NANOG在肝細胞癌中的表達及意義

薛雨墨，姚博文，劉志奎，徐　蒙，涂康生，王軍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.肝膽外科，2.急診科，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

NANOG在肝細胞癌中的表達及意義

薛雨墨1，姚博文1，劉志奎1，徐蒙1，涂康生1，王軍2

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.肝膽外科，2.急診科，陜西西安710061)

目的探討NANOG在肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)癌組織中的表達，并通過下調(diào)肝癌MHCC-97H細胞中NANOG的水平觀察其對MHCC-97H細胞侵襲和遷移能力的影響。方法收集89例HCC組織及對應(yīng)的癌旁組織，應(yīng)用免疫組化檢測NANOG蛋白在肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達，并分析其表達與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。采用小干擾RNA(siRNA)下調(diào)肝癌MHCC-97H細胞中NANOG水平，Transwell實驗檢測MHCC-97H細胞的侵襲及遷移能力。結(jié)果NANOG在肝癌組織中表達水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織；肝癌組織中NANOG高表達與腫瘤大小、TNM分期、門靜脈侵犯及Edmondson分級顯著相關(guān)；NANOG高表達患者3年生存率明顯低于低表達組；特異性siRNA下調(diào)NANOG水平后，明顯抑制MHCC-97H細胞的侵襲和遷移。結(jié)論NANOG在肝癌組織中的表達上調(diào)并與肝癌惡性臨床病理特征有關(guān)，下調(diào)NANOG明顯抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

NANOG；肝細胞癌；侵襲；遷移

肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是癌癥原因致死的第3大腫瘤，起病隱匿，臨床表現(xiàn)不典型、轉(zhuǎn)移早、易復(fù)發(fā)，大多數(shù)患者在診斷時已為晚期，失去了手術(shù)切除的機會，預(yù)后極差[1-3]。目前，藥物靶向治療為中晚期腫瘤的治療開辟了新的思路。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，確定有效的診斷標志物或作用靶點已成為當前研究熱點[4]。NANOG是MITSUI和CHAMBERS幾乎同時報道的在囊胚內(nèi)細胞群、原始生殖細胞以及胚胎干細胞系表達的新的轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。NANOG屬ANTP類、NK家族基因，在人定位于12號染色體12p13.31，其主要作用于胚胎干細胞自我更新、維持細胞分化狀態(tài)，促進細胞增殖[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在精原細胞瘤、乳腺癌、宮頸癌、睪丸原位癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中，NANOG處于高表達狀態(tài)[9-12]。NANOG的過表達與腫瘤細胞干性、腫瘤的增殖、侵襲與遷移密切相關(guān)，通過抑制其表達或功能可抑制腫瘤的惡性表型。目前，NANOG在肝癌中的表達水平及其與肝癌的臨床病理及預(yù)后的關(guān)系研究較少。本實驗通過免疫組化檢測NANOG在肝癌中的表達水平，并分析其與患者臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系，通過siRNA技術(shù)檢測NANOG的下調(diào)對HCC細胞侵襲和遷移能力的影響。

1　材料與方法

1.1研究對象收集并篩選2011年1月至2011年12月期間在西安交通大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科手術(shù)治療后經(jīng)病理證實的肝細胞癌患者共計89例，其中男76例，女13例；年齡26～75歲，中位年齡53歲。所有入組患者均簽署知情同意書?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療等其他輔助治療?；颊咝g(shù)后平均隨訪時間為36個月。癌旁組織為距腫瘤邊緣>2cm的肝組織，所有組織為術(shù)后獲得的新鮮標本組織，組織獲得后立即轉(zhuǎn)移至液氮及40g/L多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋。

1.2細胞株及試劑人肝癌細胞株MHCC-97H細胞購自中國科學(xué)院上海生命研究所。DMEM細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；兔抗人NANOG多克隆抗體購自Bioworld公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司；脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)購自Invitrogen公司；NANOGsiRNA及對照siRNA購自上海吉瑪公司；Transwell小室購自Millipore公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Milipore公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測NANOG蛋白的表達組織標本經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作4μm切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，96 ℃微波檸檬酸鹽抗原熱修復(fù)15min，30mL/LH2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10min；100mL/L山羊血清封閉；兔抗人NANOG抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜；洗滌后，加生物素標記的山羊抗兔二抗工作液(1∶1 000)，37 ℃孵育60min；洗滌后，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(1∶500)37 ℃孵育30min，洗滌后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，逐級梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片經(jīng)2位病理醫(yī)師，在高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野，按以下標準單獨閱片、評分：染色強度評分：0分：陰性；1分：弱陽性；2分：中度陽性；3分：強陽性。陽性細胞百分比評分：陽性細胞≤5%為0分、5%<1分≤25%、25%<2分≤50%、50%<3分≤75%、4分>75%。每視野評分=染色強度評分×陽性腫瘤細胞百分比評分，取平均分作為切片終評分。

1.3.2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株MHCC-97H培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用2.5g/L胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。待細胞匯合率達70%左右按照LipofectamineTM2000說明書以100nmol/LNANOGsiRNA及陰性對照組(controlsiRNA)加入6孔板中。用無雙抗100mL/L血清的DMEM培養(yǎng)細胞48h后進行后續(xù)實驗。

1.3.3Westernblot法檢測NANOG蛋白表達利用RIPA(強)試劑盒提取轉(zhuǎn)染后MHCC-97H細胞內(nèi)總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(BCAkit)檢測蛋白樣品濃度。各組樣品均加樣40μg，SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50g/L脫脂奶粉封閉1.5h，加50g/LBSA稀釋的兔抗NANOG多克隆抗體(1∶500)及小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜；TBST(TBS，1mL/LTween-20)洗膜3次，6min/次；分別加HRP標記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2h，ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.3.4Transwell侵襲及遷移實驗取轉(zhuǎn)染48h后的MHCC-97H細胞，重懸細胞調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/mL。50mg/LMatrigel膠1∶8稀釋液包被Transwell小室(孔徑8μm)底部(侵襲實驗鋪膠、遷移實驗未鋪膠)。取各組細胞懸液200μL加入Transwell小室，24孔板下室加入500μL100mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基。每組重復(fù)3個樣本。繼續(xù)將24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，取出Transwell小室，用PBS液淋洗，棉簽擦去基質(zhì)膠及微孔膜上層細胞，40g/L多聚甲醛固定，1g/L結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下計算移至微孔膜下層的細胞數(shù)，每個樣本隨機選取8個200倍視野求細胞計數(shù)的平均數(shù)。

2　結(jié)　　果

2.1NANOG在HCC及對應(yīng)癌旁組織中的表達免疫組化檢測HCC及對應(yīng)癌旁組織中NANOG的表達，NANOG陽性染色主要定位于細胞核和細胞質(zhì)。結(jié)果顯示，NANOG在HCC組織中的陽性表達率為52.8%(47/89)，而在對應(yīng)癌旁組織中的陽性表達率為13.5(12/89)(圖1A、1B)；經(jīng)免疫組化評分，NANOG在肝癌中的表達明顯高于癌旁組織中的表達(P<0.05，圖1C)。

圖1NANOG在肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達

Fig.1TheexpressionofNANOGinHCCandmatchedadjacentpara-carcinomatissues(×400)

A：肝癌組織；B：癌旁組織；C：NANOG免疫組化評分。與癌旁組織比較，*P<0.05。

2.2NANOG表達與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系對89例HCC病例的臨床病理資料分析，以免疫組化結(jié)果分為NANOG陽性組(n=47)與NANOG陰性組(n=42)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NANOG高表達與腫瘤大小(>5cm)、TNM分期(Ⅲ期和Ⅳ期)、門靜脈侵犯及Edmondson分級相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1NANOG的表達與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1RelationbetweenNANOGandclinicopathologicfeaturesof89HCCpatients(n=89)

項目類別NANOG陽性組(n=47)陰性組(n=42)P性別男39370.495女85年齡<50歲19180.816≥50歲2824腫瘤直徑<5cm33380.018*≥5cm144腫瘤數(shù)目1個40370.680≥2個75TNM分期Ⅰ+Ⅱ27350.008*Ⅲ+Ⅳ207門靜脈侵犯無37400.023*有102AFP<400ng/mL31290.756≥400ng/mL1613HBV感染無630.599有4139EdmondsonⅠ+Ⅱ29350.023*Ⅲ+Ⅳ187

*P<0.05。

2.3NANOG的表達與患者生存率的關(guān)系結(jié)果顯示，陽性表達NANOG的患者3年生存率明顯低于陰性表達患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2Kaplan-Meier法分析NANOG表達水平與肝癌患者生存率的關(guān)系

Fig.2Kaplan-MeieroverallsurvivalratecurvesforHCCpatientsaccordingtothelevelofNANOGexpression

2.4MHCC-97H細胞中干擾NANOG表達人肝癌MHCC-97H細胞轉(zhuǎn)染NANOGsiRNA或ControlsiRNA，Westernblot法檢測發(fā)現(xiàn)NANOG蛋白表達顯著降低(P<0.05，圖3)。

2.5下調(diào)NANOG表達抑制MHCC-97H肝癌細胞的侵襲鋪膠的Transwell侵襲實驗顯示，siRNA下調(diào)NANOG表達可明顯抑制MHCC-97H細胞的侵襲能力(P<0.05，圖4)。

2.6下調(diào)NANOG表達抑制MHCC-97H肝癌細胞的遷移為進一步研究NANOG對肝癌細胞遷移能力的影響，未鋪膠的Transwell實驗顯示，下調(diào)NANOG表達能明顯抑制MHCC-97H細胞的遷移能力(P<0.05，圖5)。

圖3NANOG靶向沉默對MHCC-97H細胞NANOG表達的抑制作用

Fig.3TheinhibitoryeffectofsiRNAtargetingforNANOGontheexpressionofNANOGinMHCC-97Hcell

A：Westernblot檢測siRNA靶向沉默MHCC-97H細胞中NANOG的表達；B：半定量分析3次重復(fù)實驗中siRNA沉默NANOG的表達。與對照組比較，*P<0.05。

3　討　　論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其早期浸潤生長并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移致使大部分患者就診時已失去根治性手術(shù)機會，嚴重影響患者預(yù)后[13]。因此，尋找新的有效的HCC分子標志物及治療靶點，已成為提高我國HCC診斷和治療水平的重要途徑。

系列研究表明，NANOG作為胚胎干細胞的特異性基因，主要表達于胚胎和生殖細胞腫瘤中，但隨著腫瘤干細胞研究的進展，在非生殖系統(tǒng)腫瘤中也發(fā)現(xiàn)NANOG的異常表達，且NANOG是干細胞維持其全能性和自我增殖的重要調(diào)控因子[14]。NANOG可通過與CDK6相互作用影響星形膠質(zhì)細胞的增殖[15]；NANOG在胰腺癌中異常高表達，且可作為預(yù)測患者預(yù)后的指標；NANOG在胃癌中可促進胃癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并且與化療抵抗密切相關(guān)；在卵巢癌中，NANOG可以與CD34及透明質(zhì)酸結(jié)合形成復(fù)合物，啟動NANOG下游的干細胞基因，如Sox2、Rex1等的表達，并且與STAT3之間形成通路激活其下游的耐藥基因如MDR1表達，共同促進腫瘤細胞

圖4下調(diào)NANOG抑制MHCC-97H細胞侵襲

Fig.4DownregulationofNANOGinhibitedtheinvasionofMHCC-97H

A：ControlsiRNA組；B：NANOGsiRNA組；C：Transwell實驗各組穿膜細胞數(shù)分析。與對照組比較，*P<0.05。

圖5下調(diào)NANOG抑制MHCC-97H細胞遷移

Fig.5DownregulationofNANOGinhibitedthemigrationofMHCC-97H

A：ControlsiRNA組；B：NANOGsiRNA組；C：Transwell實驗各組穿膜細胞數(shù)分析，與對照組比較，*P<0.05。

的增殖和多重耐藥[16]。而本研究通過對89例HCC組織標本檢測發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中NANOG的表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織，并且NANOG在肝癌中的表達多位于細胞核，且NANOG的過表達與腫瘤大小(≥5cm)、高TNM分期、門靜脈侵犯及高Edmondson分級等HCC惡性臨床病理特征密切相關(guān)。通過隨訪，發(fā)現(xiàn)高表達NANOG患者的3年生存率明顯低于低表達，提示NANOG的高表達預(yù)示患者預(yù)后不良。這與LIU等研究結(jié)果基本一致。而進一步通過小RNA干擾技術(shù)沉默MHCC-97H細胞中NANOG表達，結(jié)果證實NANOG表達降低后，肝癌MHCC-97H細胞的侵襲和遷移能力明顯下調(diào)。這提示NANOG在肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，NANOG可以與Smad1相互作用并干擾輔激活蛋白的募集，妨礙Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活，從而阻止細胞分化。NANOG可通過作用于AURK及LGL-2的表達影響NUMB的磷酸化，從而影響p53的降解。但NANOG在肝癌中的作用機制仍需進一步探明。

綜上所述，NANOG在HCC組織中表達顯著升高，并與HCC的惡性臨床病理特征密切相關(guān)，且高表達NANOG預(yù)示患者預(yù)后不良。在體外下調(diào)NANOG的表達有抑制肝癌細胞侵襲及遷移的作用。因此，NANOG可能成為新的HCC分子標志物及生物治療靶點。

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(編輯卓選鵬)

ExpressionandclinicalsignificanceofNANOGinhepatocellularcarcinoma

XUEYu-mo1,YAOBo-wen1,LIUZhi-kui1,XUMeng1,TUKang-sheng1,WANGJun2

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery; 2.DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveTodetecttheexpressionofNANOGintumortissueofhumanhepatocellularcarcinomaanddeterminetheeffectofNANOGoncellinvasionandmigrationinMHCC-97HcellsbyknockdownofNANOG.MethodsWecollected85pairsofHCCandpara-carcinomatissuesanddetectedtheexpressionofNANOGbyimmunohistochemicalstaining.ClinicopathologicalandprognosticsignificanceofNANOGwasevaluatedinthesepatients.TheexpressionofNANOGwasknockeddownbysiRNAinMHCC-97Hcells.TranswellassayswereperformedtotestHCCcellinvasionandmigrationin vitro.ResultsTheexpressionofNANOGinHCCtissueswassignificantlyhigherthanthatinpairedpara-carcinomatissues,anditwassignificantlyassociatedwithtumorsize,TNMstage,portalveininfiltrationandEdmondsondegree.PatientsinthehigherNANOGgrouphadapoorer3-yearsurvivalthanthoseinthelowergroup.WhentheexpressionofNANOGwasdownregulatedbyaspecificsiRNA,NANOGknockdownobviouslyinhibitedcellinvasionandmigrationinMHCC-97Hcells.ConclusionNANOGisoverexpressedinHCCtissueandiscorrelatedwiththemalignantclinicopathologicfeatures.NANOGknockdowninhibitscellinvasionandmigrationofHCCcells.

NANOG;hepatocellularcarcinoma;invasion;migration

2016-01-12

2016-04-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81402039)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃(No.2013JM4049)

王軍.E-mail: 1017449024@qq.com

R735.7

A

10.7652/jdyxb201605014

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81402039)andtheNaturalScienceFoundationResearchProjectofShaanxiProvince(No.2013JM4049)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1402.018.html(2016-08-03)