老年性癡呆患者顳葉皮層差異基因的生物信息學(xué)分析

虞雪云　牛吉攀　張占軍　王　磊　白衛(wèi)國　衛(wèi)東鋒

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京　100700)

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·心、腦血管及代謝性疾病·

老年性癡呆患者顳葉皮層差異基因的生物信息學(xué)分析

虞雪云牛吉攀1張占軍2王磊3白衛(wèi)國衛(wèi)東鋒

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100700)

目的探討老年性癡呆患者顳葉皮層的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在癡呆早期的病機(jī)機(jī)制。方法從基因芯片公共數(shù)據(jù)庫GEO中下載老年性癡呆患者顳葉皮層的基因芯片數(shù)據(jù)，采用在線分析軟件STRING和PANTHER對表達(dá)明顯差異的基因進(jìn)行生物信息學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，尋找關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。結(jié)果在40個差異表達(dá)基因編碼的蛋白中，有19個蛋白與其他蛋白存在相互作用關(guān)系，TBP、AKT1、CS、HSPB1及PARD6A蛋白為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白。差異明顯的基因主要涉及分子結(jié)合、催化活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性功能，與阿爾茨海默病(AD)-早老素信號通路、γ-氨基丁酸合成通路、AD-淀粉樣蛋白分泌酶通路有關(guān)，參與了顳葉皮層的細(xì)胞間通訊、糖脂代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等生理學(xué)過程。結(jié)論AD顳葉皮層的發(fā)病與TBP、AKT1、CS、HSPB1及PARD6A等基因密切相關(guān)，主要涉及AD-早老素信號通路、γ-氨基丁酸合成通路和AD-淀粉樣蛋白分泌酶通路，有利于針對性的采用具有調(diào)節(jié)相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)功能的藥物進(jìn)行早期干預(yù)，保護(hù)AD患者的認(rèn)知功能。

老年性癡呆；顳葉皮層；差異表達(dá)基因；生物信息學(xué)；蛋白降解

顳葉皮層是一個較為敏感的腦區(qū)，在老年性癡呆(即阿爾茨海默病，AD)早期受病程的影響會發(fā)生改變，分子機(jī)制較為復(fù)雜〔1，2〕。迄今為止，基因組學(xué)方法為AD的機(jī)制研究提供了大量的臨床數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析方法對這些臨床檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，探討AD在早期的病機(jī)特征，可為AD的早期診斷、治療及實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)〔3〕。本研究利用來自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)一組AD患者顳葉皮層(布洛德曼21區(qū)和22區(qū))組織具有明顯差異的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，深入探討早期AD患者顳葉皮層的分子網(wǎng)絡(luò)改變情況。

1　材料與方法

1.1差異明顯的基因表達(dá)數(shù)據(jù)在GEO數(shù)據(jù)庫搜索框中以“Temporal cortex of Alzheimer′s disease”為檢索詞，獲得Tan MG和Lai MK提交的GSE37263基因芯片數(shù)據(jù)。GSE37263采用的是商業(yè)化的Affymetrix 人類外顯子1.0 ST芯片平臺GPL5175，基因數(shù)據(jù)分別來自25個AD患者和16個非AD正常對照的顳葉皮層組織，其中兩組間前20個表達(dá)明顯上調(diào)和下調(diào)的差異基因見表1。

1.2差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用圖譜分析將差異明顯的39個基因相應(yīng)的蛋白名稱上傳至STRING9.05蛋白-蛋白相互作用關(guān)系在線分析軟件(http：//www.string-db.org)，通過調(diào)節(jié)可信度和附加節(jié)點(diǎn)參數(shù)，獲得差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用圖，篩選出中心節(jié)點(diǎn)蛋白。

1.3差異表達(dá)基因的生物學(xué)特征分析分別將前20個表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的明顯差異基因ID號上傳至PANTHER 8.1在線分類系統(tǒng)(http：//www.pantherdb.org)，通過調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)類型及分析類型參數(shù)，分別獲得上調(diào)和下調(diào)差異基因的分子功能、表達(dá)蛋白分類、生物學(xué)過程及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果。

表1　前20個表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的差異基因

2　結(jié)　果

2.1差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用結(jié)果STRING9.05蛋白相互作用在線分析軟件分析結(jié)果表明，共有19個蛋白與其他蛋白存在相互作用關(guān)系，蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖1。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中包含5個小的子網(wǎng)絡(luò)，分別與基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝、蛋白降解及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附及應(yīng)激反應(yīng)、上皮細(xì)胞縫隙連接有關(guān)。其中，TBP、AKT1與網(wǎng)絡(luò)中的其他≥8個蛋白存在相互作用關(guān)系，CS、HSPB1及PARD6A蛋白與網(wǎng)絡(luò)中的其他≥3個蛋白存在相互作用關(guān)系，為5個蛋白子網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。TP53和AKT1為總蛋白網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，與其他大部分蛋白質(zhì)均存在相互作用關(guān)系。刪除這些核心節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測的相關(guān)蛋白質(zhì)見表2。2.2差異表達(dá)基因的分子功能分類結(jié)果通過PANTHER系統(tǒng)分類軟件分析發(fā)現(xiàn)，前20個表達(dá)明顯上調(diào)的差異基因共涉及8種分子功能，其中基因數(shù)≥2的分子功能包括分子結(jié)合、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、核酸結(jié)合及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，見表3。前20個表達(dá)明顯下調(diào)的差異基因共涉及6種分子功能，其中基因數(shù)≥2的分子功能包括分子結(jié)合、催化活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。見表4。

表2　蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測的相關(guān)蛋白

續(xù)表2　蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測的相關(guān)蛋白

圖1　差異明顯基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

序號分子功能基因數(shù)量基因簡稱百分比(%)AccessionID1分子結(jié)合7RASL12、ANKRD49、TRIP10、YBX3、TIGD3、FOXO4、RANBP3L3500054882催化活性2RASL12、ITPKB1000038243酶調(diào)節(jié)活性2ANKRD49、RANBP3L1000302344肌動活動1KIF1C500037745受體活性1CD44500048726結(jié)構(gòu)分子活性3HSPB1、KIF1C、TRIP101500051987核酸結(jié)合2YBX3、FOXO41000305288轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性2AQP1、SLC7A2100005215

2.3差異表達(dá)基因的蛋白分類結(jié)果Panther分類系統(tǒng)的蛋白分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，明顯上調(diào)的差異基因共涉及11類蛋白，其中基因數(shù)≥2的蛋白類別包括細(xì)胞連接蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、調(diào)節(jié)酶、核酸結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)錄因子，見表5。明顯下調(diào)的差異基因共涉及13類蛋白，其中基因數(shù)≥2的蛋白類別包括裂解酶、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)移酶，見表6。

2.4差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程通過Panther分類系統(tǒng)的生物學(xué)過程分析發(fā)現(xiàn)，前20個表達(dá)明顯上調(diào)的差異基因共涉及11個生物學(xué)過程，其中基因數(shù)≥2的生物學(xué)過程包括細(xì)胞黏附過程、細(xì)胞間通訊過程、細(xì)胞周期、細(xì)胞組分的組成過程、細(xì)胞生理過程、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、系統(tǒng)過程及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其所含基因數(shù)量、基因簡稱、百分比及ID號。見表7。前20個表達(dá)明顯下調(diào)的差異基因共涉及14個生物學(xué)過程，其中基因數(shù)≥2的生物學(xué)過程包括細(xì)胞間通訊過程、細(xì)胞周期、細(xì)胞生理過程、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程及系統(tǒng)過程，其所含基因數(shù)量、基因簡稱、百分比及ID號。見表8。

2.5差異表達(dá)基因所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果生物學(xué)信號通路分析發(fā)現(xiàn)，差異明顯的基因共涉及16條生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中基因數(shù)≥2的信號通路為AD-早老素信號通路和γ-氨基丁酸合成通路，其他14條信號通路僅涉及1個差異基因，其通路名稱、所占百分比及ID號，見表9。

表4　下調(diào)基因的分子功能分類結(jié)果

表5　上調(diào)基因所涉及的蛋白分類

表6　下調(diào)基因所涉及的蛋白分類

表7　上調(diào)基因所涉及的的生物學(xué)過程

表8　下調(diào)基因所涉及的生物學(xué)過程

表9　差異明顯基因所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3　討　論

已有研究表明，由β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑是AD的特征性病理變化之一，而Aβ是由跨膜蛋白β淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶分解后產(chǎn)生〔4，5〕。有研究認(rèn)為，寡聚化的Aβ會對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，其機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、線粒體能量代謝障礙、突觸損傷、Tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)和細(xì)胞凋亡有關(guān)〔6〕。研究表明，由Tau蛋白異常如蛋白結(jié)構(gòu)錯誤折疊、Tau蛋白過度磷酸化可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降、神經(jīng)纖維纏結(jié)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能失調(diào)及軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而引起Tau蛋白介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病如AD的發(fā)生〔7〕。

本研究數(shù)據(jù)來源于人腦顳葉皮層組織，涉及的水通道蛋白1、冷休克域蛋白A、熱休克27 kD蛋白、肌醇-1，4，5-三磷酸鹽-3激酶B、神經(jīng)突蛋白1、神經(jīng)源性分化因子 6、驅(qū)動蛋白家族成員1C、蘋果酸脫氫酶1、谷氨酸脫羧酶2、谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)移酶 2及神經(jīng)元正五聚蛋白Ⅱ等與氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)代謝、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞骨架、能量代謝等相關(guān)，表明顳葉皮層的病理變化與之前的AD研究結(jié)果具有一些相似之處，但部分基因的表達(dá)變化有所不同，值得進(jìn)一步深入研究。蛋白-蛋白相互作用研究結(jié)果表明，AD患者顳葉皮層的差異基因之間存在相互作用關(guān)系，以基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝、蛋白降解及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附及應(yīng)激反應(yīng)、上皮細(xì)胞縫隙連接方面的基因關(guān)系較為密切，其中TBP、AKT1、CS、HSPB1及PARD6A作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)值得進(jìn)一步深入研究，為早期AD的診斷提供了線索和依據(jù)。

中醫(yī)藥對老年性癡呆的防治作用是典型的復(fù)雜系統(tǒng)作用的結(jié)果，具有多靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)綜合調(diào)控的生物學(xué)特點(diǎn)。采用“網(wǎng)絡(luò)對網(wǎng)絡(luò)”的生物信息學(xué)方法研究老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制，是適合中醫(yī)藥作用特點(diǎn)的研究新方法和新模式，才有可能真正揭示其相互作用關(guān)系及作用機(jī)制，使其“復(fù)雜而可知”。本研究生物信息學(xué)分類結(jié)果表明，AD患者顳葉皮層的差異明顯基因主要涉及分子結(jié)合、催化活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性功能，通過調(diào)節(jié)AD-早老素信號通路、γ-氨基丁酸合成通路、AD-淀粉樣蛋白分泌酶通路及三羧酸循環(huán)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了顳葉皮層的細(xì)胞間通訊、糖脂代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞黏附等生理學(xué)過程，為早期AD患者大腦皮層的病機(jī)研究提供了新思路和防治靶標(biāo)。

1Kerrigan TL，Randall AD.A new player in the “synaptopathy” of Alzheimer′s disease-arc/arg 3.1.〔J〕.Front Neurol，2013;4(9):1-7.

2Zhou B，Liu Y，Zhang Z，etal.Impaired functional connectivity of the thalamus in Alzheimer′s disease and mild cognitive impairment:a resting-state fMRI study〔J〕.Curr Alzheimer Res，2013;10(7)：754-66.

3Farrer LA.Expanding the genomic roadmap of Alzheimer′s disease〔J〕.Lancet Neurol，2015；14(8)：783-5.

4Sindi S，Mangialasche F,Kivipelto M.Advances in the prevention of Alzheimer′s Disease〔J〕.F1000 Prime Rep，2015；7(1)：50.

5Roberson ED，Mucke L.100 years and counting：prospects for defeating Alzheimer′s disease 〔J〕.Science，2006；314(5800)：781-4.

6Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；297(5580)：353-6.

7Ballatore C，Lee VM，Trojanowski JQ.Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer′s disease and related disorders〔J〕.Nat Rev Neurosci，2007；8(9)：663-72.

〔2016-05-06修回〕

(編輯袁左鳴)

Bioinformatic analysis of differentially expressed genes of temporal cortex in Alzheimer′s disease patients

YU Xue-Yun,NIU Ji-Pan,ZHANG Zhan-Jun,et al.

Institute of Basic Research in Clinical Medicine,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China

ObjectiveTo observe the biological network regulation mechanism and key nodes of temporal cortex to provide new thoughts for basic research and clinical treatment of Alzheimer′s disease(AD) at early stage.MethodsThe microarray genes data from temporal cortex of AD patients were downloaded from the Gene Expression Omnibus(GEO) database and analyzed by bioinformatics methods using STRING and PANTHER online analysis software.ResultsOf all the 40 differentially expressed genes，19 were found to encode proteins with interactions,in which TBP,AKT1,CS,HSPB1 and PARD6A proteins were key nodes of the protein-protein network.Bioinformaties results indicate that the differentially expressed genes had binding,catalytic activity and transcription regulator activity and were involved in AD-presenilin pathway,Gamma-aminobutyric acid synthesis pathway and AD-amyloid secretase pathway.These genes also participated in cell communication,glucose and lipid metabolism and transport process of temporal cortex.ConclusionsThe pathology of temporal cortex in AD patients might be closely related to TBP,AKT1,CS,HSPB1 and PARD6A genes and are mainly involve in AD-presenilin pathway,Gamma-aminobutyric acid synthesis pathway and AD-amyloid secretase pathway.It contributes to the prevention and treatment of AD using drug based on gene regulatory network.

Alzheimer′s disease;Temporal cortex;Differentially expressed genes;Bioinformaties;Protein degradation

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81274001);國家科技重大專項(xiàng)-重大新藥創(chuàng)制(2013ZX09103002-002，2013ZX09301307)

衛(wèi)東鋒(1982-)，男，助理研究員，博士，主要從事中醫(yī)藥防治老年性癡呆研究。

虞雪云(1984-)，女，助理研究員，主要從事醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)研究。

R741

A

1005-9202(2016)16-3927-06；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.026

1河南省省直第二醫(yī)院腫瘤科

2北京師范大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)與學(xué)習(xí)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院