銀萊湯對食積復合FM1流感病毒感染小鼠血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響

王云輝　李曉菲　甄建華　于河　劉鐵鋼　谷曉紅

?

銀萊湯對食積復合FM1流感病毒感染小鼠血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響

王云輝李曉菲甄建華于河劉鐵鋼谷曉紅

目的探討銀萊湯對食積復合流感病毒感染小鼠免疫功能的影響，為銀萊湯藥效機理的研究提供實驗依據(jù)。 方法雄性昆明小鼠90只，隨機分為正常對照組、感染模型組、食積感染模型組、銀萊湯高中低劑量組、雙黃連組、小兒化食丸組、利巴韋林組共九組，每組10只。食積感染模型組及各治療組均采用高蛋白、高熱量飼料結(jié)合52%牛奶溶液灌胃的方法制作食積動物模型，感染組小鼠則采用流感病毒亞甲型鼠肺適應株流感病毒滴鼻處理，并予相應的治療藥物或生理鹽水灌胃。實驗結(jié)束后，取眼球血，采用ELISA法檢測血清中免疫球蛋白及細胞因子的含量。 結(jié)果與正常組比較，感染組、食積感染組各免疫球蛋白A、G、M及白細胞介素(interleukin，IL)-2、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-a，TNF-α)及干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)水平顯著增高(P<0.05)；而食積感染組的IL-4降低。與食積感染組比較，各治療組免疫球蛋白A、G、M的水平降低，其中銀萊湯低劑量組和利巴韋林組明顯降低(P<0.05)；銀萊湯各治療組細胞因子IFN-γ升高(P<0.05)。與正常組相比，銀萊湯各治療組免疫球蛋白A、G、M升高，但無統(tǒng)計學差異，而細胞因子IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)。銀萊湯各劑量組與小兒化食丸組、雙黃連組相比，免疫球蛋白A、G、M無統(tǒng)計學差異，銀萊湯各劑量組與小兒化食丸組、雙黃連組、利巴韋林組的細胞因子IL-4、IL-10、TNF-α相比無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論銀萊湯可通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白及細胞因子的分泌，有效調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，進而發(fā)揮其抗病毒療效。

銀萊湯；食積；FM1流感病毒；免疫球蛋白；細胞因子

團隊多年臨床研究發(fā)現(xiàn)：小兒反復呼吸道感染患者常伴有消化道癥狀，如口臭、消谷善積、便干不暢、舌紅、苔黃厚、脈滑數(shù)等，采用銀萊湯肺胃同治法，往往能立桿見效。究其病因，可歸結(jié)為兩方面：一為小兒無自控能力，加之家長溺愛，飲食不知節(jié)制；二為現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的改變，速食、膨化產(chǎn)品的增加，往往導致內(nèi)有宿食積于胃腸，日久化熱，內(nèi)外相招，易致外感，形成肺胃積熱證。此時肺與胃腸相互影響，導致病情纏綿，不易向愈或愈后易復感，故治療時應肺胃同治。本研究以食積復合FM1流感病毒感染復制肺胃積熱證模型，通過觀察血清中免疫球蛋白及細胞因子的含量，探討肺胃同治之銀萊湯對動物模型的保護作用，并探索其藥效機理。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級昆明小鼠90只，雄性，3周齡，體質(zhì)量10～11 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學病原學系動物房實驗動物潔凈柜，飼養(yǎng)溫度20～24℃，濕度50%～60%，自然光照，通風良好。

1.2藥物制備

銀萊湯的基本處方為：金銀花30 g、萊菔子10 g、連翹15 g、黃芩10 g、前胡10 g、魚腥草20 g、瓜蔞15 g。飲片購自于北京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。制備過程：(1)蒸餾提取金銀花、魚腥草、連翹三味藥的揮發(fā)油，封口膜封好，4℃保存?zhèn)溆茫?2)其他藥物煎煮藥液，減壓濃縮藥液成膏狀，再加熱使藥液水分蒸發(fā)后干燥至固體，最后粉碎制成粉劑保存，使用時按比例滴加揮發(fā)油。

陽性對照藥：利巴韋林由四川百利藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)；雙黃連口服液由哈藥集團三精制藥有限公司生產(chǎn)；小兒化食丸由北京同仁堂生產(chǎn)。

1.3主要試劑

流感病毒亞甲型鼠肺適應株(FM1)，由北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病原免疫實驗室提供。經(jīng)統(tǒng)計得出LD50濃度為10-5.375。小鼠免疫球蛋白A(immunoglobulins A，IgA)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E07986m，規(guī)格：96 T)；小鼠免疫球蛋白G(IgG)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E07980m，規(guī)格：96 T)；小鼠免疫球蛋白M(IgM)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E07977m，規(guī)格：96T)；小鼠白介素-2(interleukin-2，IL-2)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-04627m，規(guī)格：96 T)；小鼠IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E04634m，規(guī)格：96 T)；小鼠IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E04594m，規(guī)格：96 T)；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-a，TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E04741m，規(guī)格：96 T)；小鼠γ干擾素(interferon-gamme,IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒(CSB-E04578m，規(guī)格：96 T)，以上試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.4 動物飼料

普通飼料為小鼠全價顆粒飼料。自制高熱量高蛋白飼料，制作方法：奶粉、豆粉、魚松、面粉配合比例為1∶2∶1∶1，混合后攪拌均勻，加適量水做成條索狀，狀如普通小鼠飼料，烘干備用。

1.5造模及分組給藥

小鼠隨機分為正常組、感染組、食積感染組、銀萊湯治療組(分為高、中、低劑量組)、雙黃連組、小兒化食丸組、利巴韋林組九組，每組10只。正常組、感染組喂飼普通小鼠飼料，實驗第二日用生理鹽水按 0.2 mL/10 g 灌胃，每天2次。其余各組喂飼自制高蛋白、高熱量飼料，實驗第2天，用52 %牛奶溶液按0.2 mL/10 g灌胃，每天2次。實驗第5天，正常組給予50 μL生理鹽水滴鼻，其余各組均給予以50 μL FM1流感病毒液滴鼻，病毒按1∶50000稀釋。實驗第5至第11天各組小鼠改喂普通小鼠飼料，正常組、感染組、食積感染組以生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，各治療組分別給予相應藥物0.2 mL/10 g灌胃，每天2次。第12天取材。銀萊湯高、中、低劑量組分別予銀萊湯粉劑溶于無菌生理鹽水，按成人臨床用量的2.5倍、5倍、10倍量折算，折算后其生藥量濃度分別為114.6 mg/mL、229.2 mg/mL、 458.3 mg/mL，并按比例于臨用前滴加揮發(fā)油。雙黃連組、小兒化食丸組、利巴韋林組分別予相應的藥物溶解于無菌生理鹽水，均按成人臨床用量的5倍折算，經(jīng)折算后其劑量濃度分別為125 μL/mL、12.5 mg/mL、0.9375 mg/mL。實驗過程中，因脫落最終分組為正常組8只，食積感染組8只，銀萊湯粉劑量組9只，銀萊湯中劑量組8只，利巴韋林組8只，余組10只。

1.6觀測指標

實驗結(jié)束后，摘眼球取血，4℃過夜，第2天于4℃、3000 rpm離心15分鐘，取上清液待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各指標，依照說明書進行操作。

1.7統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1小鼠血清中IgA、IgG及IgM表達水平的比較

與正常組相比，感染組和食積感染組小鼠血清中IgA、IgG、IgM水平明顯升高(P<0.05)；與食積感染組比較，銀萊湯高中低治療組及小兒化食丸組、雙黃連組、利巴韋林組的IgA、IgG、IgM水平降低，其中IgG的水平明顯降低(P<0.05)；與正常組相比，銀萊湯高中低治療組的IgA、IgG升高，其中銀萊湯高劑量組升高顯著(P<0.05)，銀萊湯低劑量組IgM水平較正常組降低，銀萊湯高中劑量組IgM水平較正常組升高，但均無統(tǒng)計學差異；小兒化食丸組和雙黃連組較正常組IgA、IgG水平升高，而IgM水平降低，而利巴韋林組則較正常組IgA、IgG、IgM水平明顯降低(P<0.05)；銀萊湯各治療組與利巴韋林組相比IgA、IgG、IgM水平明顯升高(P<0.05)，與小兒化食丸和雙黃連組相比，銀萊湯中低劑量組無統(tǒng)計學差異。見表1。

2.2小鼠血清中IL-2、IL-4及IL-10表達水平的比較

與正常組比較，感染組和食積感染組小鼠血清中IL-2、IL-10水平明顯升高(P<0.05)，而感染組IL-4水平升高，食積感染組IL-4水平降低，但無統(tǒng)計學差異；與食積感染組比較，銀萊湯低劑量組IL-2明顯降低(P<0.05)，銀萊湯高、中劑量組IL-2升高，但無統(tǒng)計學差異，而銀萊湯高劑量組IL-4明顯升高(P<0.05)，銀萊湯中、低劑量組IL-4無統(tǒng)計學差異；銀萊湯各治療組的IL-10水平較食積感染組無統(tǒng)計學差異；銀萊湯各治療組IL-2、IL-10水平較正常組明顯升高(P<0.05)，小兒化食丸組、雙黃連組、 利巴韋林組的IL-2、 IL-10水平較正常組也明顯升高(P<0.05)，銀萊湯中劑量組IL-4較正常組明顯降低(P<0.05)，銀萊湯高劑量組IL-4較正常組明顯升高(P<0.05)，而其余各治療組IL-4較正常組無統(tǒng)計學差異；銀萊湯低中劑量組與小兒化食丸組、雙黃連組、利巴韋林組相比IL-4、IL-10無統(tǒng)計學差異。見表2。

表1　各組小鼠血清中IgA、IgG及IgM水平

注： 與正常組比較，aP<0.05；與感染組比較，bP<0.05；與食積感染組比較，cP<0.05；與銀萊湯低劑量組比較，dP<0.05；與銀萊湯中劑量組比較，eP<0.05；與銀萊湯高劑量組比較，fP<0.05；與小兒化食丸組比較，gP<0.05；與雙黃連組比較，hP<0.05。

表2　各組小鼠血清中IL-2、IL-4及IL-10水平

注： 與正常組比較，aP<0.05；與感染組比較，bP<0.05；與食積感染組比較，cP<0.05；與銀萊湯低劑量組比較，dP<0.05；與銀萊湯中劑量組比較，eP<0.05；與銀萊湯高劑量組比較，fP<0.05；與小兒化食丸組比較，gP<0.05；與雙黃連組比較，hP<0.05。

2.3小鼠血清中TNF-α及IFN-γ表達水平的比較

與正常組相比，感染組和食積感染組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)；與食積感染組比較，銀萊湯低中劑量組TNF-α、IFN-γ水平升高，銀萊湯高劑量組TNF-α降低但無統(tǒng)計學差異，小兒化食丸組、雙黃連組、利巴韋林組的TNF-α、IFN-γ水平較食積感染組降低，其中利巴韋林組明顯降低(P<0.05)；銀萊湯各治療組及小兒化食丸組、雙黃連組TNF-α、IFN-γ水平較正常組明顯升高(P<0.05)，利巴韋林組較正常組TNF-α升高，IFN-γ降低，但均無統(tǒng)計學差異；銀萊湯中、高劑量組TNF-α水平與小兒化食丸組、雙黃連組無差異，與利巴韋林組相比則銀萊湯低中劑量組明顯升高(P<0.05)；銀萊湯高劑量組與利巴韋林組無差異，銀萊湯各治療組IFN-γ水平明顯高于雙黃連組、利巴韋林組(P<0.05)。見表3。

表3　各組小鼠血清中TNF-α及IFN-γ水平

注： 與正常組比較，aP<0.05；與感染組比較，bP<0.05；與食積感染組比較，cP<0.05；與銀萊湯低劑量組比較，dP<0.05；與銀萊湯中劑量組比較，eP<0.05；與銀萊湯高劑量組比較，fP<0.05；與小兒化食丸組比較，gP<0.05。

3　討論

IgA、IgM、IgG水平在一定程度上可以反映機體的體液免疫程度。IgA作為免疫球蛋白中重要成員之一，在黏膜免疫中發(fā)揮著重要作用，其能通過阻止病毒吸附到黏膜上皮細胞，從而能起到抗病毒作用[1-2]。IgM為體液免疫出現(xiàn)最早的抗體，感染早期主要由IgM發(fā)揮清除病原的作用，但之后血液中的IgM濃度會快速下降，所以通常將IgM作為判斷感染的指標[3]。IgG可以中和游離外毒素、病毒，并且能調(diào)理吞噬細胞的吞噬作用，為下呼吸道重要的保護性抗體，在機體免疫防護中發(fā)揮著主要作用。本研究結(jié)果顯示，IgA、IgM、IgG三指標水平變化基本一致，與正常組比較，感染組、食積感染組三指標水平均明顯升高，說明感染可以引起機體的體液免疫反應，導致免疫球蛋白升高，考慮為小鼠感染后機體淋巴細胞迅速增殖，產(chǎn)生較多的免疫球蛋白所致，此結(jié)果也與袁浩[4]實驗研究的小兒支原體肺炎急性期血清中IgA、IgM、IgG、C3、C4水平明顯高于正常對照組一致。在銀萊湯治療后IgA、IgM、IgG水平明顯下降，但仍高于正常組，說明經(jīng)銀萊湯治療后，能起到改善免疫的效果，其中銀萊湯低、中、高各劑量組水平雖不相同，但無統(tǒng)計學差異。而銀萊湯治療后小鼠IgM水平下降明顯，考慮與IgM多出現(xiàn)在感染初期，后期消失較快相關(guān)。與利巴韋林組相比，銀萊湯各治療組IgA、IgM、IgG水平明顯升高，考慮銀萊湯可以適度調(diào)節(jié)免疫球蛋白含量進而發(fā)揮其改善免疫的功效[5]。與銀萊湯中劑量組相比，小兒化食丸組、雙黃連組的IgM、IgG水平下降，但無統(tǒng)計學差異，考慮與小兒化食丸側(cè)重消積通便，作用于胃腸道，而雙黃連口服液單純具有清肺熱功效。以上結(jié)果說明銀萊湯對于食積感染引起的機體體液免疫反應有明顯調(diào)節(jié)作用，改善免疫紊亂[6]。

細胞因子主要由激活的淋巴細胞和單核細胞產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)其他類型細胞的功能，在細胞免疫反應中起重要作用，亦介導炎癥反應的發(fā)生。根據(jù)其作用主要分為抗炎因子和促炎因子。其中，IL-2參與B淋巴細胞的激活、增殖及細胞毒T細胞繁殖，表現(xiàn)為較強的免疫增強作用，同時可以誘導T細胞分泌IFN-γ、TNF-α等促炎細胞因子。而TNF-α可增強IL-2依賴的胸腺細胞、T細胞增殖能力，促進IL-2、IFN-γ等淋巴因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫應答，同時TNF-α有明顯的促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[7]。IFN-γ對單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α有刺激作用，并通過誘導細胞表達IL-2受體來促進T細胞增殖，從而進一步擴大免疫應答。IL-4能夠促進Th2淋巴細胞發(fā)育，抑制脂多糖誘導的促炎細胞因子合成，同時能增強B細胞介導的體液免疫應答。IL-10可損害抗原呈遞細胞的抗原遞呈能力，同時抑制Th1細胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ等細胞因子[8]。由此可見這五種細胞因子之間可以相互影響，保持著動態(tài)平衡，以維持機體的免疫平衡，抵抗外界病原微生物的侵入，共同發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，感染組、食積感染組與正常組相較，其IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均顯著升高，考慮為感染因素和食積復合病毒因素作用于機體后促進機體自身免疫，產(chǎn)生免疫應答來抑制病毒的復制擴散所致。與食積感染組相比，銀萊湯高、低劑量組IL-4含量升高，說明經(jīng)治療后其免疫功能得到調(diào)節(jié)，體液免疫應答能力增強，而各治療組IL-10變化，無統(tǒng)計學差異；但與正常組比較，各治療組IL-10明顯升高，考慮與取材時小鼠體內(nèi)仍存在炎癥反應，而IL-10較正常組高以發(fā)揮其抗炎作用，同時也說明了銀萊湯對于感染后引起的肺損傷有保護作用[9]。與食積感染組相比，銀萊湯低、中劑量組TNF-α水平升高，考慮可能取材時仍為小鼠感染病毒的急性期，機體損傷尚未完全恢復所致；與食積感染組比較，銀萊湯各治療組IFN-γ水平升高，而小兒化食丸組、雙黃連組、利巴韋林組的水平降低，考慮為小兒化食丸側(cè)重消積通便，作用于胃腸道；雙黃連口服液善清肺熱；利巴韋林抗病毒，而肺胃同清之銀萊湯可以促進IFN-γ的釋放，從而起到抑制病毒的作用。

綜上所述，本研究以銀萊湯對食積復合FM1病毒感染小鼠免疫功能的影響為切入點，探討復方合劑銀萊湯發(fā)揮其療效的機制。研究發(fā)現(xiàn)感染、食積復合感染因素可降低小鼠的免疫功能，刺激其發(fā)生炎癥反應，而銀萊湯可以通過促進免疫球蛋白的分泌、調(diào)控細胞因子之間的網(wǎng)絡平衡、抑制促炎性細胞因子的過度分泌、上調(diào)抗炎性細胞因子的合成來發(fā)揮其對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。通過動物實驗對銀萊湯進行療效評價，可以闡明銀萊湯的起效機制，同時也說明肺胃兩清的治療思路對于預防和治療小兒反復呼吸道感染的臨床意義，為小兒呼吸道疾病的診療提供新思路。本研究以細胞因子和免疫球蛋白作為觀測指標，日后將進一步設立上游指標以明確銀萊湯調(diào)節(jié)各種免疫球蛋白和細胞因子的機制，可作為后期研究方向。

[1]Wang ML.Production of IgA monoclonal antibodies against influenza Avirus[J].J Virol,1986,46:21-26.

[2]Page GS,Mosser AG,Hogle JM,et al.Thee-dimensional structure of poliovirus serotype I neutralizing determinants[J]. J Virol,1988,62:1781-1794.

[3]Geisberger R，Lamers M，Achaetz G. The riddle of the dual expression of lgM and IgD[J]. Immunology,2006,118(4): 429-437.

[4]袁浩.相關(guān)血清炎性因子在小兒支原體肺炎中的臨床意義[D].長沙：中南大學,2008.

[5]谷曉紅,于河. 銀萊湯對肺胃積熱證小鼠血清TNF-α和IL-2的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報,2008,31(1):54-57，76.

[6]張望,于河,劉鐵鋼,等. 銀萊湯對食積復合流感病毒感染小鼠免疫功能的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報,2014,37(8):543-547，577.

[7]胡萍,熊平源.腫瘤壞死因子在幾種呼吸系統(tǒng)疾病中的作用[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2000,13(4):312-313.

[8]Chung F. Anti-inflammatory cytokines in asthma and allergy:Interleukin-10，interlenkin-12，interferon-gamma[J].Mediatorsin-flamm,2001,10(2):51-59.

[9]李曉菲.銀萊湯對食積復合流感病毒感染小鼠免疫球蛋白及細胞因子水平影響的實驗研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學,2015.

(本文編輯： 韓虹娟)

Influences ofYinlaidecoction on serum immunoglobulin and cytokines of mice with dyspepsia combined with FM1 influenza virus infection

WANGYun-hui，LIXiao-fei，ZHENJian-hua，etal.

SchoolofBasicMedicalScience，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029,China

YUHe，E-mail:yuhe221@126.com

ObjectiveTo explore the influences ofYinlaidecoction on immune function in mice with dyspepsia combined with FM1 influenza virus infection, and to compare the efficacy ofYinlaidecoction with anti-viral Western medicine, and identify the efficacy ofYinlaidecoction and its potential mechanism. Methods 90 male mice were randomly divided into normal group, infection group, infection and dyspepsia group, high, middle and low doseYinlaidecoction groups,Shuanghuangliangroup,Xiaoerhuashiwangroup, ribavirin group. A diet-induced mice model with high fat and high protein diet were built in infection and dyspepsia group and all the treating groups to build models of dyspepsia, and the mice were then infected FM1 influenza virus by nasal inhalation in those groups. The blood was taken by removalling eyeball, to detect the level of Immunoglobulin and Cytokines by ELISA. ResultsCompared with the normal group, the levels of IgA, IgG, IgM and IL-2,IL-10,TNF-α,INF-γ were increased significantly in infection group as well as infection and dyspepsia compound group(P<0.05), but the level of IL-4 were decreased in infection and dyspepsia compound group. Compared with infection and dyspepsia compound group, the levels of IgA, IgG, IgM were decreased in all treating groups, and the low-dose ofYinlaidecoction group and ribavirin group were decreased significantly(P<0.05), the level of INF-r was increased in each dose ofYinlaidecoction group. Compared with the normal group, the levels of IgA, IgG, IgM were increased and the levels of IL-2, IL-10, TNF-α, INF-γ were increased significantly (P<0.05) in each dose ofYinlaidecoction group. Comparing withYinlaidecoction group, the levels of IgA, IgG, IgM betweenShuanghuangliangroup andXiaoerhuashiWangroup had no significant difference. And the level of IL-4, IL-10, TNF-α of treating groups had no significant difference. ConclusionYinlaidecoction can adjust immune functions in mice by balancing the secretion of immunoglobulins and cytokines, and then achieve antiviral efficacy.

YinlaiDecoction；Dyspepsia；FM1 influenza virus；Immunoglobulin；Cytokines

國家自然科學基金(81373769)；高等學校博士學科點專項科研基金(20120013120006)；北京中醫(yī)藥大學師承博士后項目(1000062620141)

100029北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 [王云輝(碩士研究生)、甄建華、于河、劉鐵鋼、谷曉紅]；平原縣第一人民醫(yī)院兒科(李曉菲)

王云輝(1990- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：運用溫病學辨治思路指導臨床相關(guān)熱證的研究。E-mail：wangyunhui152@163.com

于河(1979- )，女，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：運用溫病學辨治思路指導臨床相關(guān)熱證的研究。E-mail：yuhe221@126.com

R254.23

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.005

2016-04-18)