miR146通過靶向Notch 1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化

岳宗進(jìn)，劉汝銀，于　露，馮仲鍇，王新立

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南鄭州　450002)

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◇基礎(chǔ)研究◇

miR146通過靶向Notch1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化

岳宗進(jìn)，劉汝銀，于露，馮仲鍇，王新立

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南鄭州450002)

目的探討miR146在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向髓核樣細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制。方法從SD大鼠中分離培養(yǎng)BMSC，傳至第3代用于本實(shí)驗(yàn)。以TGFβ1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化為模型。檢測TGFβ1誘導(dǎo)BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型膠原蛋白(COLⅡ)和SOX9的蛋白及mRNA表達(dá)水平；RT-PCR檢測miR146的表達(dá)水平。隨后通過上調(diào)或下調(diào)miR146水平，檢測ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白及mRNA表達(dá)水平；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR146的靶基因，并上調(diào)或下調(diào)miR146水平后檢測靶基因的蛋白表達(dá)水平；過表達(dá)靶基因并檢測其與miR146mimic共轉(zhuǎn)染對ACAN、COLⅡ和SOX9表達(dá)的影響。最后，上調(diào)或下調(diào)靶基因后，檢測miR146表達(dá)水平的變化。結(jié)果TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX9和miR146高表達(dá)。上調(diào)miR146后，ACAN、COLⅡ和SOX9的表達(dá)升高；下調(diào)miR146后ACAN、COLⅡ和SOX9的表達(dá)降低。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)，Notch 1是miR146的靶基因，miR146通過抑制Notch 1的表達(dá)上調(diào)ACAN、COLⅡ和SOX9的表達(dá)水平。上調(diào)Notch 1后miR146表達(dá)下調(diào)，下調(diào)Notch 1后miR146表達(dá)上調(diào)。結(jié)論miR146通過靶向Notch 1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化，Notch 1對miR146亦具有負(fù)向調(diào)控作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；髓核樣細(xì)胞；miR146；Notch 1

椎間盤退變(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是中老年人的常見病及多發(fā)病，其病因主要是因?yàn)槔w維環(huán)和髓核的含水量、蛋白多糖和膠原等逐漸減少、彈性和韌性降低、張力下降、椎間隙變窄等[1]。常見的治療方法是手術(shù)治療和非手術(shù)治療，然而都不能從根本上修復(fù)椎間盤退變的病理狀態(tài)[2]。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)注入到山羊髓核中，發(fā)現(xiàn)BMSC可以阻止椎間盤退化[3]，其可能的機(jī)制是BMSC分化成為髓核樣細(xì)胞而增加了髓核細(xì)胞的數(shù)量[4]。研究顯示，BMSC用于治療IDD具有很大的臨床應(yīng)用潛力[5]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TGFβ1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)誘導(dǎo)的BMSC向髓核樣細(xì)胞分化過程中miR146高表達(dá)。本研究旨在探討miR146在BMSC向髓核樣細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級1月齡SD大鼠15只，雄性，體質(zhì)量88～100g，由鄭州大學(xué)提供。大鼠飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照河南省中醫(yī)院動物倫理學(xué)委員會要求。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)，Trizol裂解液(賽默飛世爾科技有限公司)，PrimeScriptTMRTReagentKit(TaKaRa)，雙熒光素酶檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù))，TGFβ1(Amresco)，兔抗大鼠Ⅱ型膠原多克隆抗體，兔抗大鼠蛋白多糖多克隆抗體，SOX9兔抗大鼠多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，β-actin兔抗大鼠單克隆抗體。所有的抗體均購于Abcam公司。

1.3方法

1.3.1BMSC的分離培養(yǎng)將1月齡SD大鼠用35mL/L水醛進(jìn)行腹腔麻醉。在無菌條件下，分離出大鼠雙下肢脛、股骨，剪斷兩端暴露髓腔。用5mL注射器吸取含100mL/LFBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗3次收集沖洗液。輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液。1 000r/min離心20min，去上清。用含100mL/LFBS的低糖DMEM重懸，按細(xì)胞密度1×106/cm2接種于培養(yǎng)皿中，350mL/LCO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)到90%以上，用胰酶消化傳代，培養(yǎng)至第3代便可進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.3.2TGFβ1處理BMSC將第3代BMSC以1×104/cm2的密度接種于12孔板的2孔中，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，加入10μg/LTGFβ1誘導(dǎo)14d[6]，對照組正常培養(yǎng)14d，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞分為4組(n=6)：miR146mimic、miR146inhibitor、miR146mimicNC(陰性對照)和miR146inhibitorNC(陰性對照)。采用LipofectamineTM2000將每組轉(zhuǎn)染入TGFβ1誘導(dǎo)的BMSC細(xì)胞或轉(zhuǎn)染入BMSC細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4Westernblotting采用RIPAlysisbuffer將BMSC裂解，離心后吸出上清液體，采用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。將蛋白樣品進(jìn)行100g/LSDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，牛奶封閉1h。加一抗4 ℃孵育過夜，后經(jīng)TBST沖洗3次，每次10min。加二抗室溫孵育1h，經(jīng)TBST沖洗3次，每次10min。后經(jīng)在暗室中曝光。以β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果采用軟件imageJ計(jì)算統(tǒng)計(jì)。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測將BMSC按照1×105/cm2接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%，采用LipofectamineTM2000將擴(kuò)增的Notch 1-3′UTR-WT和Notch 1-3′UTR-MUT分別轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒psicheck-2中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒psicheck-2-Notch 1-3′UTR-WT和psicheck-2-Notch 1-3′UTR-MUT。分別與miR146共轉(zhuǎn)入BMSC中形成miR146+Notch 1-3′UTR-WT組與miR146+Notch 1-3′UTR-MUT組。結(jié)果采用發(fā)光化學(xué)儀檢測螢火蟲和海腎熒光比值。

1.3.6Notch 1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)GenBank中Notch 1基因序列，采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物，并交由上海生工(生工生物工程股份有限公司，中國)合成(F：5′-AGTCGCTAGCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCA-3′；R：5′-GTACCGGTGGCTTAAATGCCTCTGGAATGTGGGTG-3′)。將測序正確的Notch 1基因克隆到pEGFP-N1載體中，構(gòu)建pEGFP-N1-Notch 1表達(dá)載體。采用LipofectamineTM2000將pEGFP-N1-Notch 1轉(zhuǎn)入BMSC；以空載pEGFP-N1作為對照。

1.3.7si-RNA介導(dǎo)的Notch 1基因沉默根據(jù)GenBank中Notch 1基因序列，應(yīng)用網(wǎng)站siDESIEN設(shè)計(jì)3對siRNA，BLAST對比序列同源性。靶向Notch 1基因的siRNA序列由上海生工合成，其序列如下：F：5′-GCAACCUGCAGUGUAAUAATT-3′；R：5′-UUAUUACACUGCAGGUUGCTT-3′。無關(guān)序列(scramble)：F：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；R：5′-ACGUGACACGUUCGGAG-

AATT-3′。利用LipofectamineTM2000分別將siRNA-Notch 1和scramble轉(zhuǎn)染到BMSC中。

1.3.8實(shí)時(shí)定量RT-PCRTrizol法提取BMSC中總RNA。采用PrimeScriptTMRTReagentKit(TaKaRa，日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR過程。實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物由上海生工合成，序列如下：Notch 1F：5′-AGCAGGTGCCATAGTCCAC-3′；R：5′-GGTTGATGCTGACGAGATGAG-3′；SOX9：F5′-GACTTCCGCGACGTGGAC-3′；R5′-CAGTA-CCTGCCGCCCAAC-3′；COLⅡ：F5′-GGCAATAGCAGGTTCACGTACA-3′；R5′-CGATAACAGTC-TTGCCCCACTT-3′；ACAN：F5′-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3′；5′-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-3′；β-actinF：5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′；R：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同基因的mRNA表達(dá)情況。miR146逆轉(zhuǎn)錄引物(5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAACCCA-3′)和實(shí)時(shí)定量PCR引物(F：5′-CGGCGGTGAGAACTGAATTCCA-3′；R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)均由生工合成。實(shí)時(shí)定量采用miRNA熒光定量PCR試劑盒(生工生物工程股份有限公司)。2-△△Ct方法分析mRNA相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)　　果

2.1miR146在TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化中高表達(dá)研究顯示，髓核細(xì)胞具有ACAN、COLⅡ的表性特征，且SOX9基因被認(rèn)為能促進(jìn)ACAN和COLⅡ合成。因此，ACAN、COLⅡ和SOX9在BMSC向髓核樣細(xì)胞分化中被認(rèn)為是髓核樣細(xì)胞的標(biāo)志[7]。在本研究中，BMSC細(xì)胞經(jīng)TGFβ1誘導(dǎo)后，ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白表達(dá)量增加，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A、1B，P=0.042)。RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TGFβ1誘導(dǎo)后，BMSC中ACAN、COLⅡ和SOX9的mRNA表達(dá)升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C，P=0.028)。另外，TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化過程中，miR146表達(dá)水平升高，與對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D，P=0.039)。

圖1miR146在TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化中高表達(dá)

Fig.1HighexpressionofmiR146intheprocessofthedifferentiationofBMSCsintopulposus-likecellsinducedbyTGFβ1

A：Westernblotting檢測TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化后ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白表達(dá)；B：圖A的量化圖；C：RT-PCR檢測TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化后ACAN、COLⅡ和SOX9的mRNA表達(dá)；D：RT-PCR檢測TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化后miR146的表達(dá)水平。Control組：細(xì)胞不做處理；TGFβ1組：細(xì)胞中加入10μg/LTGFβ1。與對照組比較，*P<0.05(n=6)。

2.2miR146促進(jìn)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化以向BMSC中加入TGFβ1作為對照。轉(zhuǎn)染miR146mimic后，ACAN、COLⅡ和SOX9的表達(dá)水平升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。相反，轉(zhuǎn)染miR146inhibitor后，ACAN、COLⅡ和SOX9表達(dá)水平下降，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A、2B，P=0.044)。

2.3Notch 1是miR146的靶基因Targetscan軟件預(yù)測及文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，Notch 1的3′UTR區(qū)250～268bp是miR146的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示(圖3B)，與Emptyvector組比較，miR146與野生型Notch 1-3′UTR共轉(zhuǎn)染后，檢測到雙熒光素酶活性的下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。miR146與突變型Notch 1-3′UTR共轉(zhuǎn)染后，檢測到雙熒光素酶活性與Emptyvector組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明miR146與Notch 1-3′UTR結(jié)合抑制Notch 1基因表達(dá)。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR146對Notch 1基因表達(dá)的影響，分別轉(zhuǎn)染miR146mimic和inhibitor至BMSC中，Westernblotting檢測Notch 1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimicNC和inhibitorNC的Notch 1蛋白表達(dá)水平與未處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染miR146mimic后，Notch 1表達(dá)水平低于未處理組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)；轉(zhuǎn)染miR146inhibitor后，Notch 1表達(dá)水平高于未處理組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C，P=0.046)。

圖2miR146促進(jìn)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化

Fig.2miR146promotedthedifferentiationofBMSCintonucleuspulposus-likecells

A：Westernblotting檢測miR146mimic或inhibitor及其對應(yīng)NC轉(zhuǎn)染TGFβ1誘導(dǎo)的BMSC后ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白表達(dá)水平；B：RT-PCR檢測miR146mimic或inhibitor及其對應(yīng)NC轉(zhuǎn)染TGFβ1誘導(dǎo)的BMSC后ACAN、COLⅡ和SOX9的mRNA表達(dá)水平。與對照組比較，*P<0.05(n=6)。

圖3Notch 1是miR146的靶基因

Fig.3ThetargetgeneofmiR146wasNotch 1

A：miR146與Notch1的3′UTR區(qū)野生型和突變型位點(diǎn)的序列對比圖；B：雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示Notch 1是miR146的靶基因(與Emptyvector組比較，*P<0.05)；C：miR146mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染對Notch1蛋白表達(dá)水平的影響(與對照組比較，*P<0.05，n=6)。

2.4miR146通過靶向Notch 1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞的分化Si-RNA介導(dǎo)Notch 1基因沉默后，Notch 1蛋白表達(dá)水平的下調(diào)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A，P=0.031)；過表達(dá)Notch 1后，Notch 1蛋白表達(dá)水平的上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A，P=0.012)。圖4B和C顯示，轉(zhuǎn)染miR146mimic后，ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白表達(dá)水平與對照組相比升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。轉(zhuǎn)染Notch 1過表達(dá)載體后，ACAN、COLⅡ和SOX9的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)。當(dāng)miR146mimic與Notch 1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)細(xì)胞后，ACAN、COLⅡ、SOX9的蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低于miR146mimic單獨(dú)轉(zhuǎn)染組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B、4C，P=0.025)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，ACAN、COLⅡ、SOX9的mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平變化趨勢一致(圖4D)。

圖4miR146通過靶向Notch 1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化

Fig.4miR146promotedthedifferentiationofBMSCintonucleuspulposus-likecellsbytargetingNotch 1

A：Westernblotting驗(yàn)證Notch 1的沉默與過表達(dá)載體構(gòu)建成功；B：Notch 1過表達(dá)減少了miR146mimic轉(zhuǎn)染對ACAN、COLⅡ、SOX9的蛋白表達(dá)的影響；C：圖B的量化圖；D：Notch 1過表達(dá)減少了miR146mimic轉(zhuǎn)染對ACAN、COLⅡ、SOX9的mRNA表達(dá)的影響。與對照組比較，*P<0.05；與Mimic組比較，#P<0.05(n=6)。

2.5Notch 1負(fù)向調(diào)控miR146的表達(dá)與對照組相比，Scramble組和Emptyvector組miR146的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。si-RNA介導(dǎo)Notch 1沉默后，miR146的表達(dá)水平與對照組比較上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)；相反，過表達(dá)Notch 1后，與對照組相比，miR146的表達(dá)水平的下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5，P=0.042)。

圖5Notch 1負(fù)向調(diào)控miR146的表達(dá)

Fig.5 Notch 1negativelyregulatedtheexpressionofmiR146

與對照組比較，*P<0.05(n=6)。

3　討　　論

IDD是骨科常見病，也是腰痛產(chǎn)生的源頭。髓核組織失水纖維化、蛋白多糖和膠原逐漸減少是IDD的主要原因[1]。目前認(rèn)為髓核細(xì)胞移植為椎間盤治療提供了前景[8]。然而，研究顯示髓核細(xì)胞生長緩慢[9]，不好培養(yǎng)。BMSC因其可多向分化、增殖能力強(qiáng)及可在一定條件下(如TGFβ1)被誘導(dǎo)成為髓核樣細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)[10]。

有研究顯示在斑馬魚的胚胎發(fā)育中，miR146特異性的表達(dá)在軟骨細(xì)胞中[11]。因髓核細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的表性特征(ACAN、COLⅡ)[8]，又被稱為類軟骨細(xì)胞。SOX9基因被認(rèn)為能促進(jìn)ACAN和COLⅡ合成，延緩IDD發(fā)展[12]。在本研究中，TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化過程中，miR146的表達(dá)量升高。我們推測miR146的表達(dá)可能與ACAN、COLⅡ和SOX9的增加相關(guān)。因此，在TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化過程中，我們檢測了上調(diào)或下調(diào)miR146對ACAN、COLⅡ和SOX9表達(dá)水平的影響。結(jié)果證實(shí)，在TGFβ1誘導(dǎo)的BMSC中轉(zhuǎn)染miR146增加了ACAN、COLⅡ和SOX9的表達(dá)水平。與本研究相似，在軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR146a抑制了IL-1介導(dǎo)的ACAN和COLⅡ表達(dá)的減少[13]。并且有研究顯示，髓核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR146a可以減少IL-1誘導(dǎo)的椎間盤退變和炎癥的形成，當(dāng)在患有椎間盤小鼠體內(nèi)敲除miR146a后，IL-1誘導(dǎo)的蛋白多糖的退化加劇[14]。因此，miR146促進(jìn)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化。

我們進(jìn)一步檢測了miR146的靶基因，發(fā)現(xiàn)Notch 1是miR146的靶基因，并且miR146抑制Notch 1的表達(dá)。MORIGELE等[15]發(fā)現(xiàn)Notch 1沉默促進(jìn)了BMSC向髓核樣細(xì)胞分化。并且Notch 1的過表達(dá)顯著地抑制了miR146mimic轉(zhuǎn)染引起的ACAN、COLⅡ和SOX9表達(dá)的增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，miR146通過靶向Notch 1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化。

另外，本研究觀察到Notch 1的過表達(dá)抑制miR146的表達(dá)，而si-RNA介導(dǎo)Notch 1沉默促進(jìn)了miR146的表達(dá)。說明Notch 1負(fù)向調(diào)控miR146的表達(dá)。但Notch 1通過何種機(jī)制調(diào)控miR146的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR146與Notch 1形成反饋環(huán)路促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化。

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(編輯卓選鵬)

miR146promotesthedifferentiationofbonemesenchymalstemcellsintonucleuspulposus-likecellsbytargetingNotch1

YUEZong-jin,LIURu-yin,YULu,FENGZhong-kai,WANGXin-li

(DepartmentofSpine,theSecondAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

ObjectiveToexploretheeffectofmiR146onthedifferentiationofbonemesenchymalstemcells(BMSCs)intonucleuspulposus-likecellsandtheunderlyingmechanism.MethodsTheBMSCswereisolatedfromSDmice.The3passagesofBMSCswereusedinthepresentstudy.ThedifferentiationofBMSCsintopulposus-likecellswasinducedbyTGFβ1.TheproteinandmRNAexpressionlevelsofaggrecan(ACAN),typeⅡcollagen(COLⅡ)andSOX9weredetectedinTGFβ1-inducedBMSCs.TheexpressionlevelofmiR146wasdeterminedbyRT-PCR.Byup-regulatingordown-regulatingtheexpressionlevelsofmiR146inTGFβ1-inducedBMSCs,wefurtherdetectedtheproteinandmRNAexpressionlevelsofACAN,COLⅡandSOX9.ThetargetgeneofmiR146wasverifiedbydual-luciferasereporterassaysystem.ThemiR146wasup-regulatedordown-regulatedinBMSCsandtheproteinexpressionlevelsoftargetgeneweredetected.ThetargetgenewasoverexpressedandtheexpressionlevelsofACAN,COLⅡandSOX9weredetectedinBMSCstransfectedbytargetgeneandmiR146mimic.Atlast,theexpressionlevelofmiR146wasdetectedbysilencingoroverexpressingthetargetgene.ResultsTheexpressionlevelsofACAN,COLⅡ,SOX9andmiR146wereincreasedduringthedifferentiationofBMSCsintopulposus-likecellsinducedbyTGFβ1.AftermiR146up-regulation,theexpressionlevelsofACAN,COLⅡandSOX9wereelevated.AftermiR146down-regulation,theexpressionlevelsofACAN,COLⅡandSOX9werereduced.Dual-luciferasereporterassaysystemshowedthatthetargetgeneofmiR146wasNotch 1.miR146enhancedtheexpressionlevelsofACAN,COLⅡandSOX9throughinhibitingtheexpressionofNotch 1.Afterup-regulatingNotch 1,theexpressionofmiR146wasreduced.Afterdown-regulatingNotch 1,theexpressionofmiR146wasincreased.ConclusionmiR146promotesthedifferentiationofBMSCsintonucleuspulposus-likecellsbytargetingNotch 1. Notch 1,whichnegativelyregulatestheexpressionofmiR146.

bonemesenchymalstemcell;nucleuspulposus-likecell;miR146; Notch 1

2016-02-23

2016-05-03

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.102102310277)

劉汝銀.E-mail:qujining@yeah.net

R274.34

A

10.7652/jdyxb201605010

SupportedbyScienceandTechnologyProjectsofHenanProvince(No.102102310277)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1139.012.html(2016-08-03)