過氧化物酶體增殖物激活受體β在老齡膿毒血癥大鼠肺部炎癥中的作用

曾　增　周國鵬

(北京大學第一醫(yī)院老年科，北京　110034)

?

過氧化物酶體增殖物激活受體β在老齡膿毒血癥大鼠肺部炎癥中的作用

曾增周國鵬

(北京大學第一醫(yī)院老年科，北京110034)

目的探討激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-β對老齡膿毒血癥大鼠模型肺部炎癥、炎癥指標及死亡率的影響。方法選用24月齡雄性SD大鼠，通過盲腸結扎穿孔(CLP)手術建立膿毒血癥模型，予GW501516 0.25、0.75 mg/kg為低、高劑量組。分別液體復蘇CLP術后大鼠，與空白對照組、單純CLP手術組比較24、48 h死亡率，運用HE染色、免疫組化染色及RT-PCR等方法了解肺組織中PPAR-β及Akt-1、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、白細胞介素(IL)-6的表達。結果(1)24 h死亡率：單純手術組42.1%，低劑量組10%，高劑量組20%；48 h死亡率：單純手術組27.3%，低劑量組16.7%，高劑量組50%。(2)RT-PCR：CLP術后24 h PPAR-β表達下調(diào)，使用GW501516后上調(diào)PPAR-β表達。CLP手術打擊可上調(diào)IL-6、NF-κB炎癥因子表達量，使用GW501516后IL-6、NF-κB表達量下調(diào)，Akt-1表達量上調(diào)。(3)HE染色：CLP手術打擊后肺組織中大量炎性細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫充血，GW501516處理組肺部炎性細胞浸潤、間質(zhì)水腫減輕。(4)免疫組化：使用GW501516后肺組織中PPAR-β陽性細胞增多。結論低劑量GW501516(0.25 mg/kg)可降低膿毒血癥老齡大鼠早期死亡率，其機制與激活Akt-1、下調(diào)NF-κB有關。

膿毒血癥；過氧化物酶體增殖物激活受體-β；生物分子信號通路

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，分為PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ三種亞型，其中PPAR-β可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種與代謝和炎癥相關疾病的病理生理過程〔1〕。膿毒血癥發(fā)生時，肺部是全身炎癥反應的始動器官，其中急性肺損傷(ALI)/呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生率高達25%～44%〔2，3〕。膿毒血癥致ALI/ARDS發(fā)病機制復雜，死亡率高，死亡的主要原因多為多器官衰竭；年齡增高也是導致死亡率增高的重要原因〔3〕。PPAR-β活化是否參與肺部炎癥反應調(diào)控的研究較少，尤其缺乏關于老年群體的研究。本文通過盲腸結扎穿孔(CLP)的方法建立老齡大鼠膿毒血癥模型，觀察PPAR-β及相關指標在肺組織的表達。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物從北京大學醫(yī)學部實驗動物中心購得雄性SD大鼠。大鼠購進時為3月齡，于實驗動物中心飼養(yǎng)至24月齡進行實驗。飼養(yǎng)期間使用標準飼料，不限食水，保持12∶12 h晝夜規(guī)律。所有動物實驗均經(jīng)過北京大學實驗動物委員會批準。

飼養(yǎng)至24月齡時，SD大鼠存活46只，隨機分為非CLP手術對照組(CON組，n=5)、CLP手術組(CLP組，n=19)、CLP手術+低劑量激動劑干預組(CLP-LD組，n=10)、CLP手術+高劑量激動劑干預組(CLP-HD組，n=10)、單純高劑量激動劑干預48 h組(NO-CLP-HD-48組，n=2)。其中CLP、LD、HD組內(nèi)再分為術后24 h觀察組及48 h觀察組(CLP-24組，n=8；CLP-48組，n=11；CLP-LD-24組，n=4；CLP-LD-48組，n=6；CLP-HD-24組，n=4；CLP-HD-48組，n=6)。

1.1.2試劑常用普通化學試劑均為市售分析純；高純總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)；引物(北京奧科鼎盛生物科技有限公司)；RT-PCR反應體系(Taq酶，dNTP等)(北京全式金生物技術有限公司)；普通PCR反應體系(Taq酶，dNTP等)(北京康為世紀生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中山金橋公司)；GW501516(Enzo Life Sciences Inc)。

1.2建模雄性SD大鼠于術前6 h停止進食水。術前稱重，予3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體重)腹腔麻醉。麻醉完成后，將大鼠仰臥位固定于操作臺上。建立CLP模型：(1)下腹部備皮，75%酒精局部消毒。(2)行下腹中線切口(3～4 cm)，逐層進入腹腔。(3)確認并分離盲腸。(4)結扎盲腸。(5)使用20 ml針頭從兩側串通結扎后盲腸造成人為腸穿孔。(6)盲腸還納腹腔。(7)逐層關腹。(8)按照表1于大鼠背部皮下注射進行液體復蘇(37℃，5 ml/100 g體重)。(9)建模完成后將各組老齡大鼠分開放回籠中讓其自由飲食。

表1　液體復蘇溶液組分

1.3標本采集各組實驗動物在預定時相點予3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體重)腹腔注射麻醉后固定。打開胸腔，心臟穿刺放血處死。取右肺下葉，4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，留做病理學檢查及免疫組化染色。取右肺上葉組織約100 mg，放入1.5 ml去RNA酶EP管，液氮凍實后放入-80℃冰箱保存，留做提取RNA用。

1.4RT-PCR將所取標本按照試劑盒說明書提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄，應用生物學軟件Primer3.0設計引物。引物序列：PPAR-β正義鏈GTGTCAGTACTGCCGCTTCCA，反義鏈CTCCGGCATCCTTCCAAAG，目的片段長度100 kD，退火溫度60℃；Akt-1正義鏈CTGTGGCTGATGGACTCAAA，反義鏈CCTCAGCACCTGAGTTGTCA，目的片段長度84 kD,退火溫度59℃；NF-κB正義鏈CCTTCTAAAGGCTGGTGCTG，反義鏈ATGGCCTCGGAAGTTTCTTT，目的片段長度136 kD,退火溫度59℃；β-actin正義鏈AGCCATGTACGTAGCCATCC，反義鏈GCTGGGTGGTGAAAGCTGTA，目的片段長度222 kD,退火溫度59℃。運用MJ Research公司的Opticon實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，程序：95℃預變性5 min；循環(huán)35次：90℃變性30 s，58℃～60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。以管家基因β-actin的表達為內(nèi)參照，用擴增基因/β-actin的灰度比值對該基因的表達進行半定量。

1.5肺組織HE染色及PPAR-β免疫組化染色

1.5.1肺組織HE染色將切片標本逐個經(jīng)過以下試劑：二甲苯(5 min×3次)、100%乙醇(3 min×3次)、95%乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)、雙蒸水(5 min)、雙蒸水(5 min)。之后蘇木素染核30 s，自來水終止，酒精鹽酸分色，依紅染色。運用梯度酒精分色、透明后，中性樹膠封片，37℃恒溫箱烘干，顯微鏡下觀察、照相。

1.5.2PPAR-β免疫組化染色將切片標本逐個經(jīng)過以下試劑：二甲苯(5 min×3次)、100%乙醇(3 min×3次)、95%乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)、雙蒸水(5 min)、雙蒸水(5 min)，3%雙氧水溶液避光浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min?？乖瓱嵝迯汀?.01 mol/L PBS溶液漂洗3次，每次5 min。用濾紙將水分吸干，1%牛白蛋白封閉，室溫放置30 min。濾紙將水分吸干，加一抗，放入濕盒中4℃過夜。0.01 mol/L PBS溶液漂洗3次，每次5 min。用濾紙將水分吸干，滴加二步法試劑盒中的試劑2(標記有辣根過氧化物酶的抗兔的一種結合兔來源的一抗)，放入37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS溶液漂洗3次，每次5 min。用濾紙吸干水分，滴加顯色液二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，顯微鏡下觀察顯色情況，雙蒸水終止反應。蘇木素染核30 s，鹽酸酒精分色3～5 s，自來水沖洗反藍。梯度酒精脫水、透明。中性樹膠封片，37℃恒溫箱烘干，顯微鏡下觀察、照相。

1.6統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism 5.0軟件，各組間比較使用one way ANOVA檢驗或t檢驗，不符合條件的使用nonparametric檢驗。各組間死亡率比較使用χ2檢驗，不符合條件的使用Fisher檢驗。

2　結　果

2.1死亡率CLP術后24 h觀察點，CLP組術后24 h內(nèi)死亡8只(42.1%)；使用不同劑量GW501516鹽水復蘇后，CLP-LD組24 h內(nèi)死亡1只(10.0%)，CLP-HD組24 h內(nèi)死亡2只(20.0%)。以CLP術后48 h觀察點，CLP-48組48 h內(nèi)共死亡3只(27.3%)；CLP-LD-48組48 h內(nèi)死亡1只(16.7%)，CLP-HD-48組48 h內(nèi)死亡3只(50.0%)。

2.2肺組織HE染色見圖1。CLP手術打擊后肺組織中大量炎性細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫充血，GW501516處理組肺部炎性細胞浸潤、間質(zhì)水腫減輕。

2.3PPAR-β免疫組化染色結果見圖2。使用GW501516后肺組織中PPAR-β陽性細胞增多。

2.4RT-PCR結果見表2。CLP術后24 h PPAR-β表達下調(diào)，使用GW501516后上調(diào)PPAR-β表達。CLP手術打擊可上調(diào)白細胞介素(IL)-6、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等炎癥因子表達量，使用GW501516后IL-6、NF-κB表達量下調(diào)，Akt-1表達上調(diào)。見表1。

圖1　老齡大鼠肺組織HE染色(×400)

圖2　老齡大鼠肺組織PPAR-β免疫組化染色(×200)

指標CON組(n=5)CLP-24組(n=8)CLP-LD-24組(n=4)CLP-HD-24組(n=4)PPAR-β1.0000±0.42500.5057±0.46751.4260±0.26611.8680±0.0732Akt-10.9999±0.29160.9673±0.56711.8690±0.69550.7283±0.2214NF-κB1.0000±0.29351.3130±0.71101.0980±0.39921.4090±1.0550IL-60.9992±0.55841.4270±0.01461.0790±0.51310.6971±0.3497指標CLP-48組(n=11)CLP-LD-48組(n=6)CLP-HD-48組(n=6)NO-CLP-HD-48組(n=2)PPAR-β1.4160±0.98791.6370±0.84444.7270±2.89303.1450±0.2464Akt-12.5250±1.30500.9107±0.39021.5830±0.62311.0090±0.0000NF-κB2.4420±2.50001.1760±0.48031.0810±0.42551.1980±0.5066IL-61.7300±1.54400.6424±0.51260.5489±0.08211.1140±0.6245

3　討　論

膿毒血癥發(fā)生后，肺外炎性介質(zhì)通過循環(huán)系統(tǒng)進入肺內(nèi)，導致肺血管充血，血管內(nèi)皮細胞損傷，血管通透性增加及單核細胞、淋巴細胞、多核細胞、血小板等炎性細胞聚集，進而引起肺小血管的充血和肺間質(zhì)水腫，導致肺泡萎陷。這一病生理過程與許多信號傳導通路有關，目前研究證實〔4～6〕，NF-κB信號通路、Janus激酶/信號傳導-轉(zhuǎn)錄活化因子通路、P38MAPKs通路、PI3K/PKB信號通路均在這一過程中起調(diào)控作用。本實驗選用GW501516作為PPAR-β的激動劑，結果提示使用GW501516后，肺組織中PPAR-β含量較空白對照組升高，提示激動劑起效。

PPARβ/δ在體內(nèi)廣泛分布，其功能目前仍然不詳?，F(xiàn)有的研究表明它和脂質(zhì)代謝、骨代謝、腫瘤、生殖、腦發(fā)育及炎癥等有關〔7〕，可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種與代謝和炎癥相關的疾病的病理生理過程。目前的研究提示，PPAR-β在炎癥反應中可能主要通過NF-κB通路、p38MAPK信號通路及PI3K-Akt信號通路共同調(diào)控炎癥因子的表達，調(diào)控炎癥反應的進程〔4～6〕。

Kapoor等〔4〕采用注射內(nèi)毒素的方法建立小鼠膿毒血癥模型，結果發(fā)現(xiàn)，給予PPAR-β激動劑GW0742后，與單純手術處理的組別比較，小鼠肺部炎癥反應減輕，炎癥因子釋放減少，生存率增加，其機制可能與激活Akt及抑制GSK-3β和NF-κB有關，且NF-κB的下調(diào)可能通過MAPK-ERK1/2信號通路調(diào)控。另一項研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，給予PPAR-β激動劑GW0742處理內(nèi)毒素注射誘發(fā)的肺炎小鼠，可以明顯減少肺部白細胞聚集浸潤，降低IL-6、IL-1β及TNF-α的表達。Fan等〔9〕用PPAR-β激動劑處理人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)，給予PPAR-β激動劑后可明顯抑制內(nèi)皮細胞黏附分子的表達及白細胞的聚集，減少氧化應激，但NF-κB并不被抑制。以上研究都提示，PPAR-β具有抗炎作用，但其抗炎的機制目前尚存爭議。本實驗通過CLP方法建立膿毒血癥模型，此模型的發(fā)病機制除了內(nèi)毒素造成以外，還包括腸道其他細菌毒素的致傷作用及手術打擊等，模型病情較重，肺部病理損害明顯〔10〕，發(fā)病過程和病理表現(xiàn)與危重監(jiān)護室(ICU)老年膿毒血癥病人ALI/ARDS的特點類似。

IL-6在炎癥刺激下由多種細胞釋放，介導急性時相反應，刺激肝細胞合成急性反應蛋白〔11〕，本實驗結果顯示CLP手術處理后，老齡大鼠肺組織中IL-6 mRNA含量較空白對照組呈上調(diào)趨勢，且從肺組織HE染色結果可以看出，CLP術后24 h肺組織內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)水腫、充血，說明CLP手術后老齡大鼠體內(nèi)炎癥反應模型建立。有學者認為IL-6能較為可靠的反映肺組織局部損傷的程度〔12〕。本實驗結果也提示，激活PPAR-β后可以下調(diào)IL-6，膿毒血癥致老齡大鼠肺部炎癥反應減輕。本文死亡率結果提示PPAR-β活化后，通過下調(diào)IL-6，可降低膿毒血癥致肺部炎癥的老齡大鼠早期死亡率，這種對死亡率的影響尤其以低劑量組明顯。

NF-κB在ARDS的發(fā)病中起重要作用，與機體非特異性免疫反應具有密切關系，廣泛參與炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1、IL-6)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1)、趨化因子和一些炎性相關酶類(基質(zhì)金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶和一氧化碳合酶)等基因的調(diào)控；而TNF-α、IL-6等又能作為NF-κB的調(diào)節(jié)產(chǎn)物激活NF-κB，從而形成能不斷延續(xù)并逐級放大炎癥反應的調(diào)節(jié)環(huán)路〔13〕，導致瀑布效應，導致全身炎癥反應綜合征的發(fā)生，進而造成包括ALI/ARDS在內(nèi)的多器官衰竭。Blackwell等〔13〕通過腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素建立SD大鼠ARDS模型，并運用凝膠電泳遷移率改變法檢測肺泡灌洗液中NF-κB的活性，發(fā)現(xiàn)注射內(nèi)毒素后1 h NF-κB顯著升高，在2.5 h及7 h均恢復正常水平；而對照組中核蛋白中僅有少量NF-κB。Blackwell還檢測了注射內(nèi)毒素小鼠的肺泡巨噬細胞和肺組織中NF-κB的活性，在這些細胞和組織中均可檢測到高活性的NF-κB。提示早期運用拮抗NF-κB活化的藥物可以有效控制全身急性炎癥反應，改善病情和預后。本實驗結果提示，運用低劑量GW501516激活PPAR-β后，可通過下調(diào)IL-6等促炎因子，進一步下調(diào)NF-κB表達，減低瀑布效應，從而起到抗炎作用，降低老齡大鼠死亡率，此結果與Kapoor等〔4〕的實驗結論一致。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，由PI3K家族與其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(PKB)組成，該通路廣泛存在于細胞中，參與細胞增殖、凋亡及分化等功能的調(diào)控?；罨腁kt激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。磷酸化后的Akt可通過調(diào)控激活IKKα復合體還可影響NF-κB的活化。Akt活化后，可以下調(diào)GSK-3β的表達從而抑制葡萄糖代謝；還可下調(diào)Bad的表達，促進細胞凋亡。由此看出，Akt活化后在炎癥反應、免疫反應、細胞增殖、細胞凋亡等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。有實驗顯示〔14〕，急性肺損傷時肺組織中磷酸化Akt表達減少，肺組織中髓過氧化物酶活性增加。 本實驗結果顯示，使用低劑量GW501516處理膿毒血癥致老齡大鼠肺部炎癥后，在早期降低死亡率與上調(diào)Akt-1的表達有關，此結果與Kapoor等〔4〕的結論一致。

綜上，低劑量GW501516(25 μg/100 g體重)可降低膿毒血癥致肺部炎癥老齡大鼠早期死亡率，其機制可能與激活PPAR-β后上調(diào)Akt-1、下調(diào)NF-κB從而減輕肺部炎癥反應有關。

1Braissant O，F(xiàn)oufelle F，Scotto C，etal.Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)：tissue distribution of PPAR-α，-β，and-γ in the adult rat 〔J〕.Endocrinology，1996；137(1)：354-66.

2Garcia-Gonzalez MJ，Dominguez-Rodriguez A，F(xiàn)errer-Hita JJ.Unusual etiology of acute lung injury in a patient with acute myocardial infarction〔J〕.Int J Cardiol，2007；117(3)：95-7.

3Frutos-Vivar F，Nin N，Esteban A.Epidemiology of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome〔J〕.Curr Opin Crit Care，2004；10(1)：1-6.

4Kapoor A，Shintani Y，Collino M，etal.Protective role of peroxisome proliferator-activated receptor-β/σ in septic shock〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2010；182(2)：1506-15.

5Haskova Z，Hoang B，Luo G，etal.Modulation of LPS-induced pulmonary neutrophil in filtration and cytokine production by the selective PPAR-beta/delta ligand GW0742〔J〕.Inflamm Res，2008；57(7)：314-21.

6Yuan TL，Cantley LC.PI3K pathway alterations in cancer：variations on a theme〔J〕.Oncogene，2008；27(41)：5497-510.

7Corton JC，Anderson SP，Stauber A.Central role of peroxisome proliferator-activated receptors in the actions of peroxisome proliferators〔J〕.Ann Rev Pharmacol Toxicol，2000；40(4)：491-518.

8Haskova Z，Hoang B，Luo G，etal.Modulation of LPS-induced pulmonary neutrophil infiltration and cytokine production by the selective PPAR-beta/delta ligand GW0742〔J〕.Inflamm Res，2008;57(7)：314-21.

9Fan Y，Wang Y，Tang Z，etal.Suppression of pro-inflammatory adhesion molecules by PPAR-delta in human vascular endothelial cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008；28(2)：315-21.

10De Campos T，Deree J，Coimbra R.From acute pancreatitis to end-organ injury：mechanisms of acute lung injury〔J〕.Surg Infect(Larchmt)，2007；8(1)：107-20.

11van der Pouw-Kraan TC,Boeije LC,Smeenk RJ,etal.A Prostaglandin-E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production〔J〕.Exp Med，1995；181(2)：775-9.

12Zingarelli B，Sheehan M，Wong HR.Nuclear factor-κB as a therapeutic target in critical care medicine〔J〕.Crit Care Med，2003；31(1)：S105-11.

13Blackwell TS，Blackwell TR，Christman JW.Impaired activation of nuclear factor-kappa B in endotoxin-tolerant rats is associated with down-regulation of chemokine gene expression an inhibition of neutrophilic lung inflammation〔J〕.J Immunol，1997；158(12)：5934-40.

14Yang SJ，Chen HM，Hsieh CH，etal.Akt pathway is required for oestrogen-mediated attenuation of lung injury in a rodent model of cerulein-induced acute pancreatitis〔J〕.Injury，2010；42(7)：638-6.

〔2016-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

周國鵬(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事高齡病人多器官系統(tǒng)疾病的診治以及老年危重癥的搶救和診治研究。

曾增(1986-)，女，博士，主要從事老年患者呼吸及危重癥的診治研究。

R631

A

1005-9202(2016)16-3880-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.005