高效液相色譜法研究懷山藥啤酒中的山藥素類成分

張彭湃，王松廷，楊生玉，朱金花，侯亞彬

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；　2.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備處，河南 開封 475004)

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高效液相色譜法研究懷山藥啤酒中的山藥素類成分

張彭湃1，王松廷1，楊生玉1，朱金花2，侯亞彬3*

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備處，河南 開封 475004)

建立一種有效的高效液相色譜方法，以期對(duì)懷山藥啤酒中的山藥素類成分進(jìn)行分析. 測(cè)定方法為：色譜柱為Cosmosil 5C18-PAQ型(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇:水(體積比60:40)，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，柱溫30 ℃. 在選定的色譜條件下，最終得到了穩(wěn)定、效果較好的懷山藥啤酒的液相色譜圖，并檢測(cè)到懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物成分，其平均回收率為87.71%.

高效液相色譜法；懷山藥啤酒；山藥素化合物

山藥在我國(guó)已經(jīng)有2000多年的食用歷史，隨著現(xiàn)代食品加工業(yè)的發(fā)展，以山藥為原料或添加山藥的食品和保健品越來(lái)越多. 例如，山藥啤酒、山藥醋、山藥酸奶等山藥發(fā)酵制品在我們的日常生活中越來(lái)越常見(jiàn)[1]. 這些山藥發(fā)酵制品能在保證食物良好口感的同時(shí)有效地利用山藥的藥理活性和保健功能，使所生產(chǎn)出的食品具有更豐富的營(yíng)養(yǎng)，更好的滋補(bǔ)健身、養(yǎng)顏美容之功效[2]. 由于這些產(chǎn)品中添加有山藥，故推測(cè)其中應(yīng)該含有某些山藥中的活性成分如山藥素類化合物，但生產(chǎn)山藥啤酒、山藥醋等產(chǎn)品需經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程，山藥中所含的山藥素類成分有可能在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了變化[3]. 因此，本文中我們以懷山藥啤酒為研究對(duì)象，探討懷山藥啤酒中山藥素化合物含量的變化.

山藥素類化合物是一種酚類化合物，高效液相色譜被認(rèn)為是研究多酚類化合物最常用的方法[4]. YOON建立了HPLC分析方法來(lái)測(cè)定山藥素Ⅰ，HPLC條件是：色譜柱：Columbus 5μC18100A(4.6 mm×300 mm,5 μm),流動(dòng)相：0.025%的乙酸溶液(A)和0.025%的乙酸乙腈溶液(B),檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,流速2 mL/min,梯度洗脫[5].

本文中選擇山藥中含量較高的山藥素Ⅰ和山藥素Ⅰ衍生物(2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲)為參考指標(biāo)，同時(shí)由于山藥素Ⅳ和山藥素Ⅰ衍生物分離時(shí)間較接近，將山藥素Ⅳ也作為參考指標(biāo). 山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物、山藥素Ⅳ結(jié)構(gòu)如圖1所示.

A：山藥素Ⅰ， B：山藥素Ⅰ衍生物， C：山藥素Ⅳ.圖1　山藥素及其衍生物的結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structural formula of batatasin and its derivatives

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小麥啤酒、懷山藥啤酒均由河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司出品，分析純)；山藥素Ⅰ(1.067 g/L)，山藥素Ⅰ衍生物(1 g/L)，山藥素Ⅳ(1 g/L)均由甲醇配制；高效液相色譜甲醇(德國(guó)默克公司，色譜純)；實(shí)驗(yàn)中所用水均為超純水.

1.2儀器設(shè)備

依利特P230Ⅱ型高效液相色譜儀，配備UV230Ⅱ型紫外檢測(cè)器，ZWⅡ溫度控制器，色譜工作站軟件型號(hào)為EC2006(大連依利特分析儀器有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Anke離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱；Phree Phospholipid Removal小柱(1.5 mL，美國(guó)菲羅門科學(xué)儀器有限公司).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1) 分別量取懷山藥啤酒、小麥啤酒各40 mL于2個(gè)燒杯中，超聲處理30 min，用隔膜真空泵過(guò)濾后分別裝于離心管中并放4℃冰箱冷藏保存.

2) 取上述樣品各150 μL于Phree Phospholipid Removal小柱中，再分別添加600 μL色譜甲醇，振蕩混勻，將小柱放于離心管中，使樣品溶液以8000 r/mim離心3 min,將離心管中的液體移至1.5 mL試劑瓶中放于4 ℃冰箱保存，即得到2個(gè)過(guò)柱的樣品.

3) 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制. 分別取山藥素Ⅰ

(1.067 g/L)、山藥素Ⅰ衍生物(1 g/L)、山藥素Ⅳ(1 g/L)儲(chǔ)備液各50 μL于1.5 mL離心管中，再加入850 μL色譜甲醇，即得到50 mg/L的3種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液；用色譜甲醇逐級(jí)稀釋該混合液2、5、10、20倍得到的25 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L的3種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液[6].

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的建立

2.1.1選擇檢測(cè)波長(zhǎng)

查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，綜合響應(yīng)值、分離度和穩(wěn)定性，選擇274 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)[7].

2.1.2流動(dòng)相選擇

選擇甲醇-水作為流動(dòng)相，考察了甲醇-水的體積比為70:30與60:40的分離情況和出峰時(shí)間，選擇后者作為流動(dòng)相.

2.1.3色譜柱選擇

測(cè)試了Hypesil C18 (3.5 mm×150 mm, 5 μm)色譜柱以及Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色譜柱對(duì)樣品的分離效果，根據(jù)樣品分離程度和峰形選擇后者.

綜上確定了最終的色譜條件：采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×250 mm，5 μm) 色譜柱，流動(dòng)相為甲醇:水(體積比60:40)，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL. 在最佳色譜條件下，對(duì)山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物和山藥素IV的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，如圖2所示.

圖2　山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物及山藥素Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)品溶液譜圖Fig.2　Standard sample chromatogram of batatasinⅠ,batatasinⅠderivative and batatasin Ⅳ

2.2樣品前處理方式比較

之所以對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)小柱處理，是因?yàn)闃悠分泻幸恍┒嗵恰⒅惖却蠓肿游镔|(zhì)，這些大分子物質(zhì)可能會(huì)掩蓋樣品中含量較少的成分，使其檢測(cè)不出. 過(guò)小柱后，樣品中的大分子被除去，懷山藥啤酒中的山藥素類成分出峰的可能性將會(huì)大大提高，出峰效果也將有可能會(huì)改善[8]. 在上述色譜條件下分別進(jìn)樣未過(guò)柱的懷山藥啤酒、小麥啤酒，結(jié)果如圖3、圖4所示.

圖3　未過(guò)柱的小麥啤酒(空白對(duì)照)Fig.3　Wheat beer of not throughing the column

圖4　未過(guò)柱的懷山藥啤酒Fig.4　Yam beer of not throughing the column

從未過(guò)柱的小麥啤酒(圖3)、懷山藥啤酒(圖4)色譜圖中可以看出，在0～5 min內(nèi)，有信號(hào)較強(qiáng)且較寬的樣品峰，除此之外幾乎檢測(cè)不到其他峰. 可能原因是由于在釀造啤酒的過(guò)程中使用了麥芽、啤酒花等原料，經(jīng)啤酒酵母發(fā)酵后產(chǎn)生了多糖、脂類等大分子物質(zhì)，所使用的色譜柱對(duì)這些大分子物質(zhì)保留能力較差，導(dǎo)致無(wú)法達(dá)到分離而被流動(dòng)相較快的淋洗出色譜柱，形成較大的寬峰，從而可能會(huì)掩蓋其他的極性較大的成分[9]. 因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理以消除干擾,分別將樣品過(guò)Phree Phospholipid Removal小柱，以除去其中的磷脂類成分及其他部分大分子[10]. 所得色譜圖如圖5、圖6所示，分別與圖3、圖4比較，過(guò)柱后的樣品在0～5 min的峰明顯變窄，且在10～15 min出現(xiàn)一個(gè)峰.

圖5　過(guò)柱小麥啤酒(空白對(duì)照)Fig.5　Wheat beer of throughing the column

圖6　過(guò)柱的懷山藥啤酒Fig.6　Yam beer of throughing the column

對(duì)比圖2標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時(shí)間，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，推測(cè)過(guò)柱的懷山藥啤酒、小麥啤酒在10～15 min所出的峰可能為山藥素Ⅰ衍生物. 本實(shí)驗(yàn)所用樣品均過(guò)小柱處理(下文不再注明).

2.3樣品中10～15 min峰的歸屬

因懷山藥啤酒的色譜流出曲線中15 min之后均沒(méi)有出峰，所以首先可以排除它們含有山藥素Ⅰ的可能性. 雖然之前推測(cè)樣品在10～15 min所出的峰是山藥素Ⅰ衍生物，但由于山藥素IV和山藥素I衍生物均在10～15 min內(nèi)出峰且出峰時(shí)間較為接近，故在相同的色譜條件下對(duì)懷山藥啤酒樣品添加山藥素Ⅳ和山藥素I衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行驗(yàn)證[11].

圖7　加標(biāo)(山藥素Ⅳ)的懷山藥啤酒Fig.7　Yam beer of adding the batatasin Ⅳ

由圖6可知，未加標(biāo)的懷山藥啤酒在10～15 min只出了一個(gè)峰，由圖7可知，加標(biāo)山藥素Ⅳ后的懷山藥啤酒在10～15 min出了兩個(gè)峰. 由于圖2和圖7色譜條件相同，而1號(hào)峰保留時(shí)間與山藥素Ⅳ的一致，且加標(biāo)后峰明顯增高，可以推知1號(hào)峰是所加標(biāo)準(zhǔn)物山藥素Ⅳ. 由于加標(biāo)山藥素Ⅳ后樣品中仍存在2號(hào)峰，那么2號(hào)峰可能是懷山藥啤酒本身所含成分所出的峰，而且2號(hào)小峰的保留時(shí)間與圖2中的山藥素Ⅰ衍生物保留時(shí)間基本一致. 需要進(jìn)一步驗(yàn)證樣品中10～15 min所出峰的歸屬[12]. 實(shí)驗(yàn)在添加山藥素IV標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，又加入了山藥素I衍生物標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8、圖9所示.

圖8　稀釋2倍的圖7溶液Fig.8　Solution of 2-fold dilution for Fig.7

圖9　用100 g/L的山藥素Ⅰ衍生物稀釋2倍的圖7溶液Fig.9　Solution of 2-fold dilution with the batatasinⅠderivative of 100 g/L for Fig.7

對(duì)于懷山藥啤酒，比較圖8和圖9，可以發(fā)現(xiàn)圖7的溶液用不同的方式稀釋2倍后，1號(hào)山藥素Ⅳ的峰高由6.6 mV分別降為2.9 mV和3.03 mV,但2號(hào)未知峰的峰高在用山藥素Ⅰ衍生物稀釋時(shí)明顯增高，故可以確定山藥啤酒中2號(hào)峰是山藥素Ⅰ衍生物，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中10～15 min所出的峰為山藥素Ⅰ衍生物，即懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物. 對(duì)比小麥啤酒，在相同實(shí)驗(yàn)條件下均檢測(cè)出山藥素Ⅰ衍生物.

2.4線性關(guān)系考察

精確配制出一系列濃度的山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物、山藥素Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次[13].

以峰面積為縱坐標(biāo)y，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得表1. 可以看出，在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，3種標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.5樣品測(cè)定

按照上述色譜條件，分別對(duì)懷山藥啤酒和小麥啤酒中的山藥素Ⅰ衍生物的含量進(jìn)行了測(cè)定，分別代入山藥素Ⅰ衍生物的回歸方程y=2.62×102x-312.86，結(jié)合過(guò)小柱稀釋倍數(shù)(5倍)，可以得到各樣品中山藥素I衍生物的含量，結(jié)果顯示，小麥啤酒和懷山藥啤酒兩種樣品中均含有山藥素Ⅰ衍生物，分別為8.33 mg/L與8.77 mg/L，二者山藥素Ⅰ衍生物的含量相差不大，作為空白對(duì)照的小麥啤酒中山藥素Ⅰ衍生物的含量略低于懷山藥啤酒[14].

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，沒(méi)有添加山藥的小麥啤酒也含有山藥素Ⅰ衍生物，由此可見(jiàn)，山藥素Ⅰ衍生物并非山藥中專屬化合物，山藥素Ⅰ衍生物的化學(xué)名稱是2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲，推測(cè)啤酒在釀造過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生山藥素Ⅰ衍生物.

表1　標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程Table 1　The regression equation of standard sample

2.6回收率實(shí)驗(yàn)

對(duì)懷山藥啤酒進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)[15]. 因?yàn)閼焉剿幤【浦械纳剿幩丌裱苌锖繛?.75 mg/L(過(guò)柱后)，分別添加相當(dāng)于懷山藥啤酒自身所含山藥素Ⅰ衍生物濃度0.5倍、1倍、2倍的山藥素Ⅰ衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)合線性方程，最終求得平均回收率為97.17%.

3　結(jié)論

在本論文所采用的色譜條件下，各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品均能得到穩(wěn)定性、峰型、分離程度等較好的色譜流出曲線，并且通過(guò)保留時(shí)間對(duì)照法和標(biāo)準(zhǔn)加入法等確定了小麥啤酒和懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物成分. 實(shí)驗(yàn)中所用的3種標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線在選定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好. 實(shí)驗(yàn)待測(cè)樣品與空白對(duì)照品的山藥素Ⅰ衍生物的含量無(wú)顯著性差異，推測(cè)可能的原因是山藥素Ⅰ衍生物(2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲)的來(lái)源并非只有山藥，在啤酒釀造過(guò)程中也可能會(huì)產(chǎn)生山藥素Ⅰ衍生物. 最后還對(duì)懷山藥啤酒中山藥素Ⅰ衍生物進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，其平均回收率為97.17%. 本方法簡(jiǎn)單、快速，且提供了食品中含有復(fù)雜樣品基質(zhì)(如含有較多蛋白質(zhì)、脂類等大分子)的前處理方法，為樣品中山藥素化合物的測(cè)定提供了一定參考.

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[責(zé)任編輯：張普玉]

Detemination on batatasins in Yam beer by HPLC

ZAHNG Pengpai1, WANG Songting1, YANG Shengyu1, ZHU Jinhua2, HOU Yabin3*

(1.CollegeofLifeScience,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 3.LaboratoryandEquipmentAdministration,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Objective: Establish a suitable method to study batatasins in Yam beer by HPLC. Methods: Batatasins in Yam beer was identified by HPLC. The chromatographic column used was Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of methanol-water(volumn ratio is 60:40), with a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃ with detection wavelength at 274 nm. Results: The method is simple, reliable and suitable for detemination on batatasins in Yam beer. Batatasin Ⅰ derivative in Yam beer was identified. The average recovery of batatasin Ⅰ derivative was 87.17%.

HPLC; Yam beer; batatasin compounds

2016-01-17.

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目資助計(jì)劃(17A530001).

張彭湃(1978-)，男，講師，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵.*

，E-mail: zdsys@henu.edu.cn.

TS262.5

A

1008-1011(2016)05-0603-06