美洲大蠊浸膏對大鼠HSC和SEC增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響

胡建鵬，宋正己，尋琳婷,李玉蓮,趙雪茹,李　霆，張　镕

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·論著·

美洲大蠊浸膏對大鼠HSC和SEC增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響

胡建鵬1，宋正己2*，尋琳婷2,李玉蓮2,趙雪茹2,李霆2，張镕1

目的探究美洲大蠊浸膏(APE)對體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。方法用稀釋不同倍數(shù)的美洲大蠊浸膏干預(yù)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)。MTT法測定HSC-T6和SEC的增殖情況；ELISA測定藥物干預(yù)后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中α-SMA、Ⅳ型膠原和層粘連蛋白(LN)的含量。結(jié)果美洲大蠊浸膏叮抑制HSC-T6和SEC的增殖，并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。美洲大蠊浸膏組細(xì)胞上清中α-SMA、Ⅳ型膠原和層粘連蛋白(LN)的含量低于對照組。結(jié)論美洲大蠊浸膏可抑制HSC-T6和SEC增殖，并不同程度抑制α-SMA、Ⅳ-C和LN的分泌，有可能成為防治肝纖維化的臨床用藥。

美洲大蠊浸膏；肝星狀細(xì)胞；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞外基質(zhì)

0　引言

肝纖維化(Liver fibrosis)是慢性肝損傷的共同結(jié)果[1-3]，是慢性肝病發(fā)展至肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的必經(jīng)階段[4-5]。肝纖維化發(fā)生的主要機(jī)制是肝損傷引起實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生，間質(zhì)細(xì)胞活化增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)，ECM沉積于肝組織中，形成纖維化。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC-T6)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Sinusoidal endothelial cells,SEC)是肝臟中最主要的促纖維化間質(zhì)細(xì)胞，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源[6-8]。抑制HSC和SEC激活、增殖以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)是抗肝纖維化的治療靶點(diǎn)[9]。本研究通過不同濃度的美洲大蠊浸膏干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠HSC-T6和SEC，檢測該藥物對大鼠HSC-T6和SEC增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響，在細(xì)胞水平探索美洲大蠊提取浸膏的抗肝纖維化藥用價(jià)值，同時(shí)為臨床抗纖維化治療提供新途徑。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要儀器倒置相差顯微鏡(德國萊卡)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、小型臺(tái)式離心機(jī)(美國Thermo)；Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)；上海琪特漩渦混合儀(QT-1)；SW-CJ-2F標(biāo)準(zhǔn)化超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋(日本sanyo)。

1.1.2主要試劑特級胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，USA)；PBS、青-鏈霉素(北京，Hyclone)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma)；二甲基亞砜(DMSO)(Solavbia)；ELISA試劑盒R&B公司進(jìn)口分裝，0.25%胰蛋白酶(Solarbio)。

1.1.3細(xì)胞大鼠HSC-T6購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫；大鼠SEC購自上海諾辰生物技術(shù)有限公司。

1.1.4藥物美洲大蠊提取浸膏由云南大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。浸膏樣品保存于-20 ℃冰箱，臨用前夜轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱緩慢解凍，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋10倍后，0.22 μm微孔濾器過濾，再繼續(xù)用上述培養(yǎng)基分別稀釋至25、50、100、200、400倍。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與美洲大蠊干預(yù)對數(shù)生長期的HSC-T6和SEC分別用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成5×104cells/mL的濃度，接種于96孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5% 濃度CO2無菌恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日待細(xì)胞貼壁后，加入上述美洲大蠊浸膏稀釋液(稀釋倍數(shù)為10、25、50、100、200、400倍)，每孔100 μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，對照組加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測HSC-T6和SEC增殖情況待上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育2 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，溶解細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶，避光振蕩10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定各孔OD值，測得的各復(fù)孔OD值取平均數(shù)，計(jì)算抑制率。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法檢測收集上述美洲大蠊浸膏干預(yù)48 h的HSC-T6和SEC復(fù)孔中的培養(yǎng)液，3 500 r/min離心10 min后取上清，用ELISA檢測上清液中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅳ型膠原蛋白(Ⅳ-Col)和層粘連蛋白(LN)的含量。參考R& B ELISA試劑盒操作方法，分別取各組細(xì)胞培養(yǎng)液和標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入試劑盒自帶96孔板內(nèi)，每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，37 ℃溫育60 min后洗板5次，拍干后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光溫育15 min，每孔加終止液50 μL，15 min內(nèi)450 nm波長處測定各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品中α-SMA、Ⅳ-Col和LN含量。

2　結(jié)果

2.1結(jié)果處理美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖抑制率按如下公式計(jì)算：抑制率(IE)=(對照孔OD570-實(shí)驗(yàn)孔OD570)/對照孔OD570×100%。

2.2美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖的抑制作用與對照組比較，干預(yù)培養(yǎng)48 h后，不同濃度美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖都有明顯的抑制作用(P<0.05)，抑制率隨稀釋倍數(shù)的增加而降低，當(dāng)稀釋倍數(shù)≤100倍時(shí)，美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖均有極顯著抑制作用(P<0.01)。見表1、圖1。

表1　美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖的抑制作用(n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.3美洲大蠊浸膏對HSC-T6分泌α-SMA、Ⅳ-Col和LN的影響美洲大蠊浸膏干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，可不同程度抑制HSC-T6分泌細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA、Ⅳ-Col和LN。當(dāng)美洲大蠊浸膏稀釋倍數(shù)≤100倍時(shí)，HSC-T6培養(yǎng)上清液中α-SMA、Ⅳ-Col和LN含量均呈現(xiàn)出極顯著下降趨勢(P<0.01)；當(dāng)稀釋倍數(shù)=200倍時(shí)，α-SMA、Ⅳ-Col和LN含量均下降(P<0.05)；而當(dāng)稀釋倍數(shù)=400倍時(shí)，美洲大蠊浸膏抑制HSC-T6分泌Ⅳ-Col(P<0.05)，而對α-SMA和LN分泌的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4美洲大蠊浸膏對SEC分泌α-SMA、Ⅳ-Col和LN的影響美洲大蠊浸膏干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，可有效抑制SEC分泌細(xì)胞外基質(zhì)。其中對LN(P<0.01)和Ⅳ-Col(P<0.05)的分泌抑制效果最為明顯，各濃度均有顯著性差異；當(dāng)美洲大蠊浸膏稀釋倍數(shù)≤100倍時(shí)，對α-SMA分泌的抑制作用也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖1　美洲大蠊浸膏對HSC-T6和SEC增殖抑制率隨稀釋倍數(shù)的變化

組別稀釋倍數(shù)α-SMA(μg/L)Ⅳ-Col(μg/L)LN(μg/L)HSC-T6對照組-0.296±0.00843.686±5.12353.115±5.280APE100.208±0.002**29.742±6.114**31.493±6.173**250.221±0.003**32.261±3.150**38.255±5.318**500.247±0.009**34.105±2.048**44.371±2.592**1000.265±0.005**35.905±3.815**45.293±3.479**2000.274±0.009*38.285±3.165*48.398±2.074*4000.289±0.01140.192±5.547*50.005±3.082

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

表3　美洲大蠊浸膏對SEC分泌細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA、Ⅳ-Col和LN的影響(n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3　討論

在臨床病例中，引起慢性肝損傷的原因很多，其中病毒感染(乙型和丙型肝炎病毒)、寄生蟲感染(血吸蟲、華支睪吸蟲和并殖吸蟲)、長期飲酒、自身免疫和不當(dāng)用藥是最常見的引起肝損傷進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的原因[10]。肝硬化常常是不同慢性肝病進(jìn)展的共同結(jié)局，在此基礎(chǔ)上引發(fā)的如食管靜脈曲張破裂出血、門靜脈高壓、肝性腦病、腹水、肝腎綜合征等并發(fā)癥，給患者的生活帶來極大痛苦甚至威脅生命[8]?？垢卫w維化治療能延緩疾病進(jìn)程，減少并發(fā)癥的發(fā)生，是目前慢性肝病除針對病因治療外，最積極的干預(yù)手段[11]。

在目前治療肝纖維化的眾多中西藥中，動(dòng)植物來源的藥物占有重要地位。昆蟲類藥物資源的利用在我國歷史悠久，有很廣泛的開發(fā)和利用價(jià)值。蜚蠊科昆蟲美洲大蠊提取物含有多元醇類、肽類、表皮生長因子以及多種氨基酸等活性物質(zhì)，對多種癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，同時(shí)具有提高機(jī)體免疫力、保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛及促進(jìn)血管新生、肉芽組織增生、創(chuàng)傷愈合、胃腸黏膜損傷修復(fù)、改善危重癥患者腸道營養(yǎng)、治療消化道潰瘍等作用[12]。

肝纖維化的病理特征是ECM在肝臟Dish間隙間的過度沉積，引起肝細(xì)胞營養(yǎng)代謝發(fā)生障礙。ECM包括α-SMA、膠原纖維蛋白、蛋白多糖、黏連蛋白和基質(zhì)細(xì)胞蛋白等，其中膠原蛋白是ECM最主要的成分[4,13-16]。活化的HSCs是ECM產(chǎn)生的主要來源，促纖維化因子可刺激HSCs分泌ECM，其表現(xiàn)為α-SMA表達(dá)上調(diào)[17]。因此，α-SMA被視為HSC活化的標(biāo)志物。Ⅳ-Col是構(gòu)成基底膜的主要成分，在肝纖維發(fā)生時(shí)出現(xiàn)最早，其合成與降解水平反映基底膜膠原蛋白更新率，其含量增高是早期肝纖維化發(fā)生的主要標(biāo)志之一。LN是基底膜主要的多糖之一，由干細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞合成，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LN水平可反映肝纖維化進(jìn)程與嚴(yán)重程度，與肝纖維化活動(dòng)程度及門靜脈壓力呈正相關(guān)。血清中Ⅳ-Col和LN聯(lián)合檢測對肝纖維化程度的判斷以及早期肝硬化的診斷具有一定的臨床意義[18]。

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生，間質(zhì)細(xì)胞激活、增殖是肝纖維化間質(zhì)重建的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，通過激活免疫細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1、PDGF、VEGF、腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子以及炎性介質(zhì)和活性氧，可促使靜止HSC與SEC激活，活化的HSC具有血管平滑肌細(xì)胞特性，能促進(jìn)新生血管的構(gòu)建[19-21]。在肝纖維發(fā)生早期，作為一種代償反應(yīng)，肝竇內(nèi)皮失窗孔在一定程度上能緩解肝細(xì)胞損傷。但是肝竇毛細(xì)血管內(nèi)皮窗孔關(guān)閉及內(nèi)皮下基底膜的形成阻礙了肝細(xì)胞從Diss間隙攝取營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)影響肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的血氧供給，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞缺氧[4]，缺氧可刺激肝星狀細(xì)胞迅速活化。此外，內(nèi)皮下基底膜的形成阻礙了視黃酸類物質(zhì)從肝竇彌散進(jìn)入Diss間隙，由肝細(xì)胞攝取再轉(zhuǎn)入星狀細(xì)胞貯存，這使得肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞[22]?；罨蟮腍SC增殖性、遷移性和收縮性明顯增加，HSC內(nèi)維生素A脂滴丟失，同時(shí)表達(dá)特征性的α-SMA，細(xì)胞同時(shí)合成和分泌的膠原蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸等ECM積聚于肝臟內(nèi)，導(dǎo)致肝纖維化[23]。因此，活化HSC在肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展中起到核心作用，其數(shù)量增多和ECM積聚是肝纖維化中組織結(jié)構(gòu)重建的表現(xiàn)[4,24-25]。抑制HSC激活或者促進(jìn)活化的HSC凋亡成為抗肝纖維化治療的有效途徑。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，美洲大蠊浸膏能不同程度抑制大鼠HSC和SEC增殖，其抑制作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性；同時(shí)美洲大蠊浸膏還能抑制HSC和SEC分泌α-SMA、Ⅳ-Col和LN等細(xì)胞外基質(zhì)。

綜上所述，美洲大蠊浸膏能抑制HSC和SEC活化及增殖，并抑制ECM的合成、促進(jìn)其降解，對延緩肝纖維化進(jìn)程有一定作用，為臨床應(yīng)用提供新的理論支持。但是具體通過何種途徑或分子機(jī)制發(fā)生抗肝纖維化作用，還需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

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Effect of periplaneta americana extract on the proliferation and extracellular matrix secretion of rat HSC-T6 and SECinvitro

HU Jian-peng1,SONG Zheng-ji2*,XUN Lin-ting2,LI Yu-lian2,ZHAO Xue-ru2,LI Ting2,ZHANG Rong1

(1.Medical School,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Department of Gastroenterology,the First People′s Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,China)

ObjectiveTo investigate the effect of periplaneta americana extract on the proliferation and extracellular matrix secretion of rat hepatic stellate cells (HSC-T6) and sinusoidal endothelial cells (SEC )invitro.MethodsHepatic stellate cell line (HSC-T6) and sinusoidal endothelial cells (SEC) were treated with different concentrations of periplaneta americana extract.MTT assay was employed to determine the proliferation of HSC-T6 and SEC.Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) was performed to measure the content of α-SMA,Ⅳ collagen and laminin (LN) in the culture of HSC-T6′s and SEC′s supernatants.ResultsMTT test showed that,compared with control group,the proliferations of HSC-T6 and SEC were significantly inhibited by the treatment of periplaneta americana extract with concentration dependence within a certain range.Moreover,the periplaneta americana extract also inhibited α-SMA,Ⅳ collagen and LN secretion both in the culture of HSC-T6′s and SEC′s supernatants in differents degrees by ELISA assay.ConclusionPeriplaneta americana extract mediates anti-hepatic fibrosis by inhibiting the proliferations of HSC-T6 and SEC,and preventing the secretions of α-SMA,Ⅳ collagen and LN.Therefore,it may be the potential drug for preventing and treating liver fibrosis.

Periplaneta americana extract;Hepatic stellate cells;Sinusoidal endothelial cell;Cell proliferation;Extracellular matrix

2016-04-21

1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2.云南省第一人民醫(yī)院消化科，昆明 650032

國家自然科學(xué)基金(81560107)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng))(2014FB091)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609001