川芎嗪對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸組織caspase-3的表達及ABR閾值的影響

楊政道，張繼方，侯豪華，王張敏，倪月秋

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級2班，遼寧沈陽110034；2.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級1班；3.醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)2013級1班；4.生理學(xué)教研室）

川芎嗪對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸組織caspase-3的表達及ABR閾值的影響

楊政道1，張繼方1，侯豪華2，王張敏3，倪月秋4*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級2班，遼寧沈陽110034；2.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級1班；3.醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)2013級1班；4.生理學(xué)教研室）

目的：研究川芎嗪（TMP）對慶大霉素（GM）耳中毒豚鼠耳蝸組織caspase-3的表達以及ABR閾值的影響。方法：將健康白色紅目豚鼠80只隨機分為對照組、GM組、GM+TMP組和TMP組，各組均連續(xù)用藥10 d，每日測量體重調(diào)整藥量。在給藥前和給藥10 d后分別檢測ABR閾值，停藥處死后應(yīng)用SABC免疫組化技術(shù)檢測各組豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細胞以及血管紋caspase-3的表達。結(jié)果：（1）GM組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、血管紋處和毛細胞平均灰度值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GM+TMP組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和毛細胞的平均灰度值與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而血管紋細胞的平均灰度值與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時GM+TMP組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細胞、血管紋的平均灰度值與GM組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（2）各組用藥前ABR閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥10 d后，GM組的ABR閾值明顯高于對照組（P＜0.05）；TMP+GM組ABR閾值較GM組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：TMP可能通過阻斷慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸組織中caspase-3的表達從而參與阻止GM對耳蝸損傷的過程，實現(xiàn)對GM性耳聾的保護作用。

川芎嗪；慶大霉素；耳毒性；耳蝸；caspase-3；免疫組化；ABR閾值

［Abstract］Objective：To investigate the effects of Ligustrazine（TMP）on the expression of caspase-3 and ABR threshold in guinea pig cochlea after gentamicin（GM）ototoxicity.Methods：A total of 80 guinea pigs were randomly divided into saline group，GM group，GM+TMP group and TMP group.The duration of treatment was lasted 10 d continuously in all groups.The dose was decided by their weight.The ABR threshold were measured before and after administration of 10 d.SABC immunohistochemical method was used to detect the expression of caspase-3 in the spiral ganglion，cochlea hair cells，and stria vascularis of guinea pigs. Results：（1）The average gray value in the spiral ganglion cells，stria vascularis and hair cells in GM group had significant difference with those in the same position of control group（P＜0.05）.The average gray value in the spiral ganglion cells and hair cells in GM+TMP group had no difference with those in the same position of control group（P＞0.05），but in stria vascularis（P＜0.05）.Meanwhile the average gray value in spiral ganglion，hair cells，stria vascularis in TMP+GM group had significant difference with those in GM group（P＜0.05）.（2）The ABR threshold had no significant differences before treatment（P＞0.05）. After administration of 10 d，the ABR threshold of GM group was significantly changed（P＜0.05）.The ABR thresholds in GM group was significantly higher than that in control group（P＜0.05）.The ABR threshold in TMP+GM group was lower than that in GM group（P＜0.05）.Conclusion：TMP participates in preventing the process of cochlea injury caused by GM，through blocking the expression of caspase-3 in cochlea tissue of GM ototoxicosis probably，which achieve the protection of GM deafness eventually.

［Key words］Ligustrazine；gentamicin；ototoxicity；cochlea；caspase-3；immunohistochemistry；ABR threshold

慶大霉素（GM）是一種廣譜、高效且廉價的抗生素，在臨床中尤其是作為治療由革蘭陰性菌導(dǎo)致的嚴重感染的首選藥仍然占據(jù)著不可替代的位置［1］，但其所具有的耳毒性早已被人認知［2］，其損傷耳蝸的病理改變主要表現(xiàn)為毛細胞的損傷與缺失［3］。有研究表明：GM引起毛細胞線粒體的破壞，進而激活經(jīng)典的caspase凋亡通路［4］。且caspase-3蛋白表達的增高與GM耳中毒后聽力閾值的下降有相關(guān)性［5］。川芎嗪（Ligustrazine，tetramethylpyrazine，TMP），化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，是從具有“血中氣藥”之稱的中藥川芎中提取出的有效單體，屬酰胺類生物堿，有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善微循環(huán)和腦血流的作用，用于閉塞性血管疾病、腦血栓形成、脈管炎、心絞痛等的治療［6］。現(xiàn)已知道它可以降低GM的耳毒性［7］，但TMP是否是通過影響GM中毒豚鼠耳蝸caspase-3的表達，從而拮抗GM的耳蝸毒性，尚未見報道。本實驗應(yīng)用SABC免疫組化技術(shù)及圖像分析技術(shù)并結(jié)合ABR測試，觀察TMP對GM中毒豚鼠耳蝸caspase-3表達和ABR閾值的影響，探討TMP對GM耳毒性損傷的保護作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組及耳毒模型的復(fù)制耳廓反射靈敏的健康白色紅目豚鼠80只（遼寧省長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001），體重200～250 g，雌雄不拘，隨機分成對照組、GM組、GM+TMP混合組和TMP組，每組20只。對照組：每日腹腔注射生理鹽水2.5 ml/kg（辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H37022337）；GM組：每日腹腔注射硫酸GM注射液100 mg/kg（新鄉(xiāng)東升制藥有限公司，國藥準字：H41020249）；GM+TMP混合組：每日右側(cè)腹腔注射硫酸GM注射液100 mg/kg，同時左側(cè)腹腔注射TMP注射液100 mg/kg；TMP組：每日腹腔注射TMP注射液100 mg/kg（上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，國藥準字：H20054485）。各組均連續(xù)用藥10 d。各組動物混合飼養(yǎng)，每日測量體重調(diào)整藥量。

1.2ABR閾值檢測在用藥前和用藥10 d后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，利用Intelligent Hearing Systems發(fā)出主頻率為2 kHz的濾波click聲刺激信號，濾波帶寬50～3 000 Hz，間隔時間90 ms，掃描時間20 ms，耳機插入豚鼠外耳道，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對側(cè)耳后乳突部皮下，以Intelligent Hearing Systems（Miami，F(xiàn)L33143）進行疊加1 024次，輸出信號，觀察時程為20 ms，測試強度由80 dB nHL開始，按10 dB遞減，接近閾值后按5 dB逐檔遞減，聽閾判定以剛出現(xiàn)ABR的P3波為準。

1.3耳蝸冰凍切片的制備各組豚鼠在行第2次ABR檢測后，快速斷頭，迅速取出聽泡。打開聽泡后，充分暴露耳蝸，在解剖顯微鏡下刺破圓窗膜，將鐙骨底脫位暴露卵圓窗，在蝸頂鉆一小孔，用微量注射器緩慢注入含40 g/L多聚甲醛的磷酸緩沖液，再將標本置于上述固定液中4℃下1 d。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，放入100 g/L EDTA脫鈣液中脫鈣20 d，再移入250 g/L蔗糖磷酸緩沖液中，4℃過夜。次日用OCT包埋，行10 μm恒冷冰凍切片。方法同文獻［8］。

1.4免疫組織化學(xué)方法檢測caspase-3的表達免疫組織化學(xué)方法檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。切片干燥后，為了減少操作時組織脫片，用冷丙酮浸泡20 min，用0.01 mol/L的PBS（pH=7.2～7.6）洗3次，每次3 min（下同）。將切片放入用甲醇稀釋的5 g/L H2O2中室溫下浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L的PBS洗3次。將切片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中（pH=6.0）于高壓鍋內(nèi)抗原修復(fù)。自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次。滴加5%BSA封閉液，室溫下孵育20 min，甩去多余的液體，然后滴加稀釋度為1∶200的一抗，4℃過夜。次日，用0.01 mol/L的PBS洗3次，滴加二抗，37℃孵育20 min，0.01 mol/L的PBS洗3次，DAB染色，在顯微鏡下觀察并控制染色時間，并在同一時間用PBS沖洗，終止各組染色。用梯度酒精脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。陰性對照組，用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其他步驟不變。采用JeDa形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每組隨機抽取20張切片，在同等條件下測量各組每張切片螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、毛細胞以及血管紋caspase-3陽性反應(yīng)產(chǎn)物灰度值，分別計算各組陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均灰度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，顯著性檢驗采用t檢驗及相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1TMP干預(yù)GM耳中毒后耳蝸ABR閾值變化的測定結(jié)果各組給藥前ABR閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥10 d后，GM組ABR閾值較給藥前發(fā)生顯著變化（P＜0.05）；且給藥后的GM組ABR閾值明顯高于對照組（P＜0.05）。GM+TMP組ABR閾值雖然在給藥后也有所增高，但相對于對照組和TMP組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而較GM組明顯降低（P＜0.05）；TMP組和對照組ABR閾值在給藥后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組豚鼠用藥前后的ABR閾值比較（±s）

表1　各組豚鼠用藥前后的ABR閾值比較（±s）

注：與用藥前比較，1）P＜0.05；與對照組比較，2）P＜0.05；與GM組比較，3）P＜0.05

用藥10 d后6.15±3.14 13.25±8.931）2）7.19±4.613）7.07±1.48組別對照組GM組GM+TMP組TMP組n 20 20 20 20 ABR閾值（dB nHL）用藥前6.40±3.48 7.25±3.80 6.34±3.12 7.14±2.59

2.2Caspase-3免疫組化檢測

2.2.1光鏡下觀察結(jié)果耳蝸各部分caspase-3陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈深黃色顆粒，彌漫分布于螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細胞和血管紋中。GM組的caspase-3陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物明顯強于GM+TMP組和對照組，即染色明顯加深，呈強陽性，尤其是耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的陽性反應(yīng)顆粒更加明顯，見圖1～圖3。

2.2.2顯微圖像分析GM組在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、血管紋、毛細胞處有陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達，平均灰度值與對照組相同部位比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GM+TMP組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和毛細胞的平均灰度值與對照組相同部位比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而血管紋細胞則與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時GM+TMP組的螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細胞、血管紋與GM組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TMP組與對照組各部位平均灰度值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

圖1　免疫組化法檢測耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)caspase-3的表達（×100）

圖2　免疫組化法檢測耳蝸毛細胞caspase-3的表達（×100）

圖3　免疫組化法檢測耳蝸血管紋caspase-3的表達（×100）

表2　豚鼠耳蝸caspase-3的平均灰度值比較（±s）

表2　豚鼠耳蝸caspase-3的平均灰度值比較（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與GM組比較，2）P＜0.05

組別對照組GM組GM+TMP組TMP組n 20 20 20 20螺旋神經(jīng)節(jié)細胞172.387±13.922 125.169±11.6361）153.654±10.5832）170.883±10.342毛細胞194.227±6.290 169.898±7.5781）187.949±3.0682）195.114±7.235血管紋168.583±4.000 102.725±8.8951）146.643±16.0371）2）165.153±5.224

3　討論

GM耳毒性表現(xiàn)為感音神經(jīng)性耳聾［9］。有研究表明，GM通過引起耳蝸細胞的凋亡而導(dǎo)致耳蝸損傷［7］，其中包括耳蝸毛細胞［10］、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞［11］以及血管紋組織細胞的凋亡損傷。

凋亡是損傷的一種共同的結(jié)局，而細胞凋亡的發(fā)生與caspase家族成員的活化有直接關(guān)系。凋亡的發(fā)生是一系列caspase家族成員共同參與完成的［12］。其中caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關(guān)鍵酶，處于核心地位［13］，并為凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［5］?；罨腸aspase-3在凋亡細胞中存在［14］，其陽性表達為細胞凋亡的主要標志。已有研究表明，GM耳中毒的耳蝸中有caspase-3的表達，且caspase-3蛋白表達增高與GM耳中毒后聽力閾值的下降呈正相關(guān)［5］。

TMP現(xiàn)臨床廣泛用于治療兼有血瘀癥候的疾病，具有擴張血管、抑制血小板激活聚集，并改善血管血流變學(xué)等［6］。現(xiàn)已知道它可以降低GM的耳毒性［7］，但目前，其具體機制尚不清楚。

本研究通過設(shè)立GM組、TMP組、GM+TMP組及對照組，分別測試給藥前后各組的ABR閾值，并進行caspase-3的免疫組化染色，來觀察各組耳蝸相應(yīng)部位caspase-3的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組用藥前ABR閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給藥10 d后，GM組的ABR閾值明顯高于對照組（P＜0.05）；TMP+GM組的ABR閾值較GM組降低（P＜0.05）。說明TMP可顯著降低GM耳毒性。在caspase-3免疫組化染色結(jié)果中，GM組各部位的平均灰度值與對照組的相同部位比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GM+TMP組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和毛細胞的平均灰度值與對照組的相同部位比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而血管紋細胞則與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時GM+TMP組的螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細胞、血管紋平均灰度值與GM組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此TMP能明顯抑制GM引起的耳蝸內(nèi)組織caspase-3的表達，尤其是螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，次為血管紋和毛細胞。

有研究表明GM對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（SGCs）具有直接作用，其通過破壞SGCs氧化與抗氧化體系的平衡，導(dǎo)致線粒體損傷，并通過凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3的活化，從而觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)［11］。同時，對于毛細胞來說，在caspase-3水平上阻斷細胞凋亡通路可以有效保護毛細胞［15］。在本實驗GM+TMP組中，所出現(xiàn)的caspase-3減少的情況表明TMP抑制了caspase-3的表達，同時該組ABR閾值結(jié)果提示TMP顯著降低GM耳毒性。因此我們推測：TMP可能通過阻斷慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸組織中caspase-3的表達從而參與阻止GM對耳蝸損傷的過程，實現(xiàn)對GM性耳聾的保護作用。

［1］簡心韻，鄧子新，孫宇輝.氨基糖苷抗生素慶大霉素：基礎(chǔ)研究的新進展及應(yīng)用研究的新潛力［J］.生物工程學(xué)報，2015，31（6）：829-844.

［2］Schatz A，Buqie E，Waksman SA.Streptomycin，a subsatance exhibiting antibiotic activity against gram-positive and gramnegative bacteria.1944［J］.Clin Orthop Relat Res，2005，（437）：3-6.

［3］Zhang D，F(xiàn)an Z，Han Y，et al.Apoptosis-inducing factor is involved in gentamicin-induced vestibular hair cell death［J］. ORL J Otorhinlaryngol Relat Spec，2012，74（1）：1-5.

［4］蔡琴芳，蔣立新.豚鼠耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法的改良與觀察［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2010，18（3）：282-283.

［5］陳浩，謝民強，吳劍，等.鹽酸椒苯酮胺通過降低caspase-3表達減輕慶大霉素豚鼠耳蝸損傷［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，34（3）：329-334.

［6］宋飛.近十年來國內(nèi)對川芎嗪臨床應(yīng)用的研究進展［J］.海峽藥學(xué)，2014，26（10）：1-3.

［7］李慧.川穹嗪對慶大霉素耳腎毒性保護作用的研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2011.

［8］溫利民.川芎嗪對藥物耳毒性聾耳蝸毛細胞損傷修復(fù)的作用機制研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2008.

［9］Gooi A，Hochman J，Wellman M，et al.Ototxic effects of singledose verse 19-day daily-dose gentamicin［J］.J Otolaryngologyhead Neck surg，2008，37（5）：664-667.

［10］陳浩.鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素豚鼠耳蝸損傷保護作用及機制［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［11］顧晰，林昶，張榕.慶大霉素對小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷機制初步研究［J］.中華耳科學(xué)雜志，2009，7（3）：256-260.

［12］郭瑩.HSP70、P38MAPK、Caspase3與胎盤細胞凋亡在妊娠期高血壓疾病中的作用［D］.鄭州：鄭州大學(xué)，2011.

［13］Broughtton BR，Reutens DC，Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40（5）：e331-e339.

［14］Parvathy S，Rajadas J，Ryan H，et al.Abeta peptide conformation determines uptake and interleukin-1 alpha expression by primary microglial cells［J］.Neurobiol Aging，2009，30（11）：1792-1804.

［15］閆輝.miRNA-182對成年大鼠藥物性聾損傷的保護及機制［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

Effect of Ligustrazine on the Expression of Caspase-3 and ABR Threshold in Guinea Pig Cochlea after Gentamicin Ototoxicity

YANG Zhengdao1，ZHANG Jifang1，HOU Haohua2，WANG Zhangmin3，NI Yueqiu4*
（1.Grade 2011 Class 2，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 2011 Class 1；3.Grade 2013 Class 1；4.Department of Physiology）

R735.37

A

1008-2344（2016）05-0403-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.026

2016-04-21

（文敏 編輯）

國家自然基金項目（No.81273809）；沈陽醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研項目（No.20141021）

倪月秋（1963—），女（漢），教授，博士.研究方向：藥物中毒性耳聾作用機制的研究.E-mail：niyueqiu@163.com