二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立

谷　捷，李　鑫，余黃合，，王寶新，黃惠勇，曾　嶸*，蔡　雄，3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

·基礎(chǔ)研究·

二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立

谷捷1，李鑫1，余黃合1，2，王寶新1，黃惠勇1，曾嶸2*，蔡雄1，3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的通過(guò)對(duì)二甲苯的用量和保留時(shí)間進(jìn)行研究，優(yōu)選二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的最佳成模條件。方法二甲苯涂抹昆明系小鼠右耳廓上下兩面，誘導(dǎo)建立急性耳腫脹，對(duì)二甲苯劑量（20、30、40μL）和保留時(shí)間（30、45、60、75、90 min）進(jìn)行優(yōu)選，并采用陽(yáng)性藥對(duì)優(yōu)選建立的小鼠耳腫脹急性炎癥模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果二甲苯用量對(duì)鼠耳腫脹率影響不明顯（P＞0.05）；但隨保留時(shí)間延長(zhǎng)，耳腫脹度呈下降趨勢(shì)，且90 min組與30 min組比較有顯著性差異（P=0.045）。與模型組比較，經(jīng)吲哚美辛治療后，耳腫脹度顯著降低（P=0.007），TNF-α含量亦明顯下降（P＜0.001）。結(jié)論二甲苯用量20μL，保留時(shí)間30 min，可成功建立最佳的小鼠耳腫脹急性炎癥模型。

二甲苯；耳腫脹急性炎癥；致炎劑用量；保留時(shí)間

〔Abstract〕Objective To investigate the optimal dosage and retention time of dimethylbenzene for the induction of a mouse ear edema.M ethods Dimethylbenzene was applied evenly on the surface of both sides of the auricle of mice to induce acute inflammation.Different dosages（20，30，40μL）and retention time（30，45，60，75，90 min）of dimethylbenzene were compared to optimize these main variables for the induction of ear edema in mice.For verifing the model parameters a positive drug was performed.Results Increase in the dosage of dimethylbenzene resulted in no significant increase in the ear edema（P＞0.05）；while the ear edema rate was decreased with the retention time prolonged，and marked reduction in the rate of ear edema was attained between 30 and 90 min.Compared with the vehicle-control mice，the ear edema rate（P=0.007）and serum values of TNF-α（P＜0.001）decreased significantly in mice treated with indomethacin.Conclusion The optimal mouse model of ear edema is induced by applying 20μL dimethylbenzene with 30 min retention.

〔Keywords〕dimethylbenzene；acute inflammation of ear edema；dosage；retention time.

炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因子引起損傷所產(chǎn)生的以防御反應(yīng)為主的病理過(guò)程［1］，局部表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙等。炎癥見(jiàn)于多種疾病的病理過(guò)程，前期多以急性炎癥為主，遷延不愈則轉(zhuǎn)為慢性炎癥，嚴(yán)重影響疾病預(yù)后和患者生活質(zhì)量［2］。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的抗炎藥物臨床價(jià)值巨大，而藥物的研發(fā)多以選擇病變程度適中、容易復(fù)制、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)的疾病動(dòng)物模型，全面、客觀(guān)地評(píng)價(jià)藥效作用為前提。

二甲苯是常用的化學(xué)致炎劑，可誘導(dǎo)組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質(zhì)釋放，進(jìn)而引起局部毛細(xì)血管通透性的增加、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、急性滲出性炎性水腫等［3］。中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)中，常以二甲苯誘發(fā)小鼠耳殼急性腫脹，模擬機(jī)體急性炎癥的病理狀態(tài)，以評(píng)價(jià)藥物抗炎作用，然而由于二甲苯涂抹劑量和保留時(shí)間缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［4-7］，導(dǎo)致模型誘導(dǎo)的成功率低，且穩(wěn)定性差，從而限制了模型在抗炎中藥新藥研究中的應(yīng)用?；诖?，本研究對(duì)二甲苯涂抹劑量和保留時(shí)間等模型誘導(dǎo)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了比較研究，以期建立成功率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于復(fù)制的小鼠耳腫脹急性炎癥模型，為中藥新藥研究的抗炎作用評(píng)價(jià)提供科學(xué)、可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：43004700007921。

1.2試劑及儀器

二甲苯（批號(hào)：20140108，天津恒興試劑有限公司）；吲哚美辛（批號(hào)：A14070，山西云鵬制藥有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）單抗由長(zhǎng)沙維爾生物科技科技有限公司提供；打孔器、移液槍、灌胃器。

1.3二甲苯涂耳劑量的優(yōu)選

取昆明小鼠30只，分層隨機(jī)化分為3組，每組10只，分別精密吸取均勻二甲苯涂布于各鼠右耳上、下兩面，劑量分別為20、30、40μL，左耳不涂作對(duì)照。于涂耳30 min后，處死小鼠，沿耳廓基線(xiàn)剪下兩耳，采用6 mm直徑打孔器于左右耳對(duì)稱(chēng)部位打下耳片，用精密電子天平稱(chēng)取各鼠耳質(zhì)量，并計(jì)算鼠耳腫脹率［腫脹率=（右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/左耳質(zhì)量×100%］。

1.4涂耳保留時(shí)間的優(yōu)選

取昆明小鼠50只，分層隨機(jī)化分為5組，每組10只，分別吸取“1.3”實(shí)驗(yàn)確定的最佳劑量二甲苯均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對(duì)照。分別于涂布后30、45、60、75、90 min，處死小鼠，余下操作同“1.3”處理。

1.5模型驗(yàn)證

取昆明小鼠60只，分層隨機(jī)化分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥物（吲哚美辛）組3組，每組20只。吲哚美辛組給予吲哚美辛藥液一次性灌胃，給藥劑量（10 mg/kg），空白組、模型組給等容積蒸餾水。給藥1 h后，吸取20 uL的二甲苯均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對(duì)照。涂布30 min后，每組取10小鼠處死，余下操作同“1.3”處理。每組另10只行摘眼球取血，將血放入4℃，3 500 r/min環(huán)境離心，15 min后取血清檢測(cè)TNF-α。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1二甲苯涂耳劑量的優(yōu)選結(jié)果

小鼠耳腫脹率隨著二甲苯用量的增加（20、30、40μL）呈上升趨勢(shì)，但三組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜合考慮小鼠耳廓的覆蓋能力及二甲苯的毒性，我們確定最佳涂耳劑量為20μL。見(jiàn)圖1。

圖1　二甲苯涂耳劑量的優(yōu)選（±s，n=10）

2.2二甲苯涂耳保留時(shí)間的優(yōu)選結(jié)果

隨著涂耳保留時(shí)間的推移，各組鼠耳的腫脹率呈下降趨勢(shì)，其中30 min組的腫脹率與90 min組比較差異有顯著性（P=0.045）。因此，選擇最佳時(shí)間為30 min。見(jiàn)圖2。

圖2　二甲苯涂耳保留時(shí)間的優(yōu)選（±s，n=10）。

2.3二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型條件的驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，吲哚美辛組小鼠耳腫脹率顯著降低（P=0.007），血清中TNF-α含量亦明顯減少（P＜0.001）。見(jiàn)圖3-5。

圖3　二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的評(píng)價(jià)（±s，n=10）

圖4　不同組中血清TNF-α濃度（±s，n=10）

圖5　模型組和吲哚美辛組自身左右耳對(duì)比圖

3　討論

炎癥動(dòng)物模型的成功構(gòu)建是影響中藥抗炎創(chuàng)新藥物研究的重要因素之一。急性炎癥模型常以二甲苯、TPA、花生四烯酸等物質(zhì)作為致炎劑［8-13］，而二甲苯由于致炎機(jī)制與臨床常見(jiàn)急性炎癥相似、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備、見(jiàn)效快、復(fù)制成功率高且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于中藥抗炎創(chuàng)新藥物的抗炎效應(yīng)評(píng)價(jià)和抗炎活性目標(biāo)化合物的篩選等［13-15］，也常被藥理學(xué)等課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)所選用。然而，查閱相關(guān)研究文獻(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)決定二甲苯致小鼠耳急性腫脹模型成功構(gòu)建的關(guān)鍵因素——二甲苯涂抹劑量和保留時(shí)間缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［4-7］，涂抹劑量和保留時(shí)間的不規(guī)范，不但影響了該模型的成功構(gòu)建，而且影響了中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)。

研究團(tuán)隊(duì)在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)二甲苯涂抹用量為20μL時(shí)即可完全覆蓋鼠耳上、下兩面，而超過(guò)20μL，由于“虹吸效應(yīng)”二甲苯滲透到小鼠背部及眼周，引起小鼠的極度不適，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)成功。且二甲苯涂抹用量在20～40μL時(shí)，鼠耳腫脹率隨著涂抹劑量增加成上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。綜合上述因素，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，二甲苯涂抹劑量以20μL為宜。二甲苯引起的耳腫脹急性炎癥模型可能主要引起組胺、緩激肽等炎癥介質(zhì)的釋放，引起局部血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，造成耳部急性滲出性炎癥水腫，具有自愈性、自橫性的特點(diǎn)［16-18］，因此二甲苯涂耳保留時(shí)間亦需要進(jìn)行考察。結(jié)果表明，隨著二甲苯保留時(shí)間的延長(zhǎng)，鼠耳腫脹呈下降趨勢(shì)。因此，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為保留時(shí)間30 min為佳。

吲哚美辛是一種常用有效的非甾體抗炎藥，TNF-α作為一種促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在炎癥的初始階段中起核心作用，是啟動(dòng)炎癥的重要細(xì)胞因子［19-22］?；谒Y選的二甲苯涂抹劑量20μL、保留時(shí)間30 min，采用吲哚美辛進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，選擇TNF-α作為炎癥反應(yīng)的指標(biāo)。研究顯示，吲哚美辛組鼠耳腫脹率明顯低于模型組（P=0.007），TNF-α含量亦顯著降低（P＜0.001）。提示，經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選的實(shí)驗(yàn)參數(shù)二甲苯為致炎劑，精密吸取20μL，均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，保留時(shí)間為30 min可以成功構(gòu)建小鼠耳腫脹急性炎癥模型。

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（本文編輯 匡靜之）

Establishment of Acute Inflammation M ice M odels w ith Ear Edema Induced by Dimethylbenzene

GU Jie1，LI Xin1，YU Huanghe1，2，WANG Baoxin1，HUANG HuiYong1，ZENG Rong2*，CAI Xiong1，3*
（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine，2.School of Pharmacy，3.Hunan Department of Education's Key Laboratory of Translational Chinese Medicine，Hunan University Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R285.5；R76

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.008

2015-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373540）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（201308）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12A107）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2014-8）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（2014202）。

谷捷，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥抗炎免疫藥理研究。

*蔡雄，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：caix12@qq.com；曾嶸，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：472719275@qq.com。