CX43蛋白在子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)及意義

趙金燕，薛　翔，陳　慶，盧曉寧，符生魚(yú)，段　釗

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004)

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◇臨床研究◇

CX43蛋白在子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)及意義

趙金燕，薛翔，陳慶，盧曉寧，符生魚(yú)，段釗

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004)

目的探討CX43蛋白在子宮內(nèi)膜息肉(EP)中的表達(dá)及意義。方法隨機(jī)選取存檔石蠟標(biāo)本共79例，為2011年1月至2013年5月于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的EP及因其他子宮內(nèi)膜疾病診刮患者的術(shù)后病檢組織，其中病例組共44例EP組織(其中增殖期18例，分泌期15例，絕經(jīng)后11例)，對(duì)照組共35例正常子宮內(nèi)膜組織(其中增殖期12例，分泌期12例，絕經(jīng)后11例)。采用免疫組化法檢測(cè)CX43蛋白在正常子宮內(nèi)膜及EP絕經(jīng)前、后期的表達(dá)情況，并分析與臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果對(duì)照組及EP組中CX43蛋白的表達(dá)可見(jiàn)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及腺體周圍的間質(zhì)細(xì)胞中。EP組CX43蛋白陽(yáng)性率較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CX43蛋白在增殖期和分泌期EP中的陽(yáng)性率相近，在絕經(jīng)后EP中的陽(yáng)性率較絕經(jīng)前降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EP中CX43蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與高血壓及息肉數(shù)目無(wú)相關(guān)性。結(jié)論CX43蛋白在EP中的表達(dá)降低，在EP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要作用。

CX43；高血壓；子宮內(nèi)膜；免疫組織化學(xué)；子宮內(nèi)膜息肉；絕經(jīng)

子宮內(nèi)膜息肉(endometrialpolyps,EP)是婦女常見(jiàn)的婦科疾病之一。大部分EP來(lái)源于子宮內(nèi)膜基底層，典型的病理結(jié)構(gòu)為密集的纖維組織(間質(zhì))及較大且壁厚的血管和形狀、大小不規(guī)則的腺體。目前EP的確切病因尚不清楚，影響其發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素包括年齡、高血壓、肥胖及他莫昔芬等藥物的使用等[1-3]。EP的臨床癥狀包括異常子宮出血(包括絕經(jīng)后)[4-5]、少數(shù)的不孕癥[6]和極罕見(jiàn)的惡變。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)EP發(fā)病機(jī)制的研究較多，大多認(rèn)為其與子宮內(nèi)膜局部雌、孕激素受體數(shù)量異常，以及血管發(fā)生、細(xì)胞增殖/凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)和服用某些藥物密切相關(guān)。近年的研究表明，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞存在于子宮內(nèi)膜基底層，對(duì)子宮內(nèi)膜組織的生理性修復(fù)有一定的作用。而國(guó)內(nèi)外對(duì)EP的發(fā)生發(fā)展與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞相關(guān)因子異常表達(dá)的相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道較少。而CX43蛋白是細(xì)胞間隙連接蛋白家族中的一員，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及增殖、分化、凋亡等許多生理過(guò)程發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類子宮組織中CX43的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等。本研究檢測(cè)EP中CX43蛋白的表達(dá)并分析其與EP形成的高危因素之一的高血壓的關(guān)系，評(píng)價(jià)CX43蛋白在EP發(fā)生發(fā)展中的意義。

1材料與方法

1.1主要試劑兔抗人CX43多克隆抗體(克隆號(hào)：3512，CellSignaling公司)；即用型非生物素免疫組織化學(xué)超敏EliVisionTMplus(KIT-9901)檢測(cè)試劑盒(EliVisionplusPolyerHRP(Mouse/Rabbit)IHCKit)[試劑A：增強(qiáng)劑(PolymerEnhancer)，試劑B：酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG]。1.2資料來(lái)源及標(biāo)本采集選取2011年1月至2013年5月存檔石蠟標(biāo)本共79例，為在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的子宮內(nèi)膜疾病EP患者宮腔鏡(Olympus公司)手術(shù)后及因子宮內(nèi)膜疾病做診刮的患者術(shù)后子宮內(nèi)膜病檢組織，其中病例組取EP組織共44例(其中增殖期18例，分泌期15例，絕經(jīng)后11例)，對(duì)照組取正常子宮內(nèi)膜組織共35例(其中增殖期12例，分泌期12例，絕經(jīng)后11例)。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：患者手術(shù)前 3 月內(nèi)未接受過(guò)任何激素的治療；均未妊娠及哺乳；月經(jīng)周期正常，未曾行卵巢切除術(shù)；未接受非甾體抗炎藥治；無(wú)其他婦科相關(guān)疾病，如纖維瘤、子宮肌瘤、子宮腺肌癥；無(wú)嚴(yán)重心肺疾病、肝腎功能不全等合并癥及伴發(fā)其他臟器惡性腫瘤。

收集并分析患者的年齡、產(chǎn)次、高血壓及糖尿病等重要危險(xiǎn)因素等情況。

1.3免疫組化法檢測(cè)CX43的表達(dá)及結(jié)果判定采用免疫組化鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶(SP)法分析CX43蛋白在正常子宮內(nèi)膜及EP的表達(dá)情況。將蠟塊5μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，組織抗原修復(fù)，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0，)中煮沸2min，自然冷卻。用PBS(pH7.4)沖洗3次，滴加30mL/LH2O2，室溫(15～28 ℃)下孵育20min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性。蒸餾水沖洗3次，PBS沖洗3次。滴加動(dòng)物非免疫性血清，室溫下孵育20min。除去血清后滴加一抗CX43(1∶75稀釋)，4 ℃過(guò)夜。室溫平衡30min，PBS沖洗3次。滴加二抗(生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG)，37 ℃水浴30min。PBS沖洗3次。滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶溶液(試劑D)，37 ℃水浴20min。PBS沖洗3次。常規(guī)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

由2位病理科醫(yī)生采用盲法讀片，陽(yáng)性染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CX43主要以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)視野下所見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞并記錄所占百分比的平均值，陽(yáng)性結(jié)果判定方法：0分(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不到10%)；1分(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占10%到40%)；2分(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占40%到70%)；3分(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)70%)。染色強(qiáng)度記分為；0分：不著色；1分：黃色；2分：棕黃色；3分：黃褐色。每張切片的評(píng)分以這兩項(xiàng)者之積表示，<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4病理組織學(xué)觀察觀察各組子宮內(nèi)膜的病理變化，并按增生期、分泌期及絕經(jīng)后EP進(jìn)行分組，分析CX43蛋白的表達(dá)與其分期的關(guān)系。

1.5分析CX43的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系觀察息肉個(gè)數(shù)，分析CX43蛋白的表達(dá)與高血壓及息肉個(gè)數(shù)的相關(guān)性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法對(duì)資料進(jìn)行比較分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1納入病例的基本特征病例組及對(duì)照組在年齡、產(chǎn)次、高血壓及糖尿病等重要危險(xiǎn)因素的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2CX43蛋白在對(duì)照組及EP組中的表達(dá)情況顯微鏡下觀察顯示，CX43蛋白表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和腺體周圍的間質(zhì)細(xì)胞中，陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀；增生期、分泌期及絕經(jīng)后EP中CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與對(duì)照組的相應(yīng)月經(jīng)周期相比，均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EP增殖期的CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(16.67%)和分泌期的陽(yáng)性率(13.33%)相近，而絕經(jīng)后EP的CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(9.09%)較絕經(jīng)前EP陽(yáng)性率(15.15%)降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖1)。

表1子宮內(nèi)膜息肉組與正常對(duì)照組納入病例的基本特征

Tab.1ThebasiccharacteristicsofthecasesinEPgroupandcontrolgroup

臨床特征病例組(n=44)對(duì)照組(n=35)P值年齡(歲)45.50±12.01*46.00±13.33*0.384初產(chǎn)婦[n(%)]11(25.0)10(28.6)0.721經(jīng)產(chǎn)婦[n(%)]33(75.0)25(71.4)宮腔手術(shù)史[n(%)]7(15.9)15(42.9)0.008高血壓史[n(%)]6(13.6)8(22.9)0.286糖尿病史[n(%)]2(4.5)3(8.6)0.650

*表示中位數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

表2CX43蛋白在對(duì)照組及EP中的表達(dá)

Tab.2TheexpressionofCX43proteinincontrolgroupandEPgroup

分期例數(shù)CX43蛋白的表達(dá)陰性(%)陽(yáng)性(%)P值增生期 正常內(nèi)膜124(33.33)8(66.67)0.009 EP1815(83.33)3(16.67)分泌期 正常內(nèi)膜125(41.67)7(58.33)0.037 EP1513(86.67)2(13.33)絕經(jīng)期 正常內(nèi)膜114(36.36)7(63.64)0.024 EP1110(90.91)1(9.09)

圖1CX43蛋白在對(duì)照組及EP組中的表達(dá)

Fig.1TheexpressionofCX43proteininEPgroupandcontrolgroup(×400)

A和a、B和b、C和c3組圖分別表示增殖期、分泌期及絕經(jīng)后對(duì)照組與EP組中CX43蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性染色均定位在胞質(zhì)。

2.3CX43蛋白表達(dá)與高血壓及息肉數(shù)目的相關(guān)性對(duì)照組和EP組CX43的陽(yáng)性表達(dá)與高血壓無(wú)明顯相關(guān)性，與息肉的數(shù)目亦無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表3、表4)。

表3對(duì)照組及EP組CX43的表達(dá)與高血壓的關(guān)系

Tab.3RelationshipbetweenCX43expressionandhypertensionincontrolgroupandEPgroup

CX43表達(dá)高血壓陽(yáng)性陰性P值對(duì)照組陽(yáng)性4180.734對(duì)照組陰性49EP組陽(yáng)性240.130EP組陰性434

表4EP組中CX43的表達(dá)與息肉數(shù)目的關(guān)系

Tab.4RelationshipbetweenCX43expressionandthenumberofpolypsinEPgroup

CX43表達(dá)EP息肉數(shù)目(個(gè))≥321P值陽(yáng)性312陰性234110.859合計(jì)26513

3　討　　論

目前發(fā)現(xiàn)的人類間隙連接蛋白有20多種，其中CX43分布最廣、研究最多。間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)是以細(xì)胞間的間隙連接為通道進(jìn)行細(xì)胞間信息和物質(zhì)交換。CX43蛋白是GJIC基本單位之一，是進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)和物質(zhì)通訊的基礎(chǔ)。CX43蛋白的異常表達(dá)，可直接影響細(xì)胞、組織及器官的功能狀態(tài)。在正常子宮組織中，CX43表達(dá)水平的升高，為子宮肌細(xì)胞收縮的控制及子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞間的信號(hào)傳遞提供了低電阻通道，使小分子物質(zhì)很容易通過(guò)間隙連接的通道，保證了子宮肌細(xì)胞及子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞群在代謝及行為上的協(xié)調(diào)性。而其異常表達(dá)與EP、子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥、子宮肌瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種婦科疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。本研究采用免疫組化法觀察CX43在絕經(jīng)前后EP中的表達(dá)情況并分析了可能影響CX43的表達(dá)的危險(xiǎn)因素。GRANOT等[7]對(duì)子宮內(nèi)膜中CX43基因及蛋白的瞬間表達(dá)的研究顯示，CX43蛋白和基因在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)隨著月經(jīng)周期中LH、FSH及孕激素的分泌變化而變化，但CX43蛋白與基因的表達(dá)在相同時(shí)間里的表達(dá)水平并不一致；在增殖中晚期(月經(jīng)周期的第8天及12天)，CX43蛋白有較高水平的表達(dá)，尤其是在月經(jīng)周期的第8天，而在分泌中晚期(月經(jīng)周期的第21天及25天)CX43蛋白的表達(dá)下降，尤其是在第21天的表達(dá)幾乎消失。本研究中CX43蛋白在增殖期EP中的陽(yáng)性率較分泌期EP中的陽(yáng)性率較高(陽(yáng)性率分別為16.67%和13.33%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在絕經(jīng)期EP中CX43蛋白的陽(yáng)性率只有9.09%。這提示CX43在EP中的表達(dá)可能受一定激素水平的影響，而不同時(shí)期的EP疾病本身可能與其表達(dá)也有一定關(guān)聯(lián)。SCHLEMMER等[8]用免疫組化和Westernblot法分析了正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)及上皮、IA期、Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中CX43蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)水平為間質(zhì)細(xì)胞系=上皮細(xì)胞系>IA期子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系>Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，并且CX43表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的腫瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。楊靈等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CX43在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯遞減，并且其與有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的組織病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明在子宮內(nèi)膜癌形成過(guò)程中或發(fā)生早期可能由于CX43的表達(dá)受抑制，使GJIC功能失活或缺失。細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號(hào)及物質(zhì)傳遞出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失調(diào)，為子宮內(nèi)膜癌的形成提供了一條異常通路。本研究中EP組CX43 的陽(yáng)性率較正常子宮內(nèi)膜組中的陽(yáng)性率顯著降低，絕經(jīng)后EP較絕經(jīng)前EP中CX43的陽(yáng)性率亦降低，提示CX43的表達(dá)減少可能在EP的形成中發(fā)揮著一定的作用。高血壓是EP發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素之一，但本研究顯示EP的CX43表達(dá)與高血壓及息肉的數(shù)目等因素?zé)o相關(guān)性。有關(guān)CX43調(diào)控EP的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步大樣本研究。

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(編輯國(guó)榮)

TheexpressionandsignificanceofCX43inendometrialpolyps

ZHAOJin-yan,XUEXiang,CHENQing,LUXiao-ning,FUSheng-yu,DUANZhao

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,theSecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

ObjectiveToexploretheexpressionofCX43proteininendometrialpolyps(EP).MethodsWerandomlyselected79paraffinspecimensofEPdiagnosedattheDepartmentofObstetricsandGynecologyoftheSecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,fromJanuary2011toMay2013afterdilationandcurettageofendometrialtissuesbyhistopathologicalexamination.Theyincluded44casesofEPtissues(18casesinproliferationalphase, 15casesinsecretoryphase,and11casesinpostmenopausalphase)and35casesofnormalendometrialtissuesasthecontrolgroup(12casesinproliferationalphase, 12casesinsecretoryphase,and11casesinpostmenopausalphase).CX43proteinexpressionwasanalyzedinpremenopausalandpostmenopausalEPbyimmunohistochemicalstaining.ResultsThepositiveexpressionofCX43proteininbothcontrolgroupandEPtissueswasfoundinendometrialglandularepithelialcellsandstromacellssurroundingtheglands,principallyinglandularepithelialcells.ThepositiverateofCX43proteinintheEPsignificantlydecreasedcomparedwithcontrolgroupincorrespondingphase(P<0.05).ThepositiverateofCX43proteinintheproliferationalandsecretorystageswassimilar,butitdecreasedinpostmenopausalstagecomparedtopremenopausalphaseofEP,butwithoutsignificantdifference(P>0.05).ThepositiveexpressionofCX43proteininEPhadnocorrelationwithhypertensionandthenumberofpolyps.ConclusionCX43proteinexpressioninendometrialpolypsisreduced,whichmayplayanimportantroleinthedevelopmentofEP.

CX43;hypertension;endometrium;immunohistochemistry;endometrialpolyps;menopause

2016-01-25

2016-04-29

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013JM4012)

段釗.E-mail:duanzhao8@163.com

R711

A

10.7652/jdyxb201605016

SupportedbytheNaturalScienceFoundationofShaanxiProvince(No.2013JM4012)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1407.022.html(2016-08-03)