue G250 dye ，then the types of amino acid are identified by thin-layer chromatography method. The result shows the two proteins consist of Glycine，alanine and arginine. On the basis of this study，the content of proline is measured by ninhydrin reaction. The research establish a basis on detecting component and content of silk fibroin and sericin protei n.

Bombyx mori L.； Sericin protein； Amino acid； Proline

Q517

A

1008-9128（2016）05-0052-02

10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.05.001

2015-10-22

紅河學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（SZ1520），紅河學(xué)院博士專項(xiàng)項(xiàng)目（XJ15B13）

毛艷玲（1995-），女，紅河學(xué)院生命學(xué)院學(xué)生。

謝昆（1975-），男，云南富民人，博士，副教授，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)。