抑制CXCR4基因調(diào)控Wnt/β-catenin通路在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用

王　佳，王澤華

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710061；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢　430022)

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◇基礎(chǔ)研究◇

抑制CXCR4基因調(diào)控Wnt/β-catenin通路在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用

王佳1，王澤華2

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710061；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢430022)

目的研究趨化因子受體4(chemokinereceptor4,CXCR4)在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。方法采用Real-timePCR和Westernblot法檢測正常卵巢組織、卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞株(CAOV3)CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)以及CXCR4shRNA轉(zhuǎn)染后卵巢癌CAOV3中CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)；MTT法檢測CXCR4shRNA對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響；通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CXCR4基因沉默對卵巢癌細(xì)胞侵襲性的作用；Real-timePCR法檢測CXCR4shRNA轉(zhuǎn)染后Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因和EMT相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果CXCR4在卵巢癌組織和CAOV3細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織；轉(zhuǎn)染CXCR4shRNA可有效抑制CAOV3細(xì)胞中CXCR4mRNA和蛋白表達(dá)；CXCR4基因沉默可有效抑制細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞侵襲性；同時(shí)明顯抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因CTNNBI、C-MYC、MMP-9和CD44以及EMT相關(guān)基因SLUG和Vimentin的mRNA表達(dá)。結(jié)論CXCR4通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響卵巢癌的轉(zhuǎn)移。

卵巢癌；趨化因子受體(CXCR4)；Wnt/β-catenin；RNA干擾

卵巢癌在婦科腫瘤中死亡率位居第一，由于起病隱襲，大部分卵巢癌病人確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，全世界發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者5年生存率不足30%[1]。細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素過程，其中趨化因子及其受體在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)50多個(gè)趨化因子及20多個(gè)趨化因子受體[2]，其中只有趨化因子受體4(chemokinereceptor4,CXCR4)在卵巢癌細(xì)胞上表達(dá)。有研究表明CXCR4的表達(dá)與卵巢癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，但其機(jī)制尚不明確。Wnt/β-catenin通路在細(xì)胞增殖、遷移等方面起重要作用[3]，該通路主要組份β-catenin在異常情況下胞質(zhì)大量蓄積并入核與核內(nèi)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(TCF)結(jié)合，增加下游靶基因的轉(zhuǎn)錄合成。異常的β-catenin能夠激活上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)過程，影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]。在胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR4通過調(diào)控Wnt/β-catenin影響多器官發(fā)育。本研究探討CXCR4是否通過Wnt/β-catenin通路影響卵巢癌的轉(zhuǎn)移。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑人卵巢癌細(xì)胞株CAOV3來自ATCC。主要試劑包括CXCR4鼠抗人單克隆抗體(Abcam公司)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和SYBRGreenReal-timePCR反應(yīng)液(Toyobo公司)，鼠抗人CXCR4單克隆抗體(Abcam公司)，鼠抗人β-actin多克隆抗體(武漢博士德公司)，HRP標(biāo)記二抗(SantaCruz公司)，引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株CAOV3常規(guī)培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，50mL/LCO2飽和濕度，待細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，2.5g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3CXCR4shRNA的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體由上海吉瑪生物有限公司合成，針對CXCR4的shRNA(shCXCR4)序列為：5′-CACCGGATCAGCATCGACTCCTTCATTCAAGAGATGAAGGA-

GTCGATGCTGATCCTTTTTTG-3′；陰性對照(shNC)的序列為：5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCG-

GAGAATTTTTTG-3′。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1d用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種細(xì)胞于24孔板，1×105/孔。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換為500μL無血清培養(yǎng)基。分別于50μL無血清培養(yǎng)基中加入0.8μgshRNA和2μLLipofectamineTM2000，室溫放置5min后混合，室溫放置20min。將上述混合物加入24孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)6h后，將培養(yǎng)基換為500μL含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h或72h。

1.4Real-timePCR檢測mRNA表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5min；94 ℃ 15s，60 ℃ 45s，72 ℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法[5]計(jì)算基因相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Westernblot檢測CXCR4蛋白表達(dá)裂解提取細(xì)胞總蛋白，按BCA法進(jìn)行蛋白定量。將細(xì)胞總蛋白煮沸5min使蛋白變性，SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，將膜置于50g/L脫脂奶粉中室溫封閉1h，然后加入鼠抗人CXCR4單克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1h，TBST洗膜后，以ECL顯色，X線膠片暴光，洗片，用凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，1×104/孔，培養(yǎng)24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染1、2、3、4、5d后加入5g/L的MTT溶液，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL/孔，震蕩10min后用酶標(biāo)儀在490nm波長測定A值，繪制生長曲線。

1.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲性Transwell小室中加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel，37 ℃靜置4～6h，待膠凝固，將各組細(xì)胞消化，用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105/mL，于上室加入細(xì)胞懸液400μL，Transwell小室的下室加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基做趨化液，培養(yǎng)16～24h后，取出小室，用棉簽小心擦除濾膜上室面的細(xì)胞，以無水乙醇固定粘附在下室面的細(xì)胞，HE染色。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目，取平均值作為該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組以上數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間差異分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1CXCR4在卵巢癌的表達(dá)采用Real-timePCR法檢測7個(gè)正常卵巢組織、49個(gè)卵巢癌組織以及卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV3和CAOV3中CXCR4mRNA的表達(dá)。采用非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CXCR4mRNA在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織(P<0.001)，在研究的3種細(xì)胞株中，CAOV3中CXCR4mRNA表達(dá)最高(圖1A)。Westernblot結(jié)果也同樣證明CAOV3細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)最高(圖1B)。所以選擇CAOV3作為本實(shí)驗(yàn)研究對象。

圖1CXCR4在卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.1ExpressionofCXCR4inovariantissuespecimensandovariancancercells

A：Real-timePCR檢測CXCR4mRNA在正常卵巢組織、卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)；B：Westernblot檢測CXCR4蛋白在3種卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)。β-actin為內(nèi)參。與正常卵巢組織比較，***P<0.001。

2.2CXCR4shRNA抑制CAOV3細(xì)胞CXCR4表達(dá)分別于轉(zhuǎn)染CXCR4shRNA后48、72h檢測CAOV3細(xì)胞CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染shCXCR4的細(xì)胞與陰性對照(shNC)組細(xì)胞相比，CXCR4的mRNA水平下降了91%(P=0.003)(圖2A)，蛋白水平下降了46%(P=0.008)(圖2B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3CXCR4基因沉默對CAOV3細(xì)胞增殖和侵襲性的影響分別于CXCR4shRNA轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞后1、2、3、4、5d進(jìn)行MTT檢測。與shNC組比較，shCXCR4對CAOV3細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，在第4天(P=0.037)和第5天(P=0.011)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，shCXCR4組具有侵襲性的細(xì)胞數(shù)為(9.33±2.52)個(gè)，與shNC組(17.00±2.65)個(gè)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.4CXCR4基因沉默對Wnt通路相關(guān)基因和侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響為了研究CXCR4與Wnt/β-catenin通路之間的關(guān)系，采用Real-timePCR法檢測CXCR4shRNA轉(zhuǎn)染后Wnt/β-catenin通路中β-catenin的編碼基因CTNNB1，靶基因C-MYC、MMP-9和CD44的mRNA表達(dá)，同時(shí)檢測EMT相關(guān)基因vimentin和SLUG的mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：與shNC組比較，shCXCR4可明顯抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因和EMT相關(guān)基因的表達(dá)(P<0.05，圖5)。

圖2轉(zhuǎn)染CXCR4shRNA后卵巢癌細(xì)胞CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)

Fig.2CXCR4expressionaftershRNAtransfectionA：Real-timePCR檢測CXCR4基因的表達(dá)；B：Westernblot檢測CXCR4蛋白的表達(dá)。β-actin為內(nèi)參。與shNC組比較，**P<0.01。

圖3CXCR4基因沉默對CAOV3細(xì)胞增殖的影響

Fig.3TheknockdownofCXCR4inhibitedtheproliferationabilityofCAOV3ovariancancercells

與相同時(shí)間點(diǎn)shNC比較，*P<0.05。

圖4CXCR4基因沉默對CAOV3細(xì)胞侵襲性的影響

Fig.4TheknockdownofCXCR4inhibitedtheinvasiveabilityofCAOV3ovariancancercells

A：shNC；B：shCXCR4。與shNC組比較，*P<0.05。

圖5CXCR4基因沉默對Wnt通路相關(guān)基因和EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig.5InfluenceofCXCR4knockdownonWnttargetgenesandEMT-relatedgenes

與shNC比較，*P<0.05，**P<0.01。

3　討　　論

預(yù)防或減緩細(xì)胞轉(zhuǎn)移的治療可以明顯提高卵巢癌患者生存率。細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素調(diào)整的過程，CXCR4是趨化因子家族的重要成員之一，也是唯一在卵巢癌細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體。已有研究證明，正常的乳腺組織低表達(dá)CXCR4，而乳腺癌組織中CXCR4的表達(dá)明顯增加[6]。CXCR4的表達(dá)與前列腺癌、肺癌、食道癌和黑素瘤等腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[7-10]。體外研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4基因沉默可抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。研究運(yùn)用RNA干擾來探討CXCR4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。

我們首先檢測了正常卵巢組織、卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織和細(xì)胞株都高表達(dá)CXCR4,并且在研究的三種細(xì)胞株中，CAOV3的CXCR4表達(dá)最高。為研究CXCR4的作用，我們設(shè)計(jì)合成針對CXCR4的shRNA質(zhì)粒載體，為了避免空載體對細(xì)胞的影響，同時(shí)合成無義序列的質(zhì)粒作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明shCXCR4可以有效地抑制CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)。由于腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞無限增殖的結(jié)果，我們在CXCR4表達(dá)抑制的基礎(chǔ)上檢測了CAOV3細(xì)胞的生長。結(jié)果表明，CXCR4基因沉默可明顯降低CAOV3細(xì)胞的增殖活性，與湯容[11]等的研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步研究CXCR4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用，我們進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染shCXCR4的細(xì)胞侵襲性被明顯抑制，驗(yàn)證了我們先前研究的SDF-1/CXCR4軸在卵巢癌侵襲性中起重要作用的結(jié)果[12]。

CXCR4影響細(xì)胞增殖和遷移的特異機(jī)制目前尚不明確。Wnt/β-catenin通路的活化在許多人類腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[13]，而且其靶基因的激活可以通過影響細(xì)胞遷移、增殖和血管生成等促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[14]。我們檢測了Wnt/β-catenin通路中的主要靶基因CTNNB1(編碼β-catenin)、C-MYC、MMP-9和CD44在CXCR4基因沉默細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)明顯降低。WANG[15]等研究證明阻斷CXCR4可以抑制Wnt/β-catenin通路在胰腺癌中的活性。另外，由于Wnt/β-catenin通路參與了EMT過程，我們同時(shí)檢測了EMT過程中主要基因SLUG和Vimentin表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4基因沉默后SLUG和Vimentin基因表達(dá)明顯下調(diào)，與ONOUE等[16]在口腔癌中的研究結(jié)果一致。

綜上所述，CXCR4的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲性密切相關(guān)，CXCR4基因沉默可以通過抑制Wnt/β-catenin通路從而抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證明CXCR4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，CXCR4有可能成為卵巢癌患者基因治療的有效靶點(diǎn)。

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(編輯邱芬)

BlockageofCXCR4affectsthemetastasisofovariancancerviaWnt/β-cateninsignalingpathway

WANGJia1,WANGZe-hua2

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061; 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,UnionHospitalofTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

ObjectiveTodeterminetheroleandthepossiblemechanismsofchemokinereceptor4 (CXCR4)inthemetastasisofovariancancer.MethodsReal-timePCRandWesternblotwereusedtoanalyzetheexpressionofCXCR4innormalovariantissues,malignantepithelialovariantumorsandovariancancercelllinesandtheexpressionofCXCR4inCAOV3cellaftertransfectedwithshRNAagainstCXCR4.MTTassayandTranswellmigrationassaywereusedtodetecttheresultingalterationsincellproliferationandmigration.Last,wedetectedthemRNAexpressionofWnt/β-cateninrelatedgenesandEMT-relatedgenes.ResultsCXCR4washighlyexpressedinmalignantovariantumorsandovariancancercelllines.CXCR4expressionwasinhibitedbyshRNAagainstCXCR4.KnockdownofCXCR4couldobviouslyreducetheproliferationandinvasionofovariancancercells.Moreover,Wnttargetgenes(CTNNBI,C-MYC,MMP-9,andCD44)andmesenchymalmarkerssuchasVimentinandSLUGwerealsoinhibitedbyshRNAagainstCXCR4.ConclusionCXCR4playsacriticalroleinthemetastasisofhumanovariancancerthroughmodulatingtheWnt/β-cateninsignalingpathway.

ovariancancer;chemokinereceptor4 (CXCR4);Wnt/β-catenin;RNAinterference

2015-12-17

2016-05-25

王澤華.E-mail:zehuawang@163.net

R737.33

A

10.7652/jdyxb201605009

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1119.006.html(2016-08-03)