吡格列酮對戊四氮致癇大鼠Toll樣受體、核因子-κB表達(dá)的影響

金玉玲　單　鶴　劉　蕾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)一科，黑龍江　佳木斯　154003)

?

吡格列酮對戊四氮致癇大鼠Toll樣受體、核因子-κB表達(dá)的影響

金玉玲單鶴劉蕾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)一科，黑龍江佳木斯154003)

目的研究過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ激動(dòng)劑吡格列酮對癲癇大鼠海馬組織Toll樣受體(TLR)4及核因子(NF)-κB表達(dá)的影響。方法建立雄性SD大鼠腹腔注射PTZ誘導(dǎo)癲癇模型，根據(jù)組別給予不同劑量PTZ連續(xù)灌胃，RT-PCR法檢測各組大鼠海馬區(qū)TLR4及NF-κB含量，免疫熒光檢測TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果通過RT-PCR及免疫組化檢測，癲癇模型組(PTZ)大鼠腦海馬TLR4、NF-κB含量比正常對照組(NC組)增高(P<0.05)；PTZ干預(yù)低、中、高劑量組(PL、PM、PH組)的TLR4、NF-κB表達(dá)量較PTZ組減低(P<0.05)，且隨著PTZ干預(yù)劑量增加而調(diào)低，并于PH組顯著下降(P<0.05)。結(jié)論戊四氮致癇大鼠海馬區(qū)TLR4及其下游信號(hào)NF-κB表達(dá)增加，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮能夠通過降低TLR4及NF-κB表達(dá)，從而減輕癲癇發(fā)作對神經(jīng)系統(tǒng)的炎性損傷，這可能是其對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一。

癲癇；戊四氮；過氧化物酶增殖物激活受體γ；吡格列酮；Toll樣受體4；核因子-κB

癲癇發(fā)病機(jī)制及其治療方法是目前研究的熱點(diǎn)。癲癇發(fā)作后明顯存在炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)增加了神經(jīng)元的興奮性、加速了癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)一步影響了癲癇的再次發(fā)作，增加了癲癇發(fā)作的易感性。調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)信號(hào)的激活可阻斷這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生而達(dá)到治療目的。癲癇是以腦部神經(jīng)元過度發(fā)放所致突發(fā)、反復(fù)、短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ的激活與神經(jīng)細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，目前對其研究主要集中在急性腦缺血再灌注早期對神經(jīng)系統(tǒng)的作用，本實(shí)驗(yàn)研究PPARγ受體激動(dòng)劑吡格列酮預(yù)處理對戊四氮致癇大鼠腦組織Toll樣受體(TLR)4及核因子(NF)-κB表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑SD健康大鼠(由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；戊四氮(美國SIGMA公司)；吡格列酮(PTZ，沈陽施德藥業(yè)有限公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen)；cDNA合成試劑盒(Fermentas)；PCR儀、微量加樣槍(Eppendorf)；凝膠成像系統(tǒng)(OMEGA)；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體(BOSTER)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立SD雄性健康大鼠70只，體重(200±20)g，隨機(jī)分為正常對照組(NC組)，癲癇模型組(PTZ組)，PTZ低劑量組(1.5 mg/kg，PL組)、中劑量組(4.0 mg/kg，PM組)、高劑量組(6.0 mg/kg，PH組)，每組14只。參照Morgan等〔1〕的方法并略加改動(dòng)。PTZ用前以生理鹽水新鮮配制成溶液(10 g/L)，除NC組注射等量生理鹽水外，各組均給予PTZ(35 mg/kg，每日1次)腹腔注射，持續(xù)28 d；停藥1 w，再以相同劑量PTZ腹腔注射。PTZ以生理鹽水溶解分別配制成混懸液，PL、PM、PH組于注射PTZ前60 min分別灌胃(灌胃前禁食6 h)，NC組及PTZ組同時(shí)給予等體積的生理鹽水，每天1次，至處死大鼠前1 d。

1.3大鼠行為學(xué)觀察各組大鼠每日經(jīng)上述處置后，均參考Racine等〔2〕為觀察行為變化的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。癲癇大鼠發(fā)作的行為學(xué)變化的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：正常行為狀態(tài)；Ⅰ級(jí)：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐，濕狗樣顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)：以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主要表現(xiàn)的頸部肌肉的抽搐；Ⅲ級(jí)：前肢的陣攣、抽搐；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢伸直，伴有身體的立起；Ⅴ級(jí)：跌倒和全身驚厥。Ⅲ級(jí)以下為復(fù)雜部分發(fā)作，Ⅳ級(jí)和Ⅴ級(jí)為全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。注藥后即進(jìn)行行為學(xué)觀察，如果在1 h內(nèi)出現(xiàn)Ⅰ～Ⅴ級(jí)行為變化的歸為癲癇模型。

1.4取材處理在末次給藥次日處死大鼠，4℃取右腦海馬組織，保存于組織勻漿和液氮中備用，各組樣本行TLR4、NF-κB mRNA復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測。取左腦采用石蠟包埋組織化學(xué)技術(shù)，對各組切片行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理學(xué)改變及TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況。

1.5RT-PCR檢測海馬TLR4 、NF-κB mRNA表達(dá)海馬約50 mg，TRIzol法抽提總RNA，經(jīng)DU-800紫外分光光度計(jì)檢測RNA含量。選取OD值1.8～2.2的總RNA(500 ng)為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，引物由上海生工公司合成，PCR引物：TLR4上游5′-TGGCAGTTTCTGAGTAGCCG-3′,下游5′-GCTACTTCCTTGTGCCCTGT-3′,398 bp;NF-κB上游5′-ATGTTCGGTAGTGGCGGTG-3′,下游5′-CAGCATCTTCACATCTCCCGT-3′,524 bp;β-actin上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′,下游5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′,173 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，退火溫度30 s，60℃(TLR4)/62℃(NF-κB)/58℃(β-actin)30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶(DAB)染色，凝膠成像儀成像。采用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析結(jié)果，以TLR4、NF-κB與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物光密度的比值反映表達(dá)水平。

1.6免疫熒光染色檢測TLR4、NF-κB取腦后，10%甲醛液(4℃)固定過夜，選擇海馬部位(前囟后2.8～4.5 mm水平)，冠狀切取厚3 mm 左右的組織，石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，厚度為5 μm，貼片、烤片后。進(jìn)行免疫組化染色。按照SP及DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。每只大鼠同一位置取5張切片，將切片置于顯微鏡下觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元TLR4、NF-κB的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組動(dòng)物行為學(xué)觀察癲癇各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射戊四氮后5～10 min內(nèi)開始出現(xiàn)不同程度的癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為節(jié)律性嘴部咀嚼樣運(yùn)動(dòng)、流涎和面部抽動(dòng)，反復(fù)點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、尾巴上翹，雙前上肢抬起陣攣，四肢抽搐，部分動(dòng)物出現(xiàn)翻滾跳躍，進(jìn)展為全身強(qiáng)直樣發(fā)作，每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間為5～30 min不等，發(fā)作后完全緩解，個(gè)別達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物可有自動(dòng)驚厥發(fā)作，NC組大鼠均無癇性發(fā)作。

2.2各組大鼠海馬組織TLR4及NF-κB mRNA水平的變化TLR4及NF-κB在PTZ組表達(dá)顯著高于NC組(P<0.01)；而在PL組其表達(dá)低于PTZ組(P<0.05)；PM組二者表達(dá)低于PTZ、PL組(P<0.05)；PH組表達(dá)顯著調(diào)低且均低于PTZ、PL、PM組(P<0.05)。且治療各組大鼠大腦海馬區(qū)TLR4及NF-κB的表達(dá)隨著PTZ干預(yù)劑量增加而調(diào)低(P<0.05)。見表1，圖1、圖2。

表1　不同組別大鼠海馬中TLR4及NF-κB光密度值的比較

與NC組比較：1)P<0.01；與PTZ組比較：2)P<0.05；與PL組比較：3)P<0.05；與PM組比較：4)P<0.05，下表同

2.3免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)變化TLR4在細(xì)胞質(zhì)和胞膜上表達(dá)，呈黃色顆粒狀。在NC組中TLR4表達(dá)量較少；在PTZ組TLR4表達(dá)上調(diào)，與NC組相比差異顯著(P<0.01)；治療各組(PL、PM、PH組)與PTZ組相比TLR4表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。NF-κB在細(xì)胞核中表達(dá)，呈黃色顆粒，在NC組中NF-κB表達(dá)量較少；在PTZ組中NF-κB表達(dá)上調(diào)，與NC組相比差異顯著(P<0.05)；治療各組(PL、PM、PH)與PTZ組相比，NF-κB表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。見表2，圖3、圖4。

1～6:Marker,NC組、PTZ組、PL組、PM組、PH組，下圖同圖1　各組大鼠海馬組織TLR4 mRNA表達(dá)

圖2　各組大鼠海馬組織NF-κB mRNA表達(dá)

組別TLR4NF-κBNC組15.79±1.315.10±1.25PTZ組25.89±1.71)24.88±1.191)PL組21.91±1.32)4)22.59±0.912)4)PM組20.05±1.12)3)21.70±0.582)3)PH組18.90±1.02)3)4)17.40±1.252)3)4)

圖3　免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中TLR4的表達(dá)情況(DAB，×100)

圖4　免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中NF-κB的表達(dá)情況(DAB，×100)

3　討　論

不同的癲癇模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，癲癇后的腦損傷是慢性炎癥反應(yīng)過程，免疫炎癥反應(yīng)在癲癇發(fā)生與進(jìn)程中起重要作用，即使沒有感染存在，細(xì)胞處于受損或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)所發(fā)出的信號(hào)也能引發(fā)免疫反應(yīng)〔3〕，而具有抗驚厥特性的抗炎藥品在臨床和實(shí)驗(yàn)中的使用與研究〔4〕，更加突現(xiàn)了大腦內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)可能是構(gòu)成癲癇反復(fù)發(fā)作的重要機(jī)制之一〔5〕，研究顯示，驚厥發(fā)作后即可激活腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞，并釋放多種炎癥因子，從而引發(fā)并加劇炎癥反應(yīng)，同時(shí)癲癇發(fā)作后常常伴有膠質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂，這些因素均可促進(jìn)形成興奮性病灶，癲癇腦損傷既是癲癇發(fā)作的結(jié)果，又是癲癇頻發(fā)和難治的原因。

TLR4通過識(shí)別結(jié)合相關(guān)的信號(hào)分子，最終引起NF-κB活化并進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TLR4分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞〔6〕，并且近年來研究發(fā)現(xiàn)TLR4廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括創(chuàng)傷性腦損傷、帕金森病、阿茲海默爾病等神經(jīng)退行性疾病及腦缺血后神經(jīng)損傷，這種損傷介導(dǎo)缺血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔7，8〕。

NF-κB是啟動(dòng)TLR4下游信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，在TLR4信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)及炎癥相關(guān)因子及炎癥遞質(zhì)之間釋放的級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)中起樞紐作用，當(dāng)機(jī)體受到各種病理刺激后NF-κB發(fā)生核移位進(jìn)入細(xì)胞核，與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，調(diào)控多種基因的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔9〕。NF-κB的核移位在調(diào)控神經(jīng)元突觸重塑的過程中扮演了“細(xì)胞因子”的角色并參與神經(jīng)膠質(zhì)疤痕的形成〔10〕。國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后引起腦組織不同程度的NF-κB激活，并于伴有海馬硬化的癲癇患者的齒狀回及周圍反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中發(fā)現(xiàn)NF-κBp65呈過度表達(dá)〔11，12〕。因此認(rèn)為NF-κB可能在癲癇發(fā)作中具有重要作用〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常大鼠海馬區(qū)TLR4及NF-κB表達(dá)量極少，而PTZ組海馬區(qū)TLR4及NF-κB表達(dá)增多，推測該機(jī)制可能與反復(fù)癇性發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元缺血、缺氧、ATP耗竭，中樞神經(jīng)系統(tǒng)微的環(huán)境改變，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，引起TLR4及其下游信號(hào)NF-κB激活，引起一系列炎癥級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是慢性癲癇腦損傷形成的潛在機(jī)制之一。

PPARγ在炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗、糖代謝、腫瘤中有重要的調(diào)節(jié)作用，并參與神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟，并與神經(jīng)細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，PPARγ通過與NF-κB蛋白間相互作用，抑制NF-κB與炎癥介質(zhì)基因啟動(dòng)子區(qū)合，可抑制NF-κB介導(dǎo)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-2的生成以發(fā)揮抗炎作用，另有研究表明在癲癇鼠模型中，PPARγ可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，阻止癲癇后的炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用〔14〕。PPARγ激動(dòng)劑已被認(rèn)為是TLR4的有效抑制劑〔15〕。PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制由LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)和NF-κB的活化并可以調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)。

本研究說明PPARγ激動(dòng)劑對大鼠癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是PPARγ激動(dòng)劑可抑制TLR4信號(hào)通路的活化，從而影響其下游信號(hào)通路NF-κB的激活，另外PPARγ可直接抑制NF-κB的核移位及與靶基因DNA的結(jié)合，減少NF-κB調(diào)控的一系列細(xì)胞因子，進(jìn)而對炎性因子的釋放發(fā)揮抑制作用。PPARγ激動(dòng)劑PTZ可以通過抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)減少癲癇發(fā)作造成的腦損傷，減輕癲癇后的炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。

1Morgan JI，Cohen DR，Hempstead JL，etal.Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous system after seizure〔J〕.Science，1987；237(4811)：192-7.

2Racine RJ，Steingart M，Mc Intyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies〔J〕.Epilepsy Res，1999；35(3)：183-95.

3Song YS，Lee YS，Chan PH.Oxidative stress transiently decreases the IKKcom(IKKalpha，beta，and gamma)，an upstream component of NF-Kappa B signaling，after transient focal cerebral ischemia in mice〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2005；25(10)：1301-11.

4Vezzani A，F(xiàn)riedman A，Dingledine RJ.The role of inflammation in epileptogenesis〔J〕.Neuropharmacology，2013；69：16-24.

5Vezzani A，Maroso M，Balosso S,etal.IL-1 receptor/Toll-like receptor signaling in infection，inflammation，stress and neurodegeneration couples hyperexcitability and seizure〔J〕.Brain Behav Immun，2011；25(7)：1281-9.

6Laflamme N，Rivest S.Toll like receptor 4：the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cellwall components〔J〕.Mol Immunol,2005；42(2)：155-63.

7Faraco G，F(xiàn)ossati S，Bianchi ME，etal.High mobility group box 1 protein is released by neural cells upon different stresses and worsens ischemic neurodegeneration in vitro and in vivo〔J〕.Neurochem，2007；103(2)：590-603.

8Kim JB，Lim CM，Yu YM，etal.Induction and subcellular localization of high-mobility group box-1(HMGB1) in the postischemic rat brain〔J〕.Neurosci Res，2008；86(5)：1125-31.

9Hayden1 MS，Ghosh S.Shared principles in NF-κB signaling〔J〕.Cell，2008；132(3)：344-62.

10Albensi BC，Mattson MP.Evidence for the involvement of TNF and NF-kappa B in hippocampal synaptic plasticity〔J〕.Synapse，2000；35(2)：151-9.

11Crespel A，Coubes P，Rousset MC，etal.Inflammatory reactions in human medial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis〔J〕.Brain Res，2002；952：159-69.

12王建平，曹亞芹，蘇怡凡.癲癎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κb活化的變化〔J〕.中國當(dāng)代兒科雜志，2009，2009；11(1)：54-6.

13呂日瑯，徐曉云，趙永波.核因子-κB在癲癇中的作用〔J〕.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2012;25(6):469-70.

14Sun H，Huang Y，Yu X.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist，rosiglitazone，suppresses CD40 expression and attenuates inflammatory responses after lithium pilocarpine-induced status epilepticus in rats〔J〕.Int J Dev Neurosci,2008;26(5):505-15.

15Dasu MR，Park S，Devaraj S，etal.Pioglitazone inhibits Toll-like receptor expression and activity in human monocytes and db/db mice〔J〕.Endocrinology，2009；150：3457-64.

〔2014-12-03修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

劉蕾(1965-)，女，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事癲癇發(fā)病機(jī)制研究。

金玉玲(1965-)，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理研究。

R749

A

1005-9202(2016)16-3890-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.009