雷公藤甲素對人肝癌細胞株HepG2增殖的抑制作用*

楊　樂

(南陽醫(yī)學高等?？茖W?；A部，河南 南陽 473000)

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·實驗研究·

雷公藤甲素對人肝癌細胞株HepG2增殖的抑制作用*

楊樂

(南陽醫(yī)學高等?？茖W?；A部，河南 南陽 473000)

目的：研究雷公藤甲素體外抑制人肝癌HepG2細胞增殖的情況,并初步探討其機制。方法：雷公藤甲素干預人肝癌HepG2細胞后, 以CCK-8法檢測細胞的增殖抑制，DAPI染色檢測細胞凋亡形態(tài)，Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western blot檢測AKT信號通路和pro-Caspase3蛋白的表達。結果：雷公藤甲素可抑制HepG2細胞增殖，4 mg/L 作用24 h 后，細胞抑制率可達( 53±2.8)%；Hela細胞有明顯的凋亡形態(tài)出現(xiàn)，凋亡率提高；磷酸化蛋白AKT、 pro-Caspase3表達均降低。結論: 雷公藤甲素可在體外抑制人肝癌HepG2細胞生長，可能與抑制HepG2細胞中AKT通路的激活及活化凋亡蛋白Caspase 3有關。

雷公藤甲素；肝癌；凋亡；HepG2

原發(fā)性肝癌是人體最常見的惡性腫瘤之一，目前手術和放、化療等療效均不顯著，且術后復發(fā)率較高；因此有必要尋找新的治療方法[1-2]。雷公藤甲素 (triptilide, TP) 是雷公藤的主要有效成分之一,具有很強的抗感染和免疫抑制等多種藥理作用。多項研究表明：雷公藤甲素在體外能顯著抑制不同腫瘤細胞增殖[3]，但其對人肝癌HepG2細胞的作用目前國內(nèi)外鮮有文獻報道。本研究以人肝癌HepG2細胞為研究對象，通過雷公藤甲素在體外對其進行干預，觀察對HepG2細胞的增值影響，并初步探討其作用機制,以期為肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1瘤株

人肝癌HepG2細胞株購自美國標準菌種收藏所(ATCC)，液氮罐保存。所用細胞培養(yǎng)液為含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 在37 ℃、CO2體積分數(shù)為50 mL/L 的條件下培養(yǎng)。

1.2藥品、試劑與儀器

雷公藤甲素純品購自中國藥品生物制品檢定所，批號20131011，實驗前以二甲基亞砜(DMSO)溶解后以生理鹽水配制成質(zhì)量分數(shù)4 g/L的溶液，使用前新鮮配制。CCK-8試劑盒(批號20131203)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號20130514),購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；熒光染料DAPI(批號20130122購自Sigma公司)；p-AKT(批號20130209)、t-AKT(批號20130510)、pro-Caspase3(批號20121227)抗體，購自Santa Cruz Biotechnology。

1.3檢測指標

1.3.1細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103個/孔，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，加入質(zhì)量分數(shù)為 0，1，2，4 mg/L的雷公藤甲素溶液，培養(yǎng) 24 h后 ,加入 10 μL/孔 CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng) 1.5 h，于酶標儀讀取 A450值。細胞增殖抑制率(%) =(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%

1.3.2HepG2細胞形態(tài)觀察

藥物干預細胞24 h后，棄培養(yǎng)液；40 g/L 多聚甲醛室溫固定10 min；PBS洗滌2次； DAPI染色液室溫染色10 min，棄去染液；PBS洗滌2次；在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化。

1.3.3HepG2細胞凋亡情況

以 Annexin V-FITC染色分析細胞凋亡情況。 將HepG2細胞按每孔5×105個接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，待細胞生長至對數(shù)生長期時，分別加入4 mg/L雷公藤甲素溶液，空白對照組只加入等體積的無血清 DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；以質(zhì)量分數(shù)為2.5 g/L 胰酶消化、收集細胞，PBS 洗滌1次，按Annexin V-FITC染色試劑盒操作說明染色后，使用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。

1.3.4Western blot檢測蛋白相關信號通路蛋白的表達水平

雷公藤甲素作用HepG2細胞24 h后收集細胞,提取總蛋白，定量，分裝備用。按Western blot常規(guī)操作,用 Image J軟件測定各組蛋白的灰度值，除以內(nèi)參蛋白actin的灰度值，所得結果為各蛋白的相對值。

1.4統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 13.0軟件行完全隨機設計的單因素方差分析 (ANOVA)。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1雷公藤甲素對HepG2細胞的增殖抑制作用

雷公藤甲素對HepG2細胞的增殖抑制作用呈量效關系，其中1，2，4 mg/L的細胞抑制率分別為(20±3.1)%、 (47±2.8)%和(54±2.5)%。

2.2雷公藤甲素對HepG2細胞形態(tài)的影響

雷公藤甲素作用肝癌HepG2細胞后，DAPI 染色顯示凋亡比率高于對照組細胞，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

A.空白對照組；B.4 mg/L雷公藤甲素組

2.3雷公藤甲素對HepG2細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，HepG2細胞經(jīng)過4 mg/L 雷公藤甲素作用 24 h 后，早期凋亡率為 (10.86±0.31) %，與空白對照組早期凋亡率(3.26±0.47) %對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

A.空白對照組;B.4 mg/L雷公藤甲素組

2.4雷公藤甲素對HepG2細胞AKT、pro-caspase3蛋白表達的影響

見圖3。Western Blot結果顯示, 在雷公藤甲素作用24 h后,與空白對照組對比，肝癌HepG2細胞p-AKT表達降低，且出現(xiàn)Caspase 3的活化,Actin作為內(nèi)參物。

圖3　質(zhì)量分數(shù)0，1，2，4 mg/L的雷公藤甲素對HepG2

3　討　論

自從 Kupchan 等[4]首次發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素的抗腫瘤活性以來，人們對雷公藤甲素治療癌癥的功效作了大量的研究。本研究以人肝癌HepG2細胞為靶細胞，通過CCK-8法檢測了雷公藤甲素對其的增殖抑制，以熒光染色結合流式細胞術對腫瘤細胞的形態(tài)和凋亡率進行了觀察，并通過Western Blot對AKT和Pro-caspase3蛋白的表達進行了檢測,結果顯示:雷公藤甲素可明顯抑制人肝癌HepG2細胞的生長，并可導致其發(fā)生凋亡，呈量效關系。此可能與雷公藤甲素抑制HepG2細胞中AKT通路的激活、活化凋亡蛋白Caspase 3有關。

[1]Ferrarezi DA, Cheurfa N, Reis AF, et al.Adiponectin gene and cardiovascular risk in type 2 diabetic patients: a review of evidences[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2007,51(2):153-159.

[2]Halleux CM, Takahashi M, Delporte ML, et al.Secretion of adiponectin and regulation of apM1 gene expression in human visceral adipose tissue[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,288(5):1102-1107.

[3]Tengchaisri T, Chawengkirttikul R, Rachaphaew N, et al.Antitumor activity of triptolide against cholangiocarcinoma growth in vitro and in hamsters[J].Cancer Lett,1998,133(2):169-175.

[4]Kupchan SM, Court WA, Dailey RJ, et al.Triptolide and tripdiolide, novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii[J].J Am Chem Soc,1972,94(20):7194-7195.

(編輯陶珠)

1001-6910(2016)02-0071-02

R735.7

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.33

南陽市科技攻關項目(2013GG058)

2015-06-25；

2015-12-01